Informe Analitica 3 Lans

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Encabezamiento
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Marginales
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Pie de página
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1 una pulgada + \hoffset 2 una pulgada + \voffset

3 \oddsidemargin = 17pt 4 \topmargin = 20pt
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Pie de página
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1 una pulgada + \hoffset 2 una pulgada + \voffset

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METODOS INSTRUMENTALES DE
ANÁLISIS
Edineldo Lans Ceballos. M.Sc
Octubre 16 del 2013

2
Contenido
1 CROMATOGRAFÍA 1
1.1 Clasificación de los métodos cromatográficos . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.1 Cromatografı́a en columna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.2 Cromatografı́a plana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Clasificación de los métodos cromatográficos en columna . . . . . . . . . . 2
1.2.1 Cromatografı́a de Gases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.2 Cromatografı́a lı́quida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.3 Cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3 Algunos términos y ecuaciones utilizados en cromatografı́a . . . . . . . . . 3
1.4 Velocidades de separación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.5 Tiempo de retención Vs coeficiente de partición . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.6 Relación entre el tiempo de retención y la constantes de distribución . . . . 7
1.7 Asimetrı́a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.8 Tipos de fuerzas que están presentes en un sistema cromatográfico . . . . . 8
1.8.1 Interacciones iónicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.8.2 Fuerzas de enalce de hidrógeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.8.3 Fuerzas de repulsión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.8.4 Fuerzas de Van Der Walls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.9 Bases fı́sicas de la cromatografı́a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.9.1 Eficiencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.9.2 Numero de plato teórico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.9.3 Resolución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.9.4 Difusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.9.5 Ecuación de Van Deemter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.10 Ejercicios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 20

2.1 Ventajas de la cromatografı́a en capa fina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2 Adsorbentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
i
ii
2.2.1 Proceso de adsorción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.2.2 Adsorbentes utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3 Preparación de placas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.4 Aplicación de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.5 Elección del eluyente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.6 Desarrollo de la cromatografı́a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.7 Evaluación de un cromatograma de capa fina . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.7.1 Análisis cualitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.7.2 Análisis cuantitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.8 Localización de sustancias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.8.1 Métodos quı́micos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.8.2 Métodos fı́sicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.9 Constante Rf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3 CROMATOGRAFIA DE GAS 26
3.1 Cromatografı́ gas lı́quido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.2 Fase móvil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.3 Columnas tubulares abiertas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.3.1 WCOT :wall coated tubular column . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.3.2 SCOT: support coated open tubular column. . . . . . . . . . . . . . 27
3.3.3 PLOT: porous layer open tubular column . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.4 Ventajas de las open tubular column . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.5 Clases de fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.6 Escogencia de la fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.7 Columnas empacadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.8 Indice de retención . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.9 Programación de temperatura y presión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.10 Carrier gas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.11 Inyección de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.11.1 Inyeción split . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.11.2 Inyección splitless . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.11.3 Inyección on column . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.12 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.12.1 Claseses de detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.13 Preparación de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.13.1 Selección del método en cromatografı́a de gas . . . . . . . . . . . . 34
3.14 Escogencia del modo de inyección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.15 Análisis cuantitativo y cualitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
iii
4 ESPECTROMETRÍA DE MASAS 40
4.1 Cualidades de la espectrometrı́a de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.1 Cualidades de indentificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.2 Cuantifica e identifica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.3 Sensibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.4 Universal y especı́fica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.5 Información estructural . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.1.6 Rapidez . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.2 Tecnicas de ionización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.3 Ionización por impacto electrónico (EI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.4 Ionización quı́mica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.5 Ionización Quı́mica negativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.6 Ionización por campo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.7 Fuentes de desorción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.8 Desorción por campo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.9 Bombardeo por Átomos Rápidos (FAB) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.10 Ionización electrospray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.11 Espectrómetro de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.11.1 Cámara de ionización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.11.2 Analizador de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.12 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.12.1 Channeltron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.12.2 Copa de faraday . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.13 Métodos acoplados a masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.13.1 Aplicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.13.2 Desventajas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.13.3 Identificación de compuestos puros por espectrometrı́a de masas . . 49
4.13.4 Analizador de trampas de iones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) 50

5.1 Proceso cromatográfico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.1.1 Efectos del tamaño de las partı́culas en HPLC . . . . . . . . . . . . 51
5.1.2 Columnas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.1.3 Columnas analı́ticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.1.4 Fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.1.5 Proceso de elución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.2 Clasificación de la cromatografı́a lı́quida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.2.1 Cromatografı́a en fase reversa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.2.2 Cromatografı́a en fase normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
iv
5.2.3 Cromatografı́a lı́quido-lı́quido o de partición . . . . . . . . . . . . . 53

5.2.4 Cromatografı́a de adsorción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.2.5 Elección del solvente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.3 Gradiente de elución isocrática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
5.4 Selección del modo de separación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
5.5 Solventes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
5.6 Criterios para una buena separación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
5.6.1 Atributos de una buena separación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.7 Optimización con un solvente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.7.1 Orden de escogencia de un solvente orgánico . . . . . . . . . . . . . 58
5.8 Optimización con dos o tres solventes orgánicos . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.9 Temperatura como una variable en separaciones isocrática . . . . . . . . . 59
5.9.1 ¿Como se consigue una buena separación? . . . . . . . . . . . . . . 59
6 CROMATOGRAFÍA DE FLUÍDOS SUPERCRÍTICOS 61

6.1 Definiciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
6.2 Carácterı́sticas de un fluı́do supercrı́tico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.3 Analitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.4 Fase Móvil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.5 Cosolventes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
6.5.1 Fluı́dos usados para extracción supercrı́tica . . . . . . . . . . . . . . 63
6.6 Forma e inyección de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
6.7 Columnas y fases estacionarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
6.8 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
6.9 Areas donde se utilizan los fluı́dos supercrı́tico . . . . . . . . . . . . . . . . 64
7 ELECTROFORESIS 66
7.1 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
7.2 Electroforesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
7.2.1 Tipos de electroforesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.2 Electroforesis convencional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.3 Electroforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
7.2.4 Cambio de sentido del flujo electroosmótico . . . . . . . . . . . . . 71
7.3 Instrumentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
7.3.1 Introducción de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
7.4 Sistema de detección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
7.4.1 Métodos de absorbancia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
7.5 Modalidades de la electroforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
7.5.1 Electroforesis capilar por zona (CZE) . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
v
7.5.2 Electroforesis capilar en gel (CGE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

7.5.3 Isotacoforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Bibliografı́a 76
Lista de tablas
vi
Lista de figuras
1.1 Cromatografı́a en columna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 Asimetrı́a de un pico cromatografico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3 Curva Gaussiana ideal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.4 Resolución de un cromatograma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.5 Ensanchamiento de banda debido a la difusión . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.6 Aplicación de la ecuación de Van Deemter en cromatografı́a de gas . . . . 16
1.7 Isotermas comunes y formas de las bandas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.8 Silanización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1 Placa cromatográfica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.2 Siembra de la muestra en una placa cromatográfica . . . . . . . . . . . . . 23
2.3 Placa cromatográfica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.1 Diagrama esquemático de un cromatógrafo de gas . . . . . . . . . . . . . . 27

3.2 Inyección split/splitless . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.3 Detector de ionización por llama . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.1 Ionización por impacto electronico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4.2 Partes de un espectrometro de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.3 Esquema interno de un espectrómetro de masas . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.4 Detector channeltron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.5 Copa de faraday . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
5.1 Cromatografı́a fase inversa.(Fase móvil de baja polaridad) . . . . . . . . . 54

5.2 Cromatografı́a fase normal.(Fase móvil de polaridad media) . . . . . . . . . 55
5.3 Cromatografı́a en fase normal.(Fase móvil de polaridad media) . . . . . . . 55
5.4 Cromatografı́a en fase inversa.(Fase móvil de alta polaridad ) . . . . . . . . 55
7.1 Flujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

7.2 Perfil del flujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
7.3 Dirección del flujo electroosmótico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
vii
viii
7.4 Componentes básicos de un sistema de electroforesis capilar . . . . . . . . 72

7.5 Métodos de introducción de muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
7.6 Diseños de celda para mejorar la sensibilidad de detección por medida de
absorbancia aumentando el camino óptico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Capı́tulo 1
CROMATOGRAFÍA
Ciencia y arte de separar los componentes de una mezcla. Estos componentes son trans-
portados a través de una fase estacionaria, por el flujo de una fase móvil, donde la fase
móvil puede ser un lı́quido o un gas.
Aunque esta es una definición facilmente entendible en principio, puede presentar algunas
limitaciones, estas limitaciones se deben básicamente al desarrollo de la cromatografı́a de
fluı́dos supercrı́ticos en la decada de los sesenta, donde la fase móvil no es ni un gas ni un
lı́quido sino un fluı́do surpercrı́tico. Por ello es mas conveniente relacionar la cromatografı́a
como un método separativo y aceptar más bien la definición dada por Guiddings que la
define como un método de migración en zonas; esto con el fin de aceptar los cambios que
se puedan dar con el avance de las ciencias.
Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración entre los distin-
tos componentes de la mezcla. La cromatografı́a, fué originalmente descrita por Tswett en
el 1906. Tswett ideó un método para separar pigmentos de plantas utilizando un tubo de
vidrio lleno con CaCO3 ,agregó un extracto de planta a la colmna no sin antes lavarla con
un solvente orgánico y observó que se separaban diferentes bandas coloreadas en el interior
de la columna.A la separación de bandas coloreadas le dió el nombre de cromatografı́a,
de la palabra griega Chromatos que significa color.
En la figura 2.1 se muestra una solución que contiene una mezcla la cual se coloca
sobre una columna empacada con partı́culas sólidas y llenado con solvente. Vemos como
los solutos que conforman la mezcla fluyen hacia abajo de la columna a medida que se
le agrega solvente fresco.De los distintos solutos que conforman la mezcla el primero que
eluye es el menos adsorbido por la fase estacionaria y el que eluye de ultimo es el mas
adsorbido por ésta, completandose ası́ la separación.
En general podemos decir que en la cromatografı́a no se incluyen separaciones que em-
plean campos eléctricos para impulsar las moléculas con cargas, de modo que se separen.
1
2 E.Lans
Este tipo de métodos se clasifican como electroseparaciones.
1.1 Clasificación de los métodos cromatográficos

Los métodos cromatográficos son de dos tipos
1.1.1 Cromatografı́a en columna

La fase estacionaria está contenida en un tubo estrecho y se fuerza el paso de la fase móvil
a través del tubo ya sea a presión o gravedad
1.1.2 Cromatografı́a plana

La fase estacionaria está sostenida sobre una placa plana, o en los poros de un papel. Aquı́
la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad, o por efectos de
la gravedad.
1.2 Clasificación de los métodos cromatográficos en

columna
Los métodos cromatográficos se clasifican según la fase móvil, si esta es un gas se denomina
cromatografı́a de gas, si es un lı́quido toma el nombre de cromatografı́a lı́quida y si es un
fluı́do supercrı́tico se le da el nombre de cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos.
1.2.1 Cromatografı́a de Gases

Gas-Lı́quido:La fase estacionaria es un lı́quido y la fase móvil es un gas.
Gas-Sólido: Donde la fase estacionaria es un sólido y la fase móvil es un gas.
1.2.2 Cromatografı́a lı́quida

Lı́quido-Lı́quido o de reparto:La fase estacionaria es un lı́quido.
Lı́quido - Sólido:La fase estacionaria es un sólido.
Intercambio iónico:La fase estacionaria es una resina de intercambio iónico.
Exclusión por tamaño:La fase estacionaria es un lı́quido en los intersticios de un sólido
polimérico.
Afinidad:La fase estacionaria es un lı́quido con grupos especı́ficos unidos a una superficie
Conceptos generales 3
Figura 1.1: Cromatografı́a en columna
sólida.
1.2.3 Cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos

Fase móvil es un fluı́do supercrı́tico.
Como se puede notar las diferentes clases de cromatografı́a se clasifican de acuerdo a la
fase móvil, como se dijo anteriormente.
1.3 Algunos términos y ecuaciones utilizados en cro-

matografı́a
Para tener un entendimiento mas preciso, sobre los procesos cromatográficos, se hace
necesario que el lector tenga claro algunos conceptos utilizados en cromatografı́a. Res-
olución de una columna:Es una medida cuantitativa de su capacidad para separar los
analitos pesentes en una mezcla.
Retención relativa o factor de selectividad: Es la retención de un compuesto con
respecto a otro, tambien la podemos denominar como velocidad de migración diferencial.
t,r2
α= , (1.1)
tr1
4 E.Lans
Entre mas grande el tiempo de retención relativa, mas grande es la separación entre
componentes.La retención relativa es independiente de la velocidad de flujo por que puede
ser usado para identificar picos cuando la velocidad de flujo cambia.
KB
α= (1.2)
KA
La especie B es mas fuertemente retenida que la especie A, por tanto, α siempre va a ser
mayor que la unidad.
(tr )B − tm
α= (1.3)
(tr )A − tm
′
K B KB
α= ′ = (1.4)
KA KA
Altura de plato H : Es una medida de la eficiencia de una columna.
Fase estacionaria:Material sólido en cuya superficie se enlazan las moléculas.
Eluyente:Disolvente que se usa para transportar los componentes de una mezcla a través
de una fase estacionaria.
Eluato:Fase móvil que sale de la columna.
Cromatograma:Es una gráfica de alguna señal de la concentración de un soluto en
función del tiempo de elución o el volumen de elución.
′
Factor de capacidad(K ):Es un parámetro importante que con frecuencia se utiliza
para describir las velocidades de migración de los analitos en las columnas.Para una especie
A:
′ KA V S
K = (1.5)
VM
KA = constante de distribución de la especie A
VS = volumen de la fase estacionaria(analito)
VM = volumen del analito en la fase móvil
′
De un cromatograma se puede calcular K de la siguiente ecuación, teniendo en cuenta
las ecuaciónes 1.6 a 1.12 ası́:
L L 1
= × ′
tr tm 1 + KA
Reordenando tenemos:
′ tr − tm
KA = (1.6)
tm
′
Con esta ecuación se puede calcular KA para un compuesto A desde un cromatograma.
Tiempo de retención:Tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra para
que el pico del analito alcance el detector, el tiempo de retención para una especie Bviene
dada por la siguiente ecuación:
′
16Rs2 H α 2 (1 + KB )3
(tr )B = ( ) ′ (1.7)
µ α−1 (KB )2
Tiempo muerto: Tiempo para que la especie no retenida alcance al detector; es decir la
velocidad de migración de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio del
movimiento de las moléculas de la fase móvil.
′
Tiempo de retención ajustado (tr ): Es la diferencia entre el tiempo de retención del
analito y el tiempo muerto.
′
tr = tr − tm (1.8)
′ (tr )B − tm
tr = (1.9)
(tr )A − tm
1.4 Velocidades de separación

La efectividad de una columna cromatográfica para separar dos analitos depende en parte
de las velocidades relativas con la que eluyen las dos especies. Estas velocidades están
determinadas por la magnitud de las constantes de los equilibrios de distribución de las
especies entre las fases estacionaria y móvil.
Cs
K= (1.10)
Cm
K = Constante de distribución, razón de distribución o coeficiente de distribución. Cs =
Concentración molar del analito en la fase estacionaria.
Cm = Concentración molar del analito en la fase móvil.
Idealmente K debe ser constante en un amplio intervalo de concentraciones,o sea que
Cs ≅ Cm
L
V̄ = (1.11)
tr
donde V̄ = velocidad lineal media de migración del analito
L = Longitud de la columna
L
µ= (1.12)
tm
6 E.Lans
µ = velocidad lineal media del movimiento de las moléculas de la fase móvil
Entre más rápido es la velocidad lineal media de migración del analito ( flujo lineal),
menos tiempo gasta en la columna y menos ensanchamiento de banda ocure debido a
lo difusión longitudinal.Las velocidades lineales de flujo en cromatografı́a de lı́quidos son
significativamente menores que las que se utilizan en cromatografı́a de gas.
′
Cuando el factor de capacidad K de una especie dada es menor que la unidad, es
por que la elución es tan rápida que es difı́cil determinar con exactitud los tiempos de
′
retención. Cuando el K es del orden de 20 a 30 o mayores,es porque los tiempos de re-
tención son demasiado largos; idealmente las separaciones se realizan en unas condiciones
en las que los factores de capacidad oscilan entre 1-5. El factor de capacidad K , para
cada uno de los picos en un cromatograma está definido como:
′ tr − tm
K = (1.13)
tm
Para verificar la eficiencia de una columna es bueno monitorear perı́odicamente mediendo
el factor de capacidad de un estándar, el número de platos y la asimetrı́a de los picos.
Cambios de estos factores reflejan degradación de la columna.
moles de analito en la fase móvil

V̄ = µ × (1.14)
moles totales de analito
1
V̄ = µ × (1.15)
VS
1 + KA
VM
1.5 Tiempo de retención Vs coeficiente de partición

La definición del factor de capacidad es equivalente a decir:
tsgf e
K, = (1.16)
tsgf m
Donde tsgfe, tsgfm = tiempo del soluto gastado en la fase estacionaria y tiempo soluto
gastado en fase móvil respectivamente.
Si tenemos en cuenta la ecuación(1.13), podemos afirmar que:
Si el soluto gasta todo el tiempo en la fase móvil, entonces el factor de capacidad K , = 0
por que el tiempo de retención serı́a igual a tm .
Si el soluto gasta igual tiempo en la fase móvil y la fase estacionaria, entonces el tr = 2tm ,
por lo queK , = 1
Si el soluto gasta tres veces igual tres veces más tiempo en la fase estacionaria que en la
fase móvil, entonces el tr = 4tm , ası́,K , = 3
De lo anterior podemos deducir que habrá tres veces más moles de soluto en la fase esta-
cionaria.
Cs Vs
K, = (1.17)
Cm Vm
Donde Cs es la concentración de soluto en la fase estacionaria, Vs volumen de la fase
estacionaria, Cm , concentración de soluto en la fase móvil y Vm volumen en la fase móvil.
Cs Vs Cs
como K , = yK= entonces,
Cm Vm Cm
Vs
K, = K (1.18)
Vm
,
tr − tm t,r
como K = =
tm tm
Vs t,r
K, = K = (1.19)
V m tm
t,r
K, = (1.20)
tm
1.6 Relación entre el tiempo de retención y la con-

stantes de distribución
V̄ = µ × fracción de tiempo que el analito reside en la fase móvil
Cm Vm 1
V̄ = µ × = µ× (1.21)
Cm Vm + Cs Vs Cs Vs
1+
Cm Vm
1
V̄ = µ × (1.22)
KVs
1+
Vm
8 E.Lans
′ KA V s
Como KA = entonces:
Vm
1
V̄ = µ × ′ (1.23)
1 + KA
1.7 Asimetrı́a
La asimetrı́a de un pico puede tener distintas causas: Aplicación de un exceso de analito,
error en la técnica de inyección o columna degradada.
Picos no simetricos generalmente indican que interacciones no deseadas han ocurrido du-
rante el proceso cromatográfico.
Picos anchos son comunes en columnas empacadas,indicando que la cinética de la trans-
ferencia de masas es demasiado lenta.
En algunas aplicaciones con columnas empacadas poco se puede hacer al respecto, sin
embargo, el objetivo del cromatografista es lograr unos picos estrechos tanto como sea
posible, para lograr mejores separaciones.
La simetrı́a de los picos se puede clasificar como Tailing o Fronting dependiendo de la
localización de la asimetrı́a. El alcance de la asimetrı́a es definido como Tailing Factor
(TF).
b
TF = (1.24)
a
Tanto a como b son medidos sobre el 10% de la altura del pico. Figura 1.2 en la pagina
9. De acuerdo a la ecuación (1.3) un pico con tailing tendrı́a un TF mayor que la unidad,
y un pico con fronting su TF es menor que la unidad. Todos los picos que necesiten ser
medidos deben ser simétricos con un TF en el rango de 0,9 a 1,5.
1.8 Tipos de fuerzas que están presentes en un sis-

tema cromatográfico
En un sistema cromatográfico existen varios tipos de interacciones a saber:
1. Interacciones iónicas
2. Fuerzas de enlace de hidrógeno
3. Fuerzas de repulsión
4. Fuerzas de Van Der Walls
Figura 1.2: Asimetrı́a de un pico cromatografico
1.8.1 Interacciones iónicas

Ocurren entre el soluto y una fase o ambas, cuando tienen cargas permanentes. Este tipo
de interacciones me da la cromatografı́a iónica, que resulta de la interacción entre los iónes
de soluto y los iones de la fase estacionaria.
1.8.2 Fuerzas de enalce de hidrógeno

Ocurren entre molélculas que tienen el hidrógeno unido a un pequeño átomo bastante
electronegativo como los alcoholes, aminas y agua los cuales pueden ser donores o acep-
tores de protones. Los esteres, aldehı́dos, cetonas y eteres sólo pueden ser aceptores de
protones y forman enlace de hidrógeno con compuestos donores de protones
1.8.3 Fuerzas de repulsión

Las fuerzas de repulsión se dan entre cargas iguales, la energı́a de orientación aumenta
con forme aumenta el momento dipolar.
1.8.4 Fuerzas de Van Der Walls

Las fuerza de Van Der Walls son de tres tipos:
1. Orientación (dipolo-dipolo) o de Keesom. Se dan entre moléculas con dipolo per-
manente.
2. Inducción (dipolo inducido-dipolo) o Debye

10 E.Lans
3. Dispersión (dipolo inducido-dipolo inducido)o London
Las fuerzas de London son débiles y se dan entre moléculas simétricas ej: SO3 ,SO2 ,O2 ,N2 ,Br2
etc. ocurren entre una fase y el soluto donde ambas son neutros o polarizables.
1.9 Bases fı́sicas de la cromatografı́a

Entre más grande la razón de los coeficientes de partición mas grande es la separación
entre los componentes de una mezcla.
Las ecuaciones(1.18) y (1.2) relacionan el tiempo de retención, coeficiente de partición y
el volumen de las fases estacionaria y móvil.
Debido a que t,r αK , αK la retención relativa(α) puede ser expresada como:
t,r2 Kr2,
K2
α= , = , =
tr1 Kr1 K1
1.9.1 Eficiencia
Existen dos factores que contribuyen a la eficiencia de una separación:
1-La diferencia del tiempo de elución entre picos, entre mas grande es esta diferencia
mejor la separación.
2-El ancho de los picos. Entre mas ancho sean los picos mas pobre es la separación.
La eficiencia de una columna se mide por la altura de plato H. El nombre proviene de
la teorı́a de la destilación, en la cual la separación puede ser llevada a cabo en escalones
discretos llamados Altura equivalente o un plato teórico.
El ensanchamiento de banda (ancho de los picos)también se produce como consecuencia
de la velocidad finita con la que ocurren los distintos procesos de transferencia de masa
durante la migración de una especie a lo largo√de la columna.
La desviación estándar de una banda σ = 2Dt.
Donde D = coeficiente de difusión
t = tiempo
m
Si un soluto viaja a una distancia x a una velocidad de flujo lineal = µx el tiempo que
s
x
gasta este al viajar por una columna serı́a: t = , por lo tanto:
µx
x 2D 2D
σ 2 = 2D = x, si = H ⇒ σ 2 = Hx
µx µx µx
σ2
H= (1.25)
x
Donde H es la altura de plato,

σ es la desviación estándar de la curva gausiana
y x es la distancia que viaja a través de la columna.
De las ecuaciones anteriores podemos concluir que la altura de plato es la constante

de proporcionalidad entre la varianza σ 2 de la banda y la distancia (x)que ha viajado.
Fı́sicamente NO EXISTEN estos platos en cromatografı́a, de tal manera que uno debe
considerar la altura de plato como un término que relaciona el acho de una banda con la
distancia recorrida en una columna. La altura de plato H es proporcional a la varianza
de una banda cromatográfica.Cuanto mas pequeño es la altura de plato mas estrecho es
el ancho de una banda.
La capacidad que tiene una columna para separar una mezcla de componentes es mejo-
rada por la disminución en la altura de plato.
Diferentes solutos que pasan a través de una misma columna, tienen diferentes alturas
de plato, por que ellos tienen diferentes coeficientes de difusión.
Las alturas de platos en cromatografı́a de gas son aproximadamente de 0,1 a 1mm, en

HPLC ∼ 10µm y < 1µm en electroforesis capilar.
1.9.2 Numero de plato teórico

El número de plato teórico de una columna con longitud L es:
L L LX LX L2
N= = 2 = 2 , si hacemosx = L ⇒ 2 = 2
H σ σ σ σ
x
W L2 L2
De la figura 1.3 página 13 σ = ası́ que N = = 16
4 W2 W2
16
Si expresamos L y W en unidades de tiempo, en vez de longitud,Nserı́a adimensional;
ası́ obtenemos la expresión mas útil para N
16t2r
N= (1.26)
W2
12 E.Lans
Si usamos la achura de la altura media en vez de la base, entonces:
t2r
N = 5.5 2
(1.27)
w1/2
La ecuación anterior se deduce teniendo en cuenta la figura 1.3 y usando la anchura de la

altura media, en vez de la anchura de la base.
1.9.3 Resolución
La resolución de una columna es el grado de separación que realiza una ésta de los com-
ponentes de una mezcla.Figura 1.4
El movimiento del soluto a través de la columna cromatográfica, se propaga en forma

gausiana con una desviación estándar de σ.
Entre mas tiempo gasta un soluto pasando a través de la columna, mas ancha es la banda.
Medidas comunes al ensanchamiento de la banda son la anchura media del pico W1/2 , me-
dida a la mitad de la altura del pico y la anchura de la lı́nea base W. Figura 1.3
∆tr ∆Vr
La resolución está dada por, Rs = =
Wav Wav
∆tr y ∆Vr son las diferencias de tiempo de retención y volumen respectivamente entre
picos y Wav es el promedio de la anchura base de ambos picos en sus unidades correspon-
dientes.
Para análisis cuantitativo una resolución >de 1.5 es altamente deseada.
Factores que afectan la resolución

La resolución de una columna se ve afectada por el número de plato teórico N, la retención
relativa σ y el factor de capacidad K , como se observa en la siguiente ecuación:
√
N α−1 K2,
Rs = ( )( , ) (1.28)
4 α 1 + Kav
Donde N es el número de platos teóricos en la columna, α es la retención relativa de
los dos picos K2, es el factor de capacidad para el componente más retenido y Kav ,
es el
promedio de los factores de capacidad√para ambos picos. De la ecuación anterior se deduce
que la resolución es proporcional a N,√de tal modo que si doblamos la longitud de la
columna, se incrementa la resolución en 2. Igualmente podemos decir que la resolución
Figura 1.3: Curva gausiana ideal muestra como w y w1/2 son medidos. El valor de w es obtenido
extrapolando las tangentes en el punto de inflección de la linea base
Figura 1.4: Resolución de un cromatograma

14 E.Lans
se incrementa cuando aumenta α y el factor de capacidad K2, .

La manera de cambiar la retención relativa es cambiando en cromatografı́a de gas la fase
estacionaria y en HPLC cambiando la fase estacionaria o fase móvil.
1.9.4 Difusión
Una causa del ensanchamiento de la banda es la difusión. Una banda del soluto se ensan-
cha a medida que se va moviendo a través de la columna.Figura1.5
El coeficiente de difusión mide la velocidad a la cual una substancia se mueve aleatoria-
mente de una región de alta concentración a otra región de baja concentración.
El número de moles que cruzan en un metro cuadrado por segundo, se llama flujo y es
proporcional al gradiente de concentración.
mol
F = ≡J (1.29)
m2 S
dc
J = −D (1.30)
dx
De donde D es el coeficiente de difusión, y el signo negativo se debe a que el flujo neto va
dc
de una región de alta concentración a otra de baja concentración son la variación de
dx
la concentración molar con respecto a la distancia recorrida
1.9.5 Ecuación de Van Deemter

La ecuación de Van Deemter nos dice como la columna y la velocidad de flujo afecta
la altura de plato.La eficacia de las columnas cromatograficas pueden evaluarse por la
Figura 1.5: Ensanchamiento de banda debido a la difusión

ecuación 1.31
B
H ≈A+ + Cux (1.31)
µx
H= altura de plato en cm A= término de los múltiples pasos, factor de tortuicidad, o
difusión de Eddy. Cux = término de transferencia de masas, es decir tiempo finito re-
querido para que el soluto alcance el equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria.
cm
µx = velocidad lineal de la fase móvil .
s
B = difusión longitudinal.
La altura de plato debido al término de transferencia de masa es:
′
K d2 × µx
H= ≅ Cux (1.32)
(K ′ + 1)2 D
′
K = factor de capacidad d = espesor de la fase estacionaria D = coeficiente de difusión
del soluto en la fase estacionaria
La altura de plato es reducida con el termino de transferencia de masa disminuyendo el
espesor de la fase estacionaria y aumentando la temperatura ya que ası́ se aumenta el coe-
ficiente de difusión del soluto en la fase estacionaria. Las alturas de plato en cromatografı́a
lı́quida son un orden de magnitud menores que las correspondientes en cromatografı́a de
gas; sin embargo en cromatografı́a lı́quida el largo de las columnas no son mayores de 25
a 50 cm, ya que no se pueden mantener la alta presión a longitudes mas grandes; cosa
que no ocurre en cromatografı́a de gas. Ası́ vemos que ésta contraresta a la H pequeña
en cromatografı́a lı́quida dado que en cromatogrfı́a de gas las columnas pueden alcanzar
hasta 50 m de longitud, la altura de plato(H) y por ende la eficacia de la columna son
mayores con frecuencia en cromatografı́a de gas.
La expresión 1.31 es llamada ecuación de Van Deemter la cual se usa para tratar de
explicar las complejas interacciones fı́sicas y los efectos que conducen al ensanchamiento
de banda.
Si cambiamos la columna y la fase estacionaria cambian tambien los valores de A, B
y C. Según la ecuación de Van Deemter hay mecanismos de ensanchamiento de la banda
que son proporcional, e inversamente proporcional e independiente a la velocidad de flujo.
Figura 1.6
En las columnas empacadas todos los tres términos contribuyen al ensanchamiento de
banda. Para las columnas open tubular el término A es 0, de modo que el ancho de banda
disminuye, aumentanto por tanto la resolución.
Cuando la altura de plato es mas pequeña, más estrecha es la banda; ası́ que la ecuación
de Van Deemter nos dice como afecta la velocidad de flujo y la columna la altura de plato.
16 E.Lans
Figura 1.6: Aplicación de la ecuación de Van Deemter en cromatografı́a de gas

(Harris 1999)
En electroforesis capilar tanto el término A como el C son 0 disminuyendo la altura

de plato a valores considerablemente bajos hasta niveles de micrometros produciendo un
poder extraordinario de separación.
Una grafica de Cs versus Cm (a una temperatura dada) es llamada isoterma. Figura

1.7. En cromatografı́a se pueden presentar a menudo cromatogramas con picos no muy
bien definidos, presentandose picos con cola, como se puede ver en la parte inferior de
la figura1.7 En la figura 1.7 la isoterma de la izquierda ocurre cuando ha sido agregado
demasiado soluto a la columna, sobrecargandola. Cuando la concentración del soluto se
incrementa es porque el soluto es mas soluble en la fase estacionaria ; hay tanto soluto en
la fase estacionaria que ésta tiende a parecerse al soluto.(semejante disuelve semejante).
Una cola surge cuando algunos sitios retienen soluto mas fuertemente que otros.
La isoterma de abajo de la figura 1.7 ocurre cuando pequeñas cantidades de soluto son
retenidas mas fuertemente que cantidades grandes.
Como se dijo anteriormente, sitios que retienen solutos fuertemente causan cola ; ası́
los grupos hidroxilos que forman enlaces de hidrogenos con solutos polares producen colas
muy marcadas. La silanización reducen las colas porque bloquean a los grupos hidroxilos
con otros grupos no polares, como el trimetilsilil. Figura 1.8
Figura 1.7: Isotermas comunes y formas de las bandas

(Harris 1999)
Figura 1.8: Silanización

18 E.Lans
Las columnas de vidrio o de sı́lice usadas en cromatografı́a de gas o lı́quida tambien

se pueden silanizar para minimizar la interacción del soluto con los puntos activos de la
columna.
1.10 Ejercicios
1. Considere un experimento cromatográfico en la cual dos componentes con factores
de capacidad de 4,0 y 5,0 respectivamente, son inyectados en una columna con 1x103
platos teoricos. El tiempo de retención para el compuesto menos retenido es tr1 =
10,0 min.
a)Calcular el tm y tr2
b) Encontrar W1/2 y W
c)Calcular la resolución de los dos picos.
Rta.
a)tm = 2 min.; tr2 = 12 min.
b)w2 = 1, 52 min. ;W1 = 1, 26;w1/2 pico 1 = 0, 74;w1/2 pico 2 = 0,89
c) Resolución = 1,44
2. La retención relativa de dos compuestos en cromatografı́a de gas es 1,068 en una

columna con una altura de pico de 0,520 mm. El factor de capacidad para el com-
puesto 1 es 5,16.
a)¿Cual serı́a la longitud de la columna requerida para separar los compuestos con
una resolución de 1?
b) El tiempo de retención para el aire en la columna(a) es de 2.0 min.. Si el número
de platos es el mismo para ambos compuestos. Encontrar los tiempos de retención
y la anchura de cada uno de los picos.
c) Si la razón fase estacionaria fase móvil es 0,30, encontrar el coeficiente de par-
tición para el componente 1.
Rta.
a) L = 2,71 m
b) tr1 = 12, 32 min. ; tr2 = 13, 02 min. ; W1 = 0, 68 min. ; W2 = 0, 72 min.
c) K = 17
3. Las áreas obtenidos de picos por cromatografı́a de gases para una mezcla de ac-
etato de metilo, propionato de metilo y n-butirato de metilo fueron 17,6 ; 44,7 y
31,1 respectivamente. Calcular el porcentaje de cada compuesto si las respectivas

respuestas de detección relativa fueron 0,65; 0,83; y 0,92.
Capı́tulo 2
CROMATOGRAFIA EN CAPA
FINA
La cromatografı́a en capa fina se basa en la preparación de una capa uniforme, de un

adsorbente, mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales
para la cromatografı́a en capa fina son, pueś : un adsorbente, placas de vidrio, un disposi-
tivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la placa de adsorbente
y una placa en la que se desarrollan las placas cubiertas.La fase móvil es lı́quida y la fase
estacionaria un sólido.
La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos
polar que la fase estacionaria, de modo que los solventes que se desplacen con mayor
velocidad serán menos polares. Figura2.1
2.1 Ventajas de la cromatografı́a en capa fina

1. La instrumentación utilizada es mas simple.
2. El tiempo para conseguir las separaciones es mucho menor.
3. El método es simple y los resultados son reproducibles, lo que la hace un método

adecuado para fines analı́ticos.
2.2 Adsorbentes
Al elegir un adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partı́culas. Cuanto más
finamente dividido esté, mayor será su adhesión al soporte.
20
Cromatografı́a en capa fina 21
Figura 2.1: Placa cromatográfica
2.2.1 Proceso de adsorción

La muestra aplicada en la capa, es adsorbida en la superficie del material por la acción
de fuerzas electrostáticas (fuerzas de van der waals). Luego cuando la placa es expuesta
a un flujo por acción capilar, se inicia una competencia de enlaces entre sitios activos del
adsorbente y la sustancia con el solvente.
2.2.2 Adsorbentes utilizados

Los adsorbentes más utilizados son la celulosa, el almidón, los azucares, sı́lica gel entre
otros, oxido de aluminio (alúmina) entre otros.
Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y

animales.
2.3 Preparación de placas

Para la preparación de las placas se sigue el siguiente procedimiento:
• Mezclar en un erlenmeyer el agua y el adsorbente
• Agitar fuertemente
• Extender la muestra sobre el soporte de vidrio
• Hacer oscilar la mezcla de un lado para otro

22 E.Lans
El espesor de la placa suele ser de 0.1 a 0,2 mm para separaciones analı́ticas. La placa
debe quedar libre de grumos y rugosidades que afectarı́an el desarrollo del proceso cro-
matografico. Las placas se dejan en reposo un corto tiempo después de cubrirlas; luego
se colocan en bandejas metalicas.En este momento se puede activar el adsorbente, bien
dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente, o calentándola durante
30-60 minutos a 105-110 grados Celsius, para ası́ expulsar el aire.
2.4 Aplicación de las muestras

Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible en un disolvente orgánico no
polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después
de su aplicación. Para sembrar la muestra se utilizan micropipetas o un tubo capilar. El
proceso de siembra se hace tocando con la punta del capilar la placa preparada dejando
una distancia al borde inferior de un centı́metro aproximadamente. El punto de aplicación
de la muestra se denomina toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la
placa sólo quedará la muestra a analizar.
2.5 Elección del eluyente

La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del
material en que la separación se llevará a cabo.
Entre los principales eluyentes en orden creciente de polaridad tenemos:enemos:Eter de
petróleo,eter dietilico,ciclohexano,acetato de etilo,tetracloruro de carbono,piridina, ben-
ceno, etanol,cloroformo,metanol,diclorometano,agua y Acido acético.
Entre los factores para la elección del eluyente se encuentran: Precio,pureza, no utilizar
mezclas de eluyente,no utilizar compuestos muy volátiles, evitar que contengan trazas de
metales (catalizadores)
La elección del eluyente se realiza de forma empı́rica. Hay que estudiar la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez mas polares hasta dar con el más apropiado.
Otra técnica para realizar consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficiente-
mente y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra.
Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de tal forma que se
aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera eficaz.Figura 2.2
Figura 2.2: Siembra de la muestra en una placa cromatográfica
2.6 Desarrollo de la cromatografı́a

El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método
ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi vertical, por
la acción de la capilaridad.
Generalmente el eluyente se introduce en una cámara una hora antes del desarrollo
para permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo de desarrollo, por lo general no
llega a los 30 minutos.Figura 2.3 Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo pre-
fijado, o hasta que se alcance una lı́nea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto
se hace para estandarizar los valores de Rf.Frecuentemente esta distancia es de 10 cms.
La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen

y el frente del eluyente ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor
o menor velocidad.
2.7 Evaluación de un cromatograma de capa fina

Para llevar a cabo una evaluación de un cromatograma en capa fina se puede realizar por
análisis cualitativo y análisis cuantitativo.
24 E.Lans
Figura 2.3: Placa cromatográfica
2.7.1 Análisis cualitativo

• Medida de Rf
• Comparación visual de color/intensidad.
2.7.2 Análisis cuantitativo

Comparación visual del diámetro y la intensidad del color de la mancha contra una serie
de manchas patrones de concentración conocida.
2.8 Localización de sustancias

Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos
compuestos. Para ello existen dos métodos:Métodos quı́micos y Métodos fı́sicos.
2.8.1 Métodos quı́micos

Consisten en realizar una reacción quı́mica entre un reactivo revelador y los componentes
separados. Para ello se atomiza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de
atomizador. Si el reactivo atomizador es muy corrosivo o peligroso, la atomización deberá
hacerse en una vitrina de gases.Como reactivo revelador generalmente se utiliza yodo,
el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-
marrón) pero las manchas desaparecen con el tiempo por lo que es conveniente señalar
las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los
componentes orgánicos produciendo manchas negras. El tamaño de las manchas no está
relacionado con la cantidad de componente separado.
2.8.2 Métodos fı́sicos

El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal manera
que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y la
longitud de onda aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes.
Los compuestos que poseen fluorescencia se pueden detectar directamente bajo la luz
ultravioleta.
2.9 Constante Rf
La constante Rf (ratio of front) es simplemente una manera de expresar la posición de un
compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención de un compo-
nente. Se define como:
Rf= distancia recorrida desde el origen por el compuesto/distancia recorrida desde el

origen por el compuesto de referencia
X
Rf = (2.1)
f
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la
mancha. Para que los Rf sean reproducibles se deben fijar una serie de condiciones tales
como espesor de la pelı́cula, fase estacionaria, fase móvil y cantidad de muestra.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa
y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los Rf, y si son
distintos puede decirse con toda seguridad que no se trata del mismo compuesto.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa
con el mismo eluyente, u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separación mı́nima.
Capı́tulo 3
CROMATOGRAFIA DE GAS
En cromatografı́a de gas el analito es transportado a través de la columna por una fase

móvil gaseosa llamda Carrier gas
3.1 Cromatografı́ gas lı́quido

Llamada también de partición, la fase estacionaria es un lı́quido no volátil que cubre la
parte interna de la columna, o está sobre un soporte sólido.
3.2 Fase móvil

En cromatografı́a de gas la fase móvil es un gas generalmente He, N2 , o H2 y la fase
estacionaria es generalmente un liquido no volátil y algunas veces un sólido. El analito
debe estar en forma gaseosa o como un lı́quido volátil
La columna debe estar lo suficientemente caliente para proveer presión de vapor del
analito y pueda ser eluato en un tiempo razonable. El detector es mantenido a una
temperatura mas alta que la columna ası́ que todos los analitos serán gaseosos.
Existen dos clases de columnas en cromatogrfı́a de gas, las tubulares abiertas lla-
madas tambien open tubular column y las empacadas.
3.3 Columnas tubulares abiertas

La mayorı́a de los análisis usan open tubular column, largas y estrechas hechas de sı́lica
fundida (SiO2 ) y revestida con poliamida (un plástico capaz de resistir hasta 350 o C) para
26
Cromatografı́a de gas 27
Figura 3.1: Diagrama esquemático de un cromatógrafo de gas
soporte y protección de la humedad atmosférica. El diametro interno de las columnas esta

entre 0.10–0.53 mm y la longitud de 15–100 m.
3.3.1 WCOT :wall coated tubular column

Caracterı́sticas:El espesor de la pelı́cula de la fase estacionaria en el interior de la
columna está entre 0.1–5µm. Disminuyendo el espesor de la pelı́cula de la fase esta-
cionaria aumenta la resolución, disminuye el tiempo de retención y disminuye la cantidad
de muestra. La fase estacionaria esta adherida a las paredes internas de la columna.
3.3.2 SCOT: support coated open tubular column.

Caracterı́sticas:Partı́culas sólidas con la fase estacionaria liquida están adheridas a las
paredes internas de la columna.
3.3.3 PLOT: porous layer open tubular column

Caracterı́sticas:La fase estacionaria sólida está unida a las paredes internas de la columna.
Para aumentar el área de contacto se tratan las paredes de la columna con HF, luego se
deposita allá la fase estacionaria. La eficiencia de las SCOT es intermedia entre las WCOT
y las columnas empacadas.
3.4 Ventajas de las open tubular column

comparadas con las columnas empacadas las open tubular ofrecen:alta resolución,tiempo
de análisis mas cortos,gran sensibilidad y mas baja capacidad de muestra.
Las narrow open tubular column ofrecen mas alta resolución que las wider open tubular
pero requieren mas alta presión para operar y tienen menos capacidad de muestra.
28 E.Lans
3.5 Clases de fase estacionaria

(Diphenyl)x(dimethyl)1-x polysiloxane.
(Cyanopropylphenyl)0.14(dimethyl)0.86 polysiloxane:Polaridad intermedia.
Carbowax (poly(ethyleneglycol)) :Fuertemente polar.
(biscyanopropyl)0.9((cyanopropylphenyl)0.1 polysiloxane: Fuerte polaridad.
3.6 Escogencia de la fase estacionaria

La escogencia de una fase estacionaria dada para un problema dado se basa en la regla:
semejante disuleve semejante. Columnas no polares son mejores para solutos no polares
las de polaridad intermedia son mejores para solutos de polaridad intermedia.
Advertencia:Las altas temperaturas y la exposición al oxigeno causan degradación de
la columna y producen cola en los cromatogramas.
Entre sólidos usados para columnas PLOT tenemos alúmina Al2 O3 la cual es una fase
estacionaria que separa hidrocarburos en cromatografı́a de adsorción gas sólido.
Para evitar daños a las columnas por impurezas de los gases, éstos pueden ser seca-
dos utilizando trampas que contienen Mallas Moleculares ya que el agua es fuertemente
retenida por éstas. Las mayas moleculares son material inorgánico o polı́meros orgánicos
con grandes cavidades dentro de las cuales pequeñas moléculas entran y son parcialmente
retenidas. Moléculas, tales como H2 , O2 , CO2 , CH4 pueden ser separadas una de otras.
Las mallas inorgánicas pueden ser regeneradas calentando a 300o C al vacio o bajo flujo
de N2 .
3.7 Columnas empacadas

Contienen un soporte sólido fino con un lı́quido no volátil como fase estacionaria o sólo
el soporte sólido puede actuar como fase estacionaria. Las columnas son generalmente
hechas de acero inoxidable, nı́kel o vidrio. El diámetro interno es de 3 - 6 mm y la longitud
es de 5 y 20 cm, el soporte sólido a menudo es de diatomea que es silanizado..
En las columnas empacadas el tamaño uniforme de las partı́culas disminuye el ter-
mino múltiples caminos (A) en la ecuación de VAN DEEMTER reduciendo ası́ la altura
de plato y aumentando por ende la resolución.
El pequeño tamaño de las partı́culas disminuye el tiempo requerido para que el soluto
alcance el equilibrio mejorando la eficiencia de la columna, sin embargo entre mas pequeño
es el tamaño de las partı́culas se requiere mas presión para que la fase móvil pase a través
de la columna.
El tamaño de las partı́culas se expresa en micrómetros o tamaños MESH esto se refiere

al tamaño del tamiz a través del cual las partı́culas son pasadas o retenidas. Una partı́cula
de 100/200 mesh pasa a través de un tamiz de 100 mesh pero no a través de uno de 200.
Es decir el mesh da la apertura por pulgada lineal del tamiz.
3.8 Indice de retención

Los ı́ndices de retención de Kovats (I) para alcanos es igual a 100 veces el número de
átomos de carbono. Para el octano el (I) es de 800 para el nonano es de 900.
3.9 Programación de temperatura y presión

En la programación de la temperatura, la temperatura de la columna es subida durante
la separación para incrementar la presión de vapor de soluto y disminuir el tiempo de
retención de los compuestos eluı́dos.
A temperatura constante en una mezcla los compuestos más volátiles pueden emerger
juntos y los menos volátiles pueden aún no ser eluı́dos de la columna.
Si la temperatura es incrementada de 50 a 250 o C a una velocidad de 8 o C/min, todos
los compuestos son eluı́dos y la separación de los picos son uniformes. Hay que evitar
subir la temperatura demasiado para prevenir descomposición térmica del analito o la
fase estacionaria.
La programación de la presión es útil a analitos lábiles que no puedan tolerar altas

temperaturas.
3.10 Carrier gas

La eficiencia de la columna y el detector depende de la identidad del gas soporte.
El He, N2 yH2 dan alturas de plato óptimos a una velocidad de flujo diferente. (ver
curva de van deemter)
Entre más rápidamente un soluto se difunde entre las fases, mas pequeños es la trans-
ferencia de masa, termino Cu en la ecuación de van deempter.
Para la eficiencia de la columna y la velocidad de análisis el H2 es un buen gas so-
porte. El H2 puede reaccionar catalı́ticamente con compuestos insaturados sobre superfi-
cies metálicas.
Las impurezas en el carrier gas degradan la fase estacionaria.
30 E.Lans
Se deben usar gases de alta calidad y a aún ası́ estos deben pasarse a través de filtros
para remover el oxigeno , agua y trazas de compuestos orgánicos antes de que estos entren
a la columna.
3.11 Inyección de la muestra

Los lı́quidos son inyectados con una jeringa a través de un serpentı́n de caucho pasando
por el glass liner silanizado. El gas soporte barre la muestra vaporizada desde el puerto
de inyección hacia la columna cromatográfica. El volumen de inyección es tı́picamente 0,1
- 2 µ L de muestra.
La muestra descompuesta y componentes no volátiles lentamente se acumulan en el
glass linner el cual debe ser reemplazado periódicamente.
3.11.1 Inyeción split

Medio de introducir pequeños volúmenes de muestra en columnas open tubular. Este
modo se utiliza si el analito de interés constituye mas del 0.1% de la muestra . Para
trabajos de alta resolución, los mejores resultados son obtenidos con este modo de intro-
ducción de la muestra, preferiblemente conteniendo menor o igual a 1.0 ng de cada uno
de los componentes.
Una inyección split libera solamente 0,2 -2% de la muestra en la columna.
3.11.2 Inyección splitless

Modo de inyección preferido para análisis a nivel de trazas, el analito constituye menos
del 0,01% en la muestra.
La temperatura de inyección para el modo splitless es mas bajo que para el modo
split, aprox 220 o C por que la muestra gasta mucho mas tiempo en el puerto de inyección
y no queremos que ocurra descomposición térrmica. El tiempo de residencia en el glass
liner es aprox de 1 min por que el gas soporte fluye a través del liner a la columna con
una velocidad de flujo aprox 1 mil/min. En este modo el 80% de la muestra entra a la
columna. Es mejor a niveles de trazas para solutos de alta ebullición en solventes de baja
ebullición. Figura 3.3
3.11.3 Inyección on column

Se usa para solutos térmicamente inestables, y solventes con alto punto de ebullición. Es
mejor para análisis cuantitativos que la inyeción split/ splitless. La solución es inyectada
Figura 3.2: Inyección split/splitless
directamente en la columna. En este procedimiento la muestra es sometida a la mas baja

temperatura posible para evitar la perdida de soluto.
3.12 Detectores
Un detector no identifica que está eluyendo de la columna, sino que algo está emergiendo.
3.12.1 Claseses de detectores

Detector de ionización por llama (FID)
Es un detector universal ya que responde a todos los compuestos orgánicos, entre sus car-
acterı́sticas se encuentran:Sensibilidad, estabilidad,excelente rango lineal,fácil operación,
mantenimiento y amplia aplicabilidad.Todos estos detalles lo hacen el más popular de los
detectores en cromatografı́a de gas. (McNair & Miller 1998)
Figura 3.3: Detector de ionización por llama

32 E.Lans
Principios:Se aplica un voltaje a la boquilla de la llama y al colector. El carrier gas

que sale de la columna es mezclado con hidrogeno y quemado en la punta de la boquilla,
luego se aplica oxigeno como una mezcla de aire en la cámara de combustión para ase-
gurar la eficiencia de la ionización del efluente de la columna. Esta combustión genera
iones. El movimiento de estos iones desde la llama al colector cargado positivamente pro-
duce una pequeña corriente, estando presente siempre una señal de fondo. Al introducir
un compuesto orgánico en la llama produce unos iones que incrementa la corriente de
base. FIGURA Esta señal es procesada por el registrador en un correspondiente pico
cromatográfico.
Detector captura de electrones (ECD)

Es un detector de ionización que es especı́fico para compuestos que capturan electrones.Es
usado para análisis de compuestos halogenados debido a la sensibilidad extrema para estos
compuestos.
Principios:Una fuente de electrones de una fuente radiactiva Ni63 es usado para bom-
bardear el efluente de la columna pasando a través del detector. El make up gas es ionizado
por los electrones libres de la fuente, produciéndose un plasma que contiene entre otras
especies electrones térmicos. Se aplica una diferencia de potencial a la celda del detector,
el cual permite la captura de iones cargados negativamente y de electrones.Esto crea una
corriente que es la base para todas las medidas. Cuando llegan los compuestos afines
a los electrones estos son capturados produciéndose una diferencia de corriente que es
registrada y transformada en una señal. La cantidad de corriente reducida es una función
de la cantidad de compuesto presente y su capacidad de capturar electrones.FIGURA
Detector de conductividad térmica (TCD)

Es sensible a todos los compuestos, pero la sensibilidad y la naturaleza casi universal del
FID ha hecho la utilidad del TCD útil solamente en áreas de aplicación limitada. Prin-
cipios: Consiste en dos celdas cada una con un filamento calentado cuya resistencia
al flujo de corriente es mantenida electrı́nicamente. El carrier gas con el compuesto de
interés pasar a través de una celda, mientras que la otra celda (referencia) recibirá sola-
mente el carrier gas que no ha pasado a través de la columna. Los filamentos se calientan
simultáneamente; cuando pasa la muestra con el carrier gas hay una absorción de calor
por la muestra, lo que origina una diferencia de temperatura entre los dos filamentos de
los dos compartimientos. FIGURA Un cambio en la temperatura es medido por el corre-
spondiente cambio en la resistencia del filamento. El cambio resultante en la resistencia
del filamento ( temperatura) es comparado con el filamento de la celda de referencia. La
diferencia entre las corrientes de las dos celdas es la señal, que es enviada al registrador
para procesarlo en un pico cromatográfico.FIGURA
Detector nitrogeno fósforo (NPD)
Es un detector de ionización que es selectivo hacia compuestos que contienen atomos de

nitrógeno o fósforo.
Principios: Funciona casi similar a FID excepto que tiene una sal alcalina sobre la
llama en la cámara de combustión. Una bolita de silicato de aluminio (sulfato de rubidio)
es calentada eléctricamente a 600 - 800o C por aplicación de una corriente, produciéndose
un plasma sostenida por adición de hidrogeno y aire. Los iones del metal alcalino son
emitidos desde aquı́ interactuando con el efluente de la columna.Una pequeña corriente
es producida por los movimientos de iones generados desde el plasma al colector cargada
positivamente. La introducción de nitrógeno o fósforo contenidos en los compuestos causa
un aumento en la corriente por encima de la corriente base. Esta señal es procesada por
el registrador en un pico cromatográfico.
Detector fotométrico de llama
Es un detector óptico y especı́fico para compuestos que contienen fósforo y sulfuros.

Principios: Se combina H2 y aire O2 para producir una llama, el compuesto azufrado
que proviene del efluente de la columna se quema en la llama y emite una longitud de
onda caracterı́stica del S2 , lo cual es seleccionado por un filtro, luego esta luz emitida es
enviada a un tubo foto multiplicador que la transforma en corriente, la cual es enviada al
registrador para su procesamiento en el correspondiente pico cromatográfico.
H O
Compuesto azufrado −−2−→
2
SO + producto (3.1)
llama
SO + O3 −→ SO2∗ + O2 (3.2)
SO2∗ −→ SO2 + Energı́a (3.3)
3.13 Preparación de la muestra

Es un proceso de transformar una muestra en una forma que sea adecuada para el análisis.
El proceso podrı́a evaluar: extracción del analito en una muestra compleja, precon-
centración de analito muy diluida para su medición, remover o enmascarar las especies
interferentes, o transformar quı́micamente el analito en una especie mas conveniente a
una forma mas fácilmente detectable. (derivatización.
34 E.Lans
Microextracción en fase sólida

Metodo por medio del cual se puede extraer compuestos de lı́quidos, aire o lodo sin usar
ningún solvente.
Purga y trampa
Es un método para remover analitos volátiles de lı́quidos o sólidos (tal como aguas sub-
terránea o suelos)concentrando el analito e introduciéndolo en el cromatógrafo. En con-
traste con la SPME el cual remueve una porción del analito de la muestra , el objetivo
de purga y trampa es remover el 100% del analito en la muestra. Se burbujea el gas de
purga He en el recipiente donde se encuentra la muestra, el cual es calentado para ayudar
a la evaporación del analito, el gas de purga junto con el analito salen y pasan a través
de un tubo de adsorción que contiene tres capas de compuestos de adsorbente con fuerzas
adsorbentes diferentes ( bajo, moderado y alto) luego es retirado el tubo con los analitos
adsorbidos e inyectados en el cromatógrafo de gas, donde empieza la desorción.
3.13.1 Selección del método en cromatografı́a de gas

Para seleccionar un método en cromatografı́a de gas se debe tener en cuenta lo sigu-
iente:Objetivo del análisis,preparación de la muestra,detector, columna y modo de in-
yección.
Objetivo del análisis

Que se requiere del análisis?: La identificaci
on cualitativa de los componentes de una mezcla?. Requiere la separación una alta res-
olución en todo el cromatograma? O una buena resolución en una porción de este?. Puede
sacrificar resolución por tiempo de análisis cortos?. Necesita el análisis cuantitativo de
uno o mas componentes?.Necesita alta precisión?. Se encuentra el analito en concen-
tración adecuada o necesita técnicas especiales para ultra análisis (preconcentración y un
detector muy sensible).
Preparación de la muestra
La clave para una cromatografı́a exitosa en una muestra compleja es limpiarla antes de
entrar a la columna, para ello se usa la técnica SPME o purga y trampa. Otros métodos
incluyen extracción lı́quida, extracción fluidos supercrı́ticos, extracción en fase sólida, des-
orción térmica de volátiles de un material sólido. Estas técnicas aislan el analito deseado
de sustancias interferentes y pueden además concentrar analitos diluidos hasta niveles
detectables. Si la muestra no se limpia bien pueden aparecer un gran numero de picos no

resueltos y sustancias no volátiles pueden arruinar su costosa columna cromatográfica.
Escogencia del detector

Para ello se hace necesario si quiere un detector especı́fico para un elemento en particular, o
para una clase particular de compuesto ej: el FID requiere que la muestra contenga mayor
o igual a 10 ppm de cada analito para la inyección split. El de conductividad térmica
detecta toda clase de compuestos pero no es suficientemente sensible para análisis alta
resolución y columnas open tubular de diámetro estrecho. El ECD es especı́fico para
moléculas que contienen halógenos, carbonilos conjugados, nitrilos, y compuestos nitro.
La muestra debe contener concentración mayor o igual a 100 ppb de cada analito. El de-
tector de fotoionización es especı́fico para compuestos aromáticos. NPD para compuestos
con nitrógeno y fósforo, FPD para compuestos que contienen sulfuros.Fotométrico de
llama para elementos como S, P , Pb o Sn.
MS e IR son utilizados para identificar los eluatos.
Selección de la columna
Para ello hay que tener en cuenta: la fase estacionaria, el diámetro de la columna, la
longitud y el espesor de la fase estacionaria. Las columnas pueden ser de polaridad
intermedia, no polar y altamente polar: por ejemplo: Para compuestos altamente polar se
necesita una columna fuertemente POLAR. Una columna con fase estacionaria intermedia
hará las mayorı́as de las separaciones que la columnas no polar no pueden hacer. La
mas alta resolución es alcanzada con columnas estrechas y una fase estacionaria con
espesor muy delgado. Esta combinación minimiza la resistencia a la transferencia de
masa termino C en la ecuación de van deemter, la fase estacionaria y la móvil reducen
la altura de plato. Columnas de pelı́culas delgada, estrechas son especialmente buenas
para separaciones de mezclas de compuestos de alto punto de ebullición que son retenidos
demasiado fuertemente sobre columnas con pelı́culas gruesas. El tiempo de retención corto
provee alta velocidad de análisis, sin embargo pelı́cula con espesor de pelı́culas delgado,
diámetro estrecho tienen muy poca capacidad de muestras y requieren un detector con alta
sensibilidad (el FID no es adecuado) no retienen compuestos con bajo punto de ebullición
y podr´a sufrir exposición de sitios activos sobre la superficie de la sı́lice.Columnas con
pelı́culas gruesa y estrecha dan una buena combinación entre resolución y capacidad de
muestra y pueden ser usada con la mayorı́a de los detectores (excepto los TCD y el IR) y
con compuestos de alta volatilidad. Los tiempos de retención son más largos que aquellos
de columnas con pelı́cula delgada.
36 E.Lans
Columnas con diámetro grande y pelı́culas gruesa son sugeridas para detectores de
conductividad térmica TCD e IR ya que tienen alta capacidad de muestra y pueden
manejar compuestos volátiles, pero dan baja resolución y tiempos de retención muy largos.
Si una columna en particular satisface la mayorı́a de sus requerimientos pero no provee
suficiente resolución, entonces una columna mas larga del mismo tipo podr´a ser usada.
Doblando la longitud de la columna dobla el número de platos y aumenta la resolución
en 21/2, aunque esta no es la mejor manera de aumentar la resolución por que dobla el
tiempo de retención.
Al usar una columna mas estrecha o una fase estacionaria mas delgada incrementa la
resolución sin perjudicar el tiempo de retención. Cambiando completamente el tiempo de
retención cambia tambión la retención relativa de los componentes y podrı́a resolver los
componentes de interés.
3.14 Escogencia del modo de inyección

Inyección split
Es útil para analitos altamente concentrados, con este modo de inyección se consigue alta
resolución.
Inyección splitless
Es util cuando las muestras están muy diluı́das, se consigue igualmente alta resolución.
Inyección on column
Es mejor para análisis cuantitativo y compuestos térmicamente sensibles. Es una técnica

de baja resolución y no puede ser usada con columnas cuyo diámetro interno sea menor de
0.25 mm. Puede manejar soluciones diluidas o concentradas y volúmenes relativamente
grandes o pequeõs.
3.15 Análisis cuantitativo y cualitativo

Para identificar compuestos dos detectores son muy comunes. El espectrómetro de masas
y el IR con transformada de fourier. Un pico puede se identificado comparando su espectro
con una biblioteca de espectros que tiene el computador.
Co-Cromatografı́a
Es una forma mas adecuada de comparar tiempos de retención. Una muestra autentica
es agregada a una desconocida. Si el componente agregado es idéntico a la desconocida,
entonces el área relativa del pico aumenta.
Análisis cuantitativo
Para la cuantificación, en cromatografı́a se utilizan varios métodos, como son el método
del estándar interno, método del estard externo y el método de normalización de área.
Método el estándar interno

Un estándar interno es un compuesto distinto al analito de interes pero que tiene propiedades
similares
El método del estándar interno se utiliza mucho en cromatografı́a ya que permite

una mayor precisión toda vez que evita las pequeñas variaciones de corrida en corrida
difı́ciles de controlar producidas por la inyección de la muestra. (Harris 1999). Otra
razón para utilizar el estándar interno es que debido a la pequeñas contidades de muestras
inyectadas en cromatografı́a no son muy reproducibles. El procedimiento consiste en
agregar una cantidad exactamente conocida de un estándar interno tanto a la muestra
como a los estándares,la relación de las áreas ( o alturas)del analito y de estándar interno,
sirven como parámetro analı́tico. Para poder aplicar este método se requiere que el pico
de estándar interno esté bien separado de los picos de los demás componentes de la
muestra,esto se consigue con una resolución mayor de 1,25 mas o menos; no obstante a lo
anterior se requiere además que el pico del estándar esté cerca del pico de analito.(Skoog
& Holler 1998)
Para cuantificar por medio de este método se utiliza la siguiente ecuación:
Ax /[×] = F (As /[S]) (3.4)

Donde: Ax = Area de la señal del analito
As = Area de la señal del estandar
[X[ = Concentración del analito en estudio
[S] = Concentración del estándar
F = Factor de respuesta
La ecaución anterior obedece que la respuesta relativa del detector al analito y al

estándar es constante bajo un amplio rango de condiciones; por ejemplo si la señal de
38 E.Lans
estándar incrementa por el cambio en la velocidad de flujo del solvente, ese mismo incre-
mento lo sufre la señal del estándar.(Harris 1999)
Método de normalización de área

Para aplicar este método se toman el promedio de 5 replicas(inyecciones) del área del
analito de interes. Se escoge un componente como referencia y la respuesta relativa de
otros componentes se determinan dividiendo el área del pico de interés por el área del
pico de referencia. El factor de respuesta del detector se puede usar para calcular el área
corregida del pico de interés. Este procedimiento aplica para cada uno de los picos de los
componentes a estudiar, determinando su área relativa. Luego se suman todas las áreas
corregidas y se divide por el área del pico en cuestión y multiplicandolo por cien.(A. &
F.J 1999).Veamos el siguiente ejemplo.
Para un componente x cuando existen patrones:
Ax Ax
FRD = ⇒ FRx = (3.5)
Aref mx
De donde:
FRD = Factor de respuesta del detector
FRx = Factor de respuesta del compuesto x
Ax =Area de compuesto de interés
mx =masa del compuesto de interés
Para el calculo del área corregida de un componente cuando existen patrones, lo cual
nos permite hacer un calculo exacto, se utiliza la siguiente ecuación:
Acorregida = FRD × Ax (3.6)

Acorregida x
%Ax = × 100 (3.7)
ΣAcorregida
Como es área es proporcional al peso(aforando al mismo volumen) entonces:
Acorregida
%WA = × 100 (3.8)
ΣAcorregida
Cuando no existen patrones solo se puede hacer un calculo semicuantitativo, para ello
se utiliza la siguiente fórmula:
Ax
%Ax = × 100 (3.9)
ΣAi
Para la exactitud del método se deben tener en cuenta los siguientes criterios:
1. Todos los analitos deben ser eluı́dos
2. Todos los analitos deben ser detectados
3. Todos los analitos deben tener igual sensibilidad (respuesta/masa)
Método del estándar externo

Uno de los métodos más sencillos es este, el cual consiste en preparar una serie de disolu-
ciones patrón de composición pararecida a la muestra. Luego se obtienen los cromatogra-
mas de los patrones, representados en las alturas de plato o áreas de pico en función de
la concentración. Esta grafica deberı́a originar una lı́nea recta que pasa por el origen de
coordenadas. Para mejor exactitud en la medida se le debe hallar su pendiente con su
el intercepto con sus desviaciónes estándar, el coeficiente de determinación r 2 y chequear
frecuentemente después de varias corridas. Una vez hecha la curva se toma la lectura de
la muestra y se interpola en la grafica, lograndose ası́ la concentración buscada.
Capı́tulo 4
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La espectrometrı́a de masas da el nombre a un conjunto de técnicas utilizadas para la

medida de las masas de los iones y su abundancia en la fase gaseosa.
El conjunto de técnicas llamadas espectrometrı́a de masas es una de las mas versátiles
e importantes instrumentos de análisis quı́micos
4.1 Cualidades de la espectrometrı́a de masas

4.1.1 Cualidades de indentificación
Puede identificar cualitativamente de forma inequı́voca casi cualquier tipo de sustancia.
4.1.2 Cuantifica e identifica

Puede identificar y cuantificar la concentración de la sustancia bajo estudio.
4.1.3 Sensibilidad
Detecta en el orden de ppq (ICP-MS) y tiene capacidad de separar mezclas complejas.
4.1.4 Universal y especı́fica

Analiza sustancias o mezclas de sustancias sólidas, lı́quidas y gaseosas. Es capaz de
detectar y separar una sustancia en presencia de una matriz compleja.
40
Espectrometrı́a de masas 41
4.1.5 Información estructural

Suministra información estructural de la molécula.
4.1.6 Rapidez
Puede realizar un espectro en décimas de segundos.
4.2 Tecnicas de ionización

Dependiendo de la naturaleza del compuesto a analizar o del interés del investigador
se utilizan varias tećnicas de ionización. Entre ellas tenemos: Ionización por impacto
electrónico(EI),ionización quı́mica(CI) ,ionización por campo(FD), desorción por campo(FD),bombeo
con atomos rápidos(FAB),electrospray ( ES, ESI), ionización a presión atmosférica.
Las tres primeras fuentes requieren la volatilización de la muestra antes de la ionización;a
ellas se les llama fuentes de fase gas; por tanto sólo se pueden usar para compuestos
térmicamente estables que tengan puntos de ebullición menores de 500 o C. Mayoritaria-
mente las fuentes de gas están limitadas a compuestos con pesos moloculares menores de
103 daltons.
4.3 Ionización por impacto electrónico (EI)

Es el mas utilizado. Cuando las moléculas se encuentran en la cámara de ionización son
sometidas a un bombardeo con una corriente de electrones provenientes de un filamento.
El número de electrones es controlado por la temperatura del filamento, mientras que su
energı́a lo es por el potencial a que se mantiene el filamento. El potencial del filamento
se puede variar. 70 eV es el mas usual.Figura 4.1
M + e − −→ M+ + 2 e − (4.1)
4.4 Ionización quı́mica

En las fuentes de ionización quı́mica se utiliza un gas reactivo ( metano, amonı́aco, argón,
isobutano etc) para suavizar las condiciones de ionización de la muestra . Por tal razón
hay menos energı́a en exceso y por ende menos fragmentación que el EI ( por encima de
la que se necesita para la ionización). Se introduce el gas en la cámara de ionización a
una presión de 10−3 torr, su concentración es mucho más alta que la de la muestra. Se
42 E.Lans
Figura 4.1: Ionización por impacto electronico

(Esteban 1993)
ioniza el gas con un haz de electrones y a través de su subsiguientes reacciones acepta

protones para formar iones moleculares.
Si se usa metano el ión primario formado es el CH5 + , este, transfiere un protón a las
moléculas de analito que tienen mayor afinidad por el protón, mediante la reacción:
CH5 + + M −→ MH+ + CH4 (4.2)
4.5 Ionización Quı́mica negativa

La reacción más frecuente es la abstracción protónica.
MH + R− −→ M− + RH + Energı́a (4.3)
El exceso de energı́a producido en la reacción suele quedar en forma de energı́a vibracional

asociada al enlace R−H de la especie neutra formada, lo que hace que la especie M −
formada sea muy estable y halla una ausencia casi total de fragmentación.
4.6 Ionización por campo

Aquı́ los iones se forman bajo la influencia de un campo eléctrico elevado al aplicar altos
voltajes (10 a 20 kV) a emisores que contienen numerosas puntas finas de diámetros
menores de 1µm. Estos emisores adquieren la forma de un fino hilo de tungsteno en la
cual se han hecho crecer centenares de agujas microscópicas de carbón por pirolisis de
benzonitrilo que emergen desde la superficie del hilo.
La muestra gaseosa se difunde en el área del campo elevado alrededor de las micropun-
tas donde se concentra éste. En las micropuntas es donde tiene lugar la ionización donde
los electrones del analito son extraı́dos. En este caso el analito adquiere poca energı́a
vibracional y rotacional por lo que se produce poca fragmentación.
4.7 Fuentes de desorción

Son aquellas donde no es posible la ionización de analitos térmicamente inestables y no
volátiles.
Los métodos de desorción prescinden de la volatilización y la posterior ionización.
En su lugar se suministra energı́a a la muestra lı́quida o sólida de modo que se provoca
la formación directa de iones gaseosos. Como consecuencia, los espectros aparecen muy
simplificados y a menudo consisten sólo en el ión molecular o el ión molecular protonado.
Con esta técnica se puede obtener información sobre espectros de masas de especies bioquı́-
micas y especies con PM por encima de 10.000 daltons.
4.8 Desorción por campo

Se utiliza un emisor con multiples puntas como se describió anteriormente. En este caso
el electrodo se monta sobre una sonda que puede separarse del compartimiento de la
muestra y mojarse con una solución de la muestra. Después la sonda se reinserta en el
compartimiento de la muestra, la ionización tiene lugar por la aplicación de un potencial
elevado a este electrodo.
4.9 Bombardeo por Átomos Rápidos (FAB)

Es importante para el estudio por espectrometrı́a de masas para compuestos de elevado
peso molecular. La muestra condensada (a menudo en glicerol) se ionizan por bombardeo
con atomos de elevada energı́a de xenón o argón. Tanto los iones negativos y positivos
del analito son expulsados de la superficie de la muestra por un proceso de desorción.
44 E.Lans
Este procedimiento permite un calentamiento rápido de la muestra reduciendo su frag-

mentación.
4.10 Ionización electrospray

4.11 Espectrómetro de masas
Un espectrómetro de masas4.2 consta de:
1. Una fuente de ionización
2. Un analizador
3. Transductor(dectector)
4.11.1 Cámara de ionización

Zona donde se introducen la moléculas ( pueden ser gaseosas, lı́quidas o sólidas), se evap-
ora, se ioniza y se aceleran. (las muestras gaseosas se ionizan entre dos placas cargadas).
Los iones formados son de masas diferentes.
4.11.2 Analizador de masas

Después de ser acelerados los iones pasan al analizador de masas que son de varios tipos,
donde se separan de acuerdo a su masa. Figura 4.3. En general en el analizador se necesita
un vacı́o del orden 10−7 torr o mejor. Para lograrlo se debe utilizar un sistema eficiente
de bombeo.(?)
Figura 4.2: Partes de un espectrometro de masas

Figura 4.3: Esquema interno de un espectrómetro de masas
4.12 Detectores
Como ya lo habiamos dicho un detector es aquel que convierte una propiedad quı́mica de
un analito en una señal subsectible de ser medida. En masas el detector más utilizado
es el channeltron.El efecto es muy parecido al fotomultiplicador. Es un tubo de vidrio
abierto con un cono en una terminación. Para la detección de iones positivos, el cono es
sometido a un alto potencial negativo (aproximadamente −3kV ).
4.12.1 Channeltron
Cuando los iones salen del analizador de masas, son atraı́dos por el potencial negativo
del cono. Cuando los iones chocan con su superficie,ası́ se originan uno o más electrones
secundarios. El potencial dentro del tubo varı́a continuamente con la posición, tal que
los electrones secundarios se mueven hasta llegar a otra zona donde se originan otros
electrones secundarios, y ası́ sucesivamente.Figura 4.4
El tubo está cubierto por un material semiconductor. La vida media del multiplicador
está determinada por la carga total acumulada.
4.12.2 Copa de faraday

El analizador del gas consiste en una fuente del Ion, un espectrómetro total, y una sección
de la medida. Se ioniza el gas residual cuando choca con los filamentos termoelectrónicos
cargados de alta temperatura, y los iones que se crean, se aceleran y convergen sobre
46 E.Lans
Figura 4.4: Detector channeltron
Figura 4.5: Copa de faraday

el espectrómetro total. En el espectrómetro total, los voltajes de la corriente alterna se

aplican a los cuatro electrodos cilı́ndricos (quadropole), que permite que los iones sean
separados de acuerdo a su realción masa/carga. Los iones separados son detectados como
corriente eléctrica por la Copa de Faraday. La corriente del ón es proporcional a la masa
(presión parcial) del gas. Figura 4.5
4.13 Métodos acoplados a masas

Aunque la espectrometrı́a de masas es una poderosa herramienta para la identificación
de compuestos puros es insuficiente para el análisis de incluso mezclas simples ya que
la identificación está limitada por el inmenso número de fragmentos de diferentes valores
m/z producidos.
Cromatografı́a de gas/masas- cromatografı́a lı́quida/masas

Es una buena herramienta para el análisis de mezclas orgánicas y bioquı́micas complejas.
En este caso se efectúan los espectros de los compuestos que salen de la columna cro-
matográfica;los cuales son almacenados en un ordenador para el siguiente proceso.
Los espectrómetros de masas también se pueden acoplar a cromatografı́a lı́quida MS/LC
para el análisis de muestras que tienen constituyentes no volátiles. El inconveniente que
se presenta en los acoplamientos anteriores es que la muestra en el cromatógrafo está
diluı́da por el gas o el lı́quido portador de la columna; por lo que es necesario eliminar el
eluyente antes de la introducción de la muestra en el espectrómetro de masas.
El detector de masas mas simple para cromatografı́a de gases es el detector de trampa

de iones (ITD)
Espectrometrı́a de masas en tandem MS/MS

Consiste en acoplar un espectrómetro de masas a otro. El primer espectrómetro sirve
para aislar los iones moleculares de varios componentes de una mezcla. Estos iones se
introducen uno de tras otro en un segundo espectrómetro de masas. En un instrumento
en tandem el primer espectrómetro está equipado con un método de ionización suave(
ionización quı́mica) para que la salida sea mayoritariamente de iones moleculares o iones
moleculares protonados.Estos iones pasan entonces a la fuente de ionización del segundo
espectrómetro. Esta fuente de iones consiste en una cámara de colisiones sin campo en
la que se bombea helio. Las colisiones entre los iones progenitores y los atomos de helio
producen fragmentaciones de iones progenitores dando numerosos iones hijos. El espectro
48 E.Lans
de estos iones hijos se efectúa por un segundo espectrómetro. El primer espectrometro

tienen la misma función que la columna en GC/MS o GC/LC.
Aplicaciones de la espectrometrı́a de masas en tandem
La espectrometrı́a de masas en tandem parece ofrecer las mismas ventajas que GC/MS y
LC/MS pero es más rápida.
La espectrometrı́a de masas en tandem es potencialmente más sensible que las dos
técnicas cromatográficas acopladas, ya que el ruido asociado a su uso es menor.
4.13.1 Aplicaciones
Se ha utilizado en la determinación cualitativa y cuantitativa de los componentes de
una amplia variedad de materiales complejos encontrados en la naturaleza y la indus-
tria.Ejemplos
1. Identificación y determinación de metabolitos de drogas.
2. Feromonas de insectos.
3. Alcaloides en las plantas.
4. Trazas de contaminantes en el aire.
5. Secuencia de polı́meros.
6. Compuestos petroquı́micos.
7. Bifenilos policlorados.
8. Gases de escape de automotores.
9. Olores en aire.
4.13.2 Desventajas
Una desventaja de la cromatografı́a de masas en tandem con respecto a los otros proced-
imientos cromatográficos es el alto costo del equipo requerido.
4.13.3 Identificación de compuestos puros por espectrometrı́a

de masas
El espectro de masas de un compuesto puro nos da información a cerca de:
1. Peso molecular del compuesto.
2. De su formula quı́mica.
3. Sobre la presencia de varios grupos funcionales, estudiando el modelo de frag-

mentación y comparando el espectro del compuesto con uno conocido hasta su total
coincidencia.
4. Relación con los picos debido a impurezas. Cuando existen dudas se deben utilizar
los espectros de ionización quı́mica o ionización por campo.
4.13.4 Analizador de trampas de iones

En este instrumento, los iones se generan a partir de la muestra eluı́da, por impacto
electrónico o ionización quı́mica y luego se almacenan en un campo de radiofrecuencia. A
continuación los iones atrapados se expulsan del área de almacenamiento hacia un detector
multiplicador de electrones. La expulsión se lleva a cabo de tal forma que es posible un
barrido en función del cociente/masa carga.
Capı́tulo 5
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
La cromatografı́a lı́quida es muy importante porque la mayorı́a de los compuestos no son

lo suficientemente volátiles para analizarse por cromatografı́a de gas.
En HPLC se usa alta presión para forzar el solvente a pasar a través de una columna
que contiene unas partı́culas muy finas que dan alta resolución a las separaciones. El
sitema HPLC involucra:
1. Un sistema de entrega de solvente.
2. Una válvula de inyección de la muestra.
3. Una columna que resiste alta presión.
4. Un detector.
5. Un computador para el control del sistema. Modernamente se usa un sistema para

el control de la temperatura.
5.1 Proceso cromatográfico

En cromatografı́a de gas para incrementar la eficiencia se incrementarı́a la velocidad de
transferencia de masas entre la fase estacionaria y la fase móvil. Para una columna
open tubular esto es adecuado ya que disminuyendo el espesor de la pelı́cula de la fase
estacionaria y reduciendo el diámetro de la columna las moléculas pueden difundirse
50
Cromatografı́a lı́quida de alta resolución 51
rápidamente.
La difusión de los lı́quidos es 100 veces mas lento que la difusiń de los gases. Por tanto
en cromatografı́a lı́quida no es generalmente factible usar columnas open tubular, por que
el diámetro de los canales del solvente es demasiado grande para ser atravesado por una
molécula de soluto en corto tiempo. De modo que la cromatografı́a lı́quida es llevada a
cabo en columnas empacadas.
5.1.1 Efectos del tamaño de las partı́culas en HPLC

La eficiencia de una columna empacada se incrementa cuando el tamaño de las partı́culas
de la fase estacionaria decrece ya que disminuye la altura de plato. En condiciones
optimas el número de platos teóricos en una columna de longitud L (cm) es: N =
3.500L(cm)/dp(µm)
dp = tamaño de las partı́culas en micrómetro.
Una razón de porque las partı́culas pequeñas dan mejor resolución es que ellas proveen
un flujo mas uniforme a través de la columna, por tanto reducen el termino de múltiples
pasos A en la ecuación de Van Deempter.
Una segunda razón es que la distancia a través de la cual el soluto debe difundirse en
la fase móvil entre partı́culas se debe al tamaño de éstas. Cuando las partı́culas son
pequeñas, hay menos distancia entre ellas, para que el soluto se difunda mejor en la fase
móvil. Este efecto disminuye el término C en la ecuación de Van Deemter, dando un
tiempo finito entre equilibrio.
El inconveniente del pequeño tamaño de las partı́culas es la resistencia al flujo del
solvente, es por ello que requiere alta presión ( 70-400 atm).
5.1.2 Columnas
Las columnas en HPLC pueden ser de plástico, vidrio o acero inoxidable con longitudes
entre 5 y 30 cms, con un diámetro interno de 1-5 mm. Las columnas son costosas,
fácilmente degradables debido al polvo o partı́culas que se encuentran en la muestra o
el solvente, por lo que se requiere de un guarda columna. Un guarda columna es
una columna corta que contiene la misma fase estacionaria que la columna principal. Las
partı́culas finas e impurezas son retenidas por el guarda columna, la cual es periódicamente
reemplazado.
Si se calienta la columna generalmente disminuye la viscosidad del solvente, aumentando
su velocidad de flujo y reduciendo la presión requerida.
52 E.Lans
Igualmente incrementando la temperatura disminuye el tiempo de retención mejorando

la resolución, ya que aumenta la difusión del soluto; no obstante este aumento de tem-
peratura puede degradar la fase estacionaria disminuyendo la vida útil de la columna.Si
calentamos la columna unos pocos grados sobre la temperatura ambiente, mejora , la pre-
cisión (reproducibilidad y repetibilidad) del análisis cuantitativo y el tiempo de retención.
5.1.3 Columnas analı́ticas

El tamaño de las partı́culas de relleno en esta columnas son de 3-10 µm.
La columna más utilizada es la de 25 cm con tamaño de partı́culas de 5 µmy diámetro
interno de 4.6 mm.
Estas columnas alcanzan unas alturas de platos teóricos de 40.000 a 60.000.
5.1.4 Fase estacionaria

Existen dos tipos básicos de relleno pelicular y de partı́cula porosa. La mas común son
partı́culas microporosas esféricas de sı́lica que son permeables al solvente y tienen un
área de superficie bastante grande. Las esferas son de vidrio o polı́meros con diámetro
de 30 a 40 µm. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa
de sı́lice, alúmina o resina de intercambio iónico.Estas esferas también se pueden tratar
quı́micamente para obtener una capa superficial orgánica.
Los tı́picos rellenos de partı́culas porosas en cromatografı́a de lı́quidos están formados
por micro partı́culas porosas con diámetros de 3 a 10 µm.
5.1.5 Proceso de elución

En la cromatografı́a de adsorción las moléculas de solvente compiten con las moléculas de
solutos por los sitios activos de la fase estacionaria.
Las capacidades relativas de los diferentes solventes para eluir un soluto dado del
adsorbente son casi independiente de la naturaleza del soluto.
La elución se puede describir como un desplazamiento de soluto a través la fase esta-
cionaria por el solvente.
Fuerza del eluente εo

Es una medida de la energı́a de adsorción del solvente, la cual es cero (0) para el pentano
para adsorción sobre sı́lica. Entre más polar es el solvente más fuerza de elusión tiene
sobre la sı́lica. Entre mas grande sea la fuerza del eluente mas rápidamente será eluı́do
de la columna.
La cromatografı́a de adsorción sobre sı́lica bare es un ejemplo de cromatografı́a en

fase normal en la cual usamos una fase estacionaria polar y un solvente menos polar. Un
solvente mas polar tiene una fuerza de eluente mas alta.
5.2 Clasificación de la cromatografı́a lı́quida

La cromatografı́a lı́quida la podemos clasificar como:
5.2.1 Cromatografı́a en fase reversa

Es la mas común donde el solvente es polar y la fase estacionaria es a polar o ligeramente
polar. Aquı́ un solvente menos polar tiene una fuerza de elución mayor. Generalmente el
solvente es un hidrocarburo.
En la cromatografı́a en fase reversa se eliminan picos con cola (tailing) por que la
fase estacionaria tiene pocos sitios que puedan adsorber fuertemente al soluto como para
producir el tailing. La cromatografı́a en fase reversa es menos sensible a las impurezas
polares (como agua) en el eluente. En esta cromatografı́a los componentes mas polares
aparecen primero y un aumento en la polaridad de la fase móvil disminuye el tiempo de
elución.
5.2.2 Cromatografı́a en fase normal

En cromatografı́a en fase normal la fase estacionaria es polar y la fase móvil es apolar;
el soluto menos polar se eluye primero debido a que es más soluble en la fase móvil y un
aumento en la polaridad en la fase móvil aumenta el tiempo de elución.
5.2.3 Cromatografı́a lı́quido-lı́quido o de partición

En esta cromatografı́a las moléculas de soluto se distribuyen entre dos lı́quidos, uno de
ellos hace la veces de fase estacionaria y el otro de fase móvil, esta última se encuentra
homogeneamente dispersa en un soporte sólido.
Este tipo de cromatografı́a presentó inconvenientes mayores como el hecho de que:1)se
requerı́a presaturar la fase móvil con la fase estacionaria.2)era necesario disolver la muestra
en la fase móvil presaturada con la fase estacionaria y 3)no se podı́an llevar a cabo
gradientes de elución.
54 E.Lans
Ejemplos
El siguiente ejemplo muestra el comportamiento de elución de los distintos componentes
teniendo en cuenta su polaridad y la clase de polarografı́a utilizada.(Skoog & Holler 1998)
5.2.4 Cromatografı́a de adsorción

Llamada cromatografı́a liquido-sólido. Las únicas fases que se utilizan en HPLC lı́quido-
sólido son la sı́lice y la alúmina, siendo la sı́lice la que más es utilizada, se usa para
casi todas las aplicaciones debido a su mayor capacidad de carga y mayor diversidad de
presentaciones.
En cromatografı́a lı́quido-sólido la única variable que se puede utilizar para optimizar
K y α es la composición de la fase móvil.
La cromatografı́a de adsorción es más adecuada para compuestos no polares con masas

moleculares inferiores a 5000.
Esta cromatografı́a es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes
no polares, por lo que tiene una solubilidad limitada en los disolventes acuosos utilizados
en cromatografı́a de fase inversa. Una caracterı́stica particular de la cromatografı́a de
adsorción es su capacidad de diferenciar isómeros.
5.2.5 Elección del solvente

Para elegir el solvente adecuado se varı́a la relación entre los disolventes y se obtiene ası́
′
un valor adecuado de k . Se ha encontrado que un aumento de 0,05 unidades en el valor
′
de εo por lo general disminuye 3 o 4 veces el valor de k .
Con estas combinaciones se pueden encontrar la relación que favorezcan los tiempos
de retención para cualquier mezcla, pero por desgracia la relación de volumen no es lineal
con εo .
Figura 5.1: Cromatografı́a fase inversa.(Fase móvil de baja polaridad)

Polaridad de los componentes: A>B>C
Figura 5.2: Cromatografı́a fase normal.(Fase móvil de polaridad media)
Figura 5.3: Cromatografı́a en fase normal.(Fase móvil de polaridad media)

Polaridad de los componentes: A>B>C
Figura 5.4: Cromatografı́a en fase inversa.(Fase móvil de alta polaridad )

56 E.Lans
5.3 Gradiente de elución isocrática

La elución isocrática es llevada a cabo con un solo solvente (o mezcla constante de sol-
vente). Cuando un solvente no es capaz de dar una elución rápida de todos los compo-
nentes, entonces se usa el gradiente de elución, que no es mas que hacer cambios
continuos en la composición del solvente para aumentar su fuerza.
El gradiente de elución en HPLC es análogo a la programación de temperatura en
cromatografı́a de gas.Aumentando la fuerza del solvente se eluye más rápidamente el
soluto retenido.
5.4 Selección del modo de separación

Hay varias formas de separar un componente de una mezcla dada. En cualquier caso la
primera pregunta que se debe hacer es si es soluble en agua o en un solvente orgánico.
Si el soluto se disuelve en un solvente no polar o débilmente polar, usaremos la cro-
matografı́a en fase reversa. Si el peso molecular del soluto es mayor de 2000 y son solubles
en solventes orgánicos con diámetro molecular menor de 30 nm escogemos cromatografı́a
fase reversa (C18 , C8 , C4 ).
Si el peso molecular es mayor de 2000 y es soluble en solvente orgánico y el tamaño
molecular está entre 30-400 nm la cromatografı́a a escoger es la exclusión por tamaño.
Si el peso molecular del soluto es menor de 2000 y es soluble en agua y es iónico la
cromatografı́a a escoger es la iónica.
5.5 Solventes
Se requieren solventes grados HPLC muy puros para evitar la degradación de la columna
debido a las impurezas y minimizar la señal de fondo del detector debido a contaminantes.
Para evitar esto se utilizan filtros para retener las partı́culas con tamaños de las micra.
La muestra y el solvente son pasados a través de un guarda columna. Aún contando
con un guarda columna se recomienda el lavado periódico de la columna analı́tica para
prolongar su vida útil.
Antes del uso del solvente estos son purgados con He para remover el aire disuelto, ya
que las burbujas de aire les causan problemas a las bombas,a las columnas y detectores.
Las separaciones en fase normal son muy sensibles al agua en el solvente.
Una buena cromatografı́a con fases móviles interactivas, requiere un equilibrio ade-
cuado entre las fuerzas intermoleculares entre los tres participantes activos en el proceso
de separación soluto, fase móvil y fase estacionaria. Estas fuerzas intermoleculares
se describen en términos de polaridad relativa de cada uno de los reactivos.

Para una separación cromatográfica de reparto la polaridad de la fase estacionaria ha de
ser similar a la del analito y para la elusión se requiere entonces una fase móvil de una
polaridad considerablemente distinta. La polaridad de los grupos funcionales viene dada:
HIDROCARBUROS<ETERES <ESTERES <CETONA<ALDEHIDOS<AMIDAS <AMINAS
<ALCOHOLES. En conclusión podemos decir que para que ocurra una buena separación
las polaridades del soluto, fase móvil y la fase estacionaria deben armonizarse, por que si
el soluto tiene mucha mas afinidad con la fase móvil, los tiempos de retención serán de-
masiado cortos para fines prácticos, y si tiene demasiada afinidad con la fase estacionaria
los tiempos de retención se hacen demasiado largos.
5.6 Criterios para una buena separación

El factor de capacidad es una medida del tiempo de retención (tr ) en unidades de tiempo.
Separaciones razonables demandan que el factor de capacidad para todos los picos
deben estar en el rango 0,5-20. Si el factor de capacidad es demasiado pequeño el primer
pico es distorcionado por el frente del solvente. Si el factor de capacidad es demasiado
grande el tiempo de análisis es muy prolongado.
Cuando no se observa perturbación en la lı́nea base de un cromatograma el tiempo muerto
se puede estimar con la ecuación :
Ldc
tm = (5.1)
2F
Donde L = longitud de la columna
dc = diámetro interno de la columna
F = velocidad de flujo
En cromatografı́a en fase reversa el tm puede ser medido pasando un soluto no retenido

(por ej. uracil detectado a 260 nm) a través de la columna.
Para la cuantificación una resolución mı́nima entre dos picos vecinos de 1.5 es deseada.
Para mayor robustez una resolución de 2 es mucho mejor.
Otro criterio para una adecuada separación cromatográfica es no exceder la presión de
operación por encima de 15 MPa (150 atm) esto prolonga la vida de la bomba, válvulas,
sellos y el automuestreador.
Todos los picos que necesiten ser medidos deben ser simétricos con un factor de
asimetrı́a A/B en el rango de 0.9-1.5
58 E.Lans
5.6.1 Atributos de una buena separación

Para que se produzca una buena separación, se deben cumplir las siguientes condiciones:
′
1. 0,5 6 K 6 20
2. Resolución ≥ 2
3. 0.96 factor asimetrı́a 6 1.5
4. Presión de operación 6 15 MPa ( 150 atm)
5.7 Optimización con un solvente

Combinaciones de acetonitrilo, metanol y tetrahidrofurano(THF) con agua (buffer acuoso)
son muy adecuados para separar un gran número de compuestos por cromatografı́a en
fase reversa.
La primera mezcla a probar serı́a acetonitrilo y agua. El acetonitrilo tiene una vis-
cosidad baja que permite operar a presiones relativamente bajas, y permite detección UV
por debajo de los 190 nm.
A esta longitud de onda un gran número de analitos presentan absorción.
El metanol es el segundo solvente escogido por que tiene una alta viscosidad y un
cut-off(longitud de onda a la cual no hay absorción del solvente por parte del detector)
en el UV mas grande.
El THF es la tercera mezcla escogida por que tiene un rango menor utilizable en el
UV, es lentamente degradado por oxidación y se equilibra mas lentamente con la fase
estacionaria.
5.7.1 Orden de escogencia de un solvente orgánico

1. ACETONITRILO
2. METANOL
1
3. HF
1
El acetonitrilo es un reactivo peligroso por lo que sus desechos deben ser hidrolizados con acetato de
sodio y vertidos al drenaje.
5.8 Optimización con dos o tres solventes orgánicos

Cuando se requieren dos o tres solventes organicos, se requiere primeramente una opti-
mización, para ello se deben seguir los siguientes pasos:
Paso 1: Se optimiza la separación con acetonitrilo/buffer para generar un cromatograma
A.
Paso 2: Se optimiza la separación con metanol/buffer para generar un cromatograma
B.
Paso 3: Se optimiza la separación con THF/buffer, para generar un cromatograma
C. Paso 4: Se mezclan los solventes, de los pasos 1,2 y 3 en proporciones 1:1 para generar
los cromatogramas D, E y F.
Paso 5: Hacer una mezcla de acetonitrilo, metanol y THF en proporción 1:1:1 para
generar un cromatograma G.
Paso 6: Si alguno de los resultados mostrados en los cromatogramas de A a G, es
adecuado, selecciónelo.
Si la separación no se consigue con ninguno de los pasos anteriores es necesario que usted
pruebe una columna diferente u otra forma de cromatografı́a.(Harris 1999)
5.9 Temperatura como una variable en separaciones

isocrática
Cambiando la temperatura de la columna puede afectar la retención relativa de los difer-
entes compuestos en una mezcla, la temperatura tiene mucha influencia en compuestos
iónicos( cationes amonio, cationes carboxilatos)y moléculas con múltiples sustituyentes
polares.
Para elevadas temperaturas de operación, el pH debe estar por debajo de 6 para
retardar la disolución de la fase estacionaria de sı́lica.
5.9.1 ¿Como se consigue una buena separación?

Para hacer una buena separación se debe aumentar la resolución, para ello usted debe:
1. Disminuir la velocidad del flujo.
2. Incrementar la longitud de la columna.
3. Disminuir el tamaño de las partı́culas en la columna.

60 E.Lans
∆tr ∆tr
Resolución = = (5.2)
Wav 1.70w 1
2
∆tr = Separación entre picos

Wav =Promedio del ancho de la lı́nea base
W 1 =Promedio del ancho de pico a la mitad de la altura
2
Capı́tulo 6
CROMATOGRAFÍA DE FLUÍDOS
SUPERCRÍTICOS
6.1 Definiciones
La cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos es una técnicas se separación llamada tambieén
estracción supercrı́tica.La cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos tiene importancia por que
permite la separación y la determinación de un grupo de compuestos que no se pueden
analizar adecuadamente ni por cromatografı́a de gas ni por cromatografı́a lı́quida
Los fluı́dos supercrı́ticos combinan caracterı́sticas de gases y lı́quidos Ej.: los coeficientes
de difusión y viscosidad de los FSC son semejantes a la de los gases de arrastre en cro-
matografı́a de gas, mientras que sus densidades se aproximan a la de los lı́quidos.
Estos compuestos son los no volátiles o térmicamente lábiles a los que no se pueden aplicar
los procedimientos de cromatografáa de gas y aquellos que no contienen grupos funcionales
que hagan posible su detección por las técnicas espectroscópicas o electroquı́micas que se
utilizan en cromatografı́a lı́quida
En CFS es posible hacer variar tres condiciones que son similares a los que se hacen
variar en HPLC: Temperatura, composición del eluyente y la velocidad de la fase móvil
• Fluı́do supercrı́tico:Sustancia llevada mediante operaciones mecánicas a unas
condiciones operativas de presión y temperatura crı́tica.
• Temperatura crı́tica:Temperatura por encima de la cual no puede existir una fase
lı́quida independientemente de la presión.
• Presión crı́tica:Es la presión de vapor de una sustancia a temperatura crı́tica.
• Punto crı́tico:Temperatura y presión superiores próximas a la presión y temper-
atura crı́tica.
61
62 E.Lans
6.2 Carácterı́sticas de un fluı́do supercrı́tico

• Gran poder disolvente junto con una enorme capacidad de penetración en sólidos,
lo que permite el agotamiento rápido y prácticamente total de los sólidos extraı́bles.
• A diferencia en HPLC y GC en los FSC el aumento de presión a una temperatura

dada incrementa la densidad la cual aumenta la solubilidad de la mayorı́a de los
analitos.
Otra caracterı́stica de los FSC es que un aumento de temperatura a determinada presión

produce una menor densidad del fluı́do, lo que conduce a una menor solubilidad. Como
resultado, incluso cuando la temperatura y la composición del eluyente son constantes, la
caı́da de presión desde la entrada hasta la salida de la columna significa que las solubil-
idades de los analitos disminuye conforme estos avanzan por la columna. Para resumir
podemos decir que el método es menos sencillo que en GC y HPLC.
6.3 Analitos
En la actualidad la CFS no es tan popular como GC o HPLC. Es una técnica casi ideal
para realizar separaciones de algunos surfactantes y polı́meros. Se prefiere la CFS para
estos compuestos por que no es necesario la volatilización para obtener un gas, y la
transferencia de masas es un orden de magnitud mayor que en las fases móviles de HPLC.
Esto implica una reducción significativa del tiempo de análisis, pues logra un equilibrio
más rápido entre la fase móvil y la estacionaria.También se ha demostrado que CFS es
útil para separar algunos compuestos quirales. El orden de retención suele ser el mismo
que para HPLC quiral, pero las separaciones son mas rápidas.
6.4 Fase Móvil

La fase móvil en CFS se inicia en un cilindro de gas a alta presión, pero el fluı́do per-
manece comprimido y se calienta por encima de su temperatura critica, para ası́ obtener
condiciones supercrı́ticas. El dióxido de carbono es la fase móvil que se emplea con mayor
frecuencia, debido a su bajo costo, no es inflamable ni tóxico. Como no es polar se le
agregan modificadores polares para permitir el análisis de compuestos polares.
Los modificadores que se agregan con frecuencia incluyen metanol y etanol, para sustan-
cias básicas, aminas. Los gradientes en CFS se obtienen cambiando las condiciones que
modifican la solubilidad del analito en la fase móvil supercrı́tica.
Cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos 63
6.5 Cosolventes
Sustancia que se le agrega al sistema para aumentar la selectividad y el poder disolvente
del fluı́do, con caracterı́sticas similares a las del soluto. Se agrega en una concentración
mayor que la del soluto pero menor que la del disolvente.
Las diferencias de solubilidad de distintas sustancias en Fluı́dos supercrı́tico se deben a
las caracterı́sticas de los solutos sólidos tales como presión de vapor y a las interacciones
particulares que se establecen entre un soluto dado con el disolvente supercrı́tco.Como
consecuencia de esto moléculas muy parecidas pueden tener solubilidades muy diferentes
ej:La extraccón con CO2 supercrı́tico la cafeı́na de los granos del café y de la teo-
bromina de las hojas del té. Para el extracción de la cafeı́na el proceso es excelente
y no lo es ası́ para la extracción de la teobromina del té a pesar de que la única difer-
encia entre ambas moléculas es que donde tiene la teobromina un átomo de hidrogeno,
la cafeı́na tiene un grupo CH3 .La extracción de cafeı́na es uno de los procesos más ex-
itosos de extraccón supercrı́tica, mientras que la baja solubilidad de la teobromina en
CO2 supercrı́tico impide el uso de este proceso para extraerla. Cerca de 100, 000 toneladas
de café son tratadas anualmente con CO2 supercrı́tico para extrarerlo totalmente.
6.5.1 Fluı́dos usados para extracción supercrı́tica

Para la extracción en fluı́dos supercrı́ticos se utilizan las siguientes fases móviles: CO2 ,
H2 O, C2 H6 , C2 H4 ,C3 H8 ,Xe,N2 O.
El CO2 cuya temperatura crı́tica de 31, 2oC cercana a la ambiente, se convierte en el
disolvente apropiado para manejar sustancias lábiles a pesar de que sus propiedades como
disolvente son mucho más modesta que las del agua. Por ejemplo son insolubles en CO2 ,
incluso a altas densidades, las sustancias polares y muchas no polares. La solubilidad de
una sustancia en un disolvente supercı́tico es en general menor que en los lı́quidos con-
vencionales., esto se compensa por que cuando se emplean FSC la separación de soluto
y disolvente le logra eficientemente mediante un simple proceso de expansión. Esto evita
tener que aumentar la temperatura para eliminar el disolvente por evaporación, como
sucede con los disolventes adicionales.
Los procesos que emplean FSC son, en general, más caros que los convencionales debido
a costo de la etapa de compresión y del confinamiento de los fluı́dos.
6.6 Forma e inyección de la muestra

La introducción del liquido en CFS es similar a la inyección en HPLC. Las muestras en fase
gaseosa no son adecuadas para CFS. Los sólidos se extraen con los FSC y se concentra el
64 E.Lans
extracto. El tipo de muestra que se emplea en CFS con mayor frecuencia es una solución.
6.7 Columnas y fases estacionarias

Las columnas para CFS son prácticamente iguales a las de HPLC y algunas columnas en
GC. Son de acero inoxidable, y se empacan con partı́culas de 5 µm; los calibres pequeños
de 250 y 530µm son los mas comunes. Las fases estacionarias pueden ser del tipo que
se emplean en HPLC normal o fase reversa: sı́lica porosa, alúmina y sı́lica con grupos
orgánicos enlazados.
6.8 Detectores
Los detectores de gases FID y UV en HPLC deben estar construidos para funcionar
con el volumen relativamente grande de gas que se produce al despresurizar el fluı́do
supercrı́tico. Los detectores similares a los que se utilizan en HPLC se modifican para
tolerar las presiones necesarias para mantener a los fluı́dos supercrı́ticos.
6.9 Areas donde se utilizan los fluı́dos supercrı́tico

Un área de reciente interés en la aplicación de los FSC es la de los procesos de descon-
taminación o desctrucción de residuos tx́icos. Suelos o sedimentos fluviales con-
taminados con pesticidas, como DDT y otros contaminantes orgánicos han sido tratados
exitosamente con CO2 , mientras que fenoles y productos relacionados han sido extraı́dos
eficientemente de disoluciones acuosas.En lo relativo a los desechos tóxicos, el agua su-
percrı́tica presenta una ventaja respecto a la incineración, ya que esta última requiere
temperaturas hasta de 1, 200oC, provacando la emisión de sustancias que contaminan el
ambiente, entre ellos las dioxinas producidas por la incineración incompleta especialmente
las aromáticas policloradas.. Utilizando agua supercrı́tica a unos 500o C y en presencia
de un oxidante es posible quemar sustancias orgánicas completamente en una reacción
térmicamente autosostenida, produciendo sólo nitrógeno, dióxido de carbono y otras sus-
tancias inorgánicas. El inconveniente radica en la alta corrosividad del agua supercrı́tica
sobre los materiales utilizados, lo que obliga a utilizar aleaciones especiales encareciendo
el proceso.
Otrs áreas de utilización de FSC son los métodos analı́ticos separativos en cromatografı́a
utilizando fluı́dos supercrı́tico, obtención de productos naturales y alimenticios(extracción
de aceites vegetales y grasa de semillas, drogas de plantas, aromas,sabores, perfumes
Cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos 65
y especias, eliminación de nicotina del tabaco).separación de hidrocarburos pesa-

dos(desasfaltado de las fracciones pesadas del petróleo, recuperación y purificación de
lubricantes, licuefación del carbón etc.) regeneración(carbón activado, adsorbentes, fil-
tros y catalizadores)agua potable a partir de agua de mar(oxidación de corrientes
acuosas que contienen productos orgánicos).
Capı́tulo 7
ELECTROFORESIS
7.1 Introducción
Una separación electroforética se lleva a cabo inyectando una pequeña parte de la muestra
a una disolución tampón que está alojada en un tubo estrecho o en un medio de soporte
poroso y plano, como un tubo estrecho, papel o un gel semisólido. Seguidamente se aplica
un elevado potencial de corriente continua a través del tampón mediante dos electrodos
situados en los extremos del tampón. El potencial impulsa los iones de la muestra a migrar
hacia uno u otro extremo de los electrodos. La velocidad de migración de un especie dada
depende de su carga y su tamaño.
Las separaciones en consecuencia se basan en las diferencias en la relación tamaño-
carga entre los diferentes analitos presentes en la muestra.Cuanto mayor es esta relación
más rápido migra un ión en el seno del campo eléctrico. La separación se lleva a cabo en
un medio tamponado que actúa simultáneamente como conductor de la corriente eléctrica
y controlando o fijando la carga eléctrica de las sustancias a analizar
7.2 Electroforesis
El término electroforesis se emplea para describir aquellas técnicas de separación que se
basan en la diferente movilidad que tienen las partı́culas cargadas en el interior de un
campo electrico. Es un método de separación que se basa en la diferente velocidad de
migración de las especies cargadas, en el seno de una disolución amortiguadora, a través
de la cual se aplica un campo eléctrico constante.
El parámetro más importante de esta técnica es el campo electrico,(E) definido como
el voltaje aplicado por unidad de longitud del medio de separación, de acuerdo a esto
prodrı́amos decir que cuanto mayor sea el campo eléctrico aplicado mayor serı́a la res-
66
Electroforesis 67
olución que se podrı́a obtener, puesto que mayor serı́a al velocidad de migración de los
diferentes componentes de la muestra no obstante a campor eléctricos elevados, la corri-
ente eléctrica que circula por el medio de separación va a ser alta y como consecuencia
se va a generar una cantidad de calor. Este calor es un inconveniente por varias razones
a la hora de llevar a cabo una separación por que puede generar gradientes de temperat-
uras, flujos de convección del tampón que dificultarı́a la separación, desnaturalización de
proteı́nas o pérdidas de actividades enzimáticas etc.
Para solucionar estos problemas generados por el calor se han utilizado varios proced-
imientos, entre ellos trabajar a campos eléctricos bajos, pero podrı́amos obtener tiempos
de separación muy grandes y mala resolució. trabajar con medios anticonvectivos, como
los geles de poliacrilamida o garosa que de acuerdo a su naturaleza microporosa son re-
sistentes a la circulación del tampón. trabajar a campos eléctricos altos pero la separación
se da dentro de un capilar relleno de tampño esto último dió origen a la electroforesis
capilar
7.2.1 Tipos de electroforesis

Existen dos tipos de electroforesis, electroforesis capilar y la electroforesis convencional.
7.2.2 Electroforesis convencional

Es utilizada para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de interés biológico
y bioquı́mico.
En la electroforesis convencional, las separaciones se llevan a cabo sobre una capa del-
gada y plana o placa de un gel semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el
interior de sus poros. En estas placas se pueden separar varias muestras simultáneamente
como en cromatografı́a en capa fina. Las muestras se disponen como manchas o bandas
sobre la placa y se aplica el potencial de corriente continua, a través de la placa, durante
un perı́odo de tiempo fijo. Cuando creemos que las separaciones se ha completado se
interrumpe el paso de la corriente, y las especies separadas se tiñen para visualizarse.
La velocidad de migración de un ión en centı́metros por segundo, en el seno de un campo
eléctrico es igual al producto de la intensidad del campo eléctrico por la movilidad elec-
troforética.
ν = µe E (7.1)
E(V cm−1 )
µe (cm2 V −1 S −1 )
La µe (movilidad electroforética) es directamente proporcional a la carga del analito e
68 E.Lans
inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento. El potencial eléctrico

actúa sobre los iones por lo que se moverán a través del tampón. Las especies neutras no
se separan.
Para iones del mismo tamaño la fuerza impulsora será mayor en el de mayor carga,
y tendrá una movilidad de migración mas rápida. Para iones que tengan igual carga la
velocidad de migración será más rápida en el ión más pequeño. La relación tamaño-carga
de los iones cambiarán estos efectos.
7.2.3 Electroforesis capilar

La electroforesis convencional es lenta y laboriosa y además no proporciona resultados
cuantitativos precisos.
La electroforesis capilar da lugar a separaciones con volúmenes de muestra de 0.1 a 10
nL, contrario a la convencional que usa volumen de uL.
Aquı́ en vez de colorear, para identificar la sustancia se utilizan detectores cuantitativos
como los empleados en HPLC.
Velocidad de migración
La velocidad de migración depende de la intensidad del campo eléctrico aplicado. El
campo eléctrico (E) se determina por la magnitud del potencial aplicado (V en voltios) y
la longitud sobre la que se aplica.
V
ν = µe (7.2)
L
Factores que determinan la resolución en electroforésis capilar

• Número de platos:
En cromatografı́a tanto la difusión longitudinal como la transferencia de masas con-

tribuyen al ensanchamiento de la banda. Como en electroforésis está implicada una sola
fase, solo se considera la difusión longitudinal. Para electroforesis el número de platos
(N) viene dado por la siguiente expresión
V
N = µe (7.3)
2D
D = Coeficiente de difusión del soluto en cm−2 S −1
Como la resolución se incrementa al aumentar el número de platos, se debe aplicar un
Electroforesis 69
elevado potencial para obtener mayores separaciones. Observese que aquı́ el número de
plato no se incrementa con la longitud de la columna.
La electroforesis capilar genera normalmente un número de platos comprendido entre
100.000 y 200.000 comparados con los 5.000 y 20.000 obtenidos en HPLC.
• Flujo electroomóstico
Cuando se aplica un potencial elevado a través de un capilar que contiene un tampón, se
origina un flujo llamado, flujo electroosmótico, gracias al cual el solvente migra hacia el
ánodo o el cátodo.
La causa del flujo electroosmotico es la doble capa eléctrica que se forma en la interfase
sı́lice/disolución. Figura 7.1
A valores de pH por encima de 3 la pared interna de un capilar de sı́lice presenta
carga negativa debido a la ionización de los grupos silanoles (Si−OH) de la superficie.
Los cationes del tampón se agrupan sobre la superficie negativa de capilar de sı́lice para
formar la doble capa eléctrica.
Los cationes que están en la capa exterior de la doble capa, son atraı́dos hacı́a el cátodo,
y dado que los cationes están solvatados arrastran el resto de la disolución con ellos a lo
largo del capilar. La electroósmosis conduce un flujo en la disolución que tiene un perfil
plano, perpendicular al capilar, contrario del perfil parabólico del flujo en cromatografı́a
lı́quida, cuyo origen es la presión. Debido a este perfil plano el flujo electrosmotico no
contribuye al ensanchamiento de banda de manera significativa, como sı́ ocurre con el
flujo producido por la presión en HPLC. Figura 7.2.
Aunque los analitos migran según su carga dentro del capilar, la velocidad del flujo
electrosmotico es normalmente suficiente como para arrastrar todos las especies cargadas
positivamente, los neutros y los cargados negativamente hacia el mismo extremo del capi-
lar, de tal forma que todos ellos pueden detectarse al pasar por un punto común. El
electroforegrama es similar a un cromatograma. La velocidad de flujo electrosmotico
viene dada por una ecuación similar a la anteriormente vista, esto es:
ν = µeo E (7.4)
En presencia de la electroósmosis la velocidad de un ión es la suma de su velocidad de
migración y de la velocidad del flujo electrosmotico ası́:
V = (µeo + µe )E (7.5)
µe = En caso de un anión tendrá signo negativo
Como consecuencia de la electroósmosis, el orden de elución en una separación por elec-
troforesis capilar tı́pica es:
70 E.Lans
Figura 7.1: Flujo electroosmotico
Figura 7.2: Perfil del flujo electroosmotico

Electroforesis 71
Primero los cationes más rápidos, seguido de los más lentos, segundo las especies
neutras en una zona y finalmente los aniones. Figura 7.3
En algunos casos la velocidad de flujo electrosmotico no es lo bastante grande como
para superar la velocidad a la cual se mueven algunos aniones hacia el ánodo, en cuyo
caso estas especies se desplazan hacia el ańodo.
7.2.4 Cambio de sentido del flujo electroosmótico

Se logra agregando un tensoactivo catiónico al tampón. El tensoactivo se adsorbe sobre
la pared del capilar y hace que esta quede cargada positivamente. Ahora los aniones del
tampón se agrupan en las proximidades de la pared y son arrastrados hacia el ánodo,
electrodo positivo.
Esta estratagema se usa a menudo para acelerar la separación de los aniones.
El flujo electroosmotico puede ser eliminado recubriendo la pared interna del capilar con
un reactivo como el trimetilclorsilano para eliminar los grupos silanoles de la superficie.
7.3 Instrumentación
Consta de un capilar de sı́lice fundida con 10-100 µm de diámetro interno de 40 a 100
cm. de longitud y que está lleno de un tampón conectado entre si por dos recipientes que
contienen el mismo tampón, que también contienen dos (2) electrodos de platino.
La introducción de la muestra se lleva a cabo por uno de los extremos y la detección
por el otro extremo.Figura 7.4
7.3.1 Introducción de la muestra

Inyección electrocinética
Un de los recipientes del capilar se retira con su respectivo electrodo. Luego este extremo
es sumergido en el recipiente donde se encuentra la muestra y se le aplica un potencial
determinado hasta que la muestra penetre en el capilar debido a la actuación conjunta de
los fenómenos de migración iónico y flujo electroosmotico. Luego el extremo retirado se
coloca nuevamente en la solución tamp
on original donde se mantiene durante el proceso de separación.Figura. 7.5
Inyección por presión

Se retira un extremo del capilar y se introduce en el recipiente de la muestra, a la cual se le
aplica una diferencia de presión. Esta diferencia de presión proviene de aplicar vacio en el
72 E.Lans
Figura 7.3: Dirección del flujo electroosmótico
Figura 7.4: Componentes básicos de un sistema de electroforesis capilar

Electroforesis 73
Figura 7.5: Métodos de introducción de muestra
extremo del detector o de la aplicación de presión en el recipiente que contiene la muestra,

o bien por elevación del extremo que contiene la muestra. En ambos casos el volumen
inyectado se controla por la duración de la inyección. 5-50 nL son los mas comunes.
7.4 Sistema de detección

Los detectores son similares en diseño y función a los utilizados en HPLC. La diferencia
está en el comportamiento de éstos; en electroforesis capilar cada ión migra a una velocidad
determinada debido a su movilidad electroforética. Por tanto las bandas del analito llegan
al detector a diferentes velocidades, lo que hace que las áreas de los picos sean dependientes
del tiempo de retención. En cambio en HPLC todas las especies pasan a través del detector
a la misma velocidad de la fase móvil, ası́ que las áreas de los picos son independientes
de los tiempos de retención.
7.4.1 Métodos de absorbancia

El camino óptico para las medidas de absorbancia es muy pequeño, y para mejorar estas
medidas se han propuestos varios métodos.
1. a) Celda tipo Z de 3 mm: Se dobla el extremo del calpilar para aumentar el

camino óptico
74 E.Lans
2. b)Celda de tipo burbuja de 150 µm: Se forma una burbuja cerca del capilar
3. c) Celda de reflexiones múltiples: En el extremo del capilar se deposita un

recubrimiento de plata reflectante , y la radiación experimenta numerosas reflexiones
antes de salir del capilar. Figura.7.6
7.5 Modalidades de la electroforesis capilar

La electroforesis capilar es el nombre genérico para una familia de técnicas relacionadas
que tiene su origen en la electroforesis capilar por zona (CZE) y son: electroforesis capi-
lar por gel(CGE), enfoque isolectrico capilar(CIEF), cromatografı́a capilar miscelar elec-
trocinética (MECC) y la isotacoforesis capilar(CITP). Aunque las técnicas difieren sig-
nicativamente una de otras, se pueden llevar a cabo con la misma instrumentación básica.
7.5.1 Electroforesis capilar por zona (CZE)

La composición del tampón es constante en toda la zona de separación. El potencial
aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según
su propia movilidad y se separen en zonas.
7.5.2 Electroforesis capilar en gel (CGE)

Se lleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso, cuyos poros con-
tienen una mezcla tampón en la que se lleva a cabo la separación.
7.5.3 Isotacoforesis capilar

Las bandas de todos los analitos migran finalmente a la misma velocidad, por eso recibe
el nombre de ISO, igual y TACO velocidad. La razón por la cual todas las bandas se
mueven a la misma velocidad es que el potencial se hace mas reducido para las bandas
más móviles, y se hace mas intensa para las bandas mas lentas, de tal forma que la
corriente es la misma en todas las zonas del tampón. (A. & F.J 1999)
Electroforesis 75
Figura 7.6: Diseños de celda para mejorar la sensibilidad de detección por medida de absorbancia
aumentando el camino óptico
Bibliografia
A., B. & F.J, S. (1999), Chromatographic Methods, fifth edn, Kluwer Academic Publishers.
Esteban, L. (1993), La Espectrometrı́a de masas en imagenes.
Harris, D. C. (1999), Quantitative Chemical Analysis, Vol. 1, 5a edn, W.H.Freeman and

Company, New York.
McNair, H. M. & Miller, J. M. (1998), Basic Gas Chromatographic, 1 edn, John Wiley
and Sons, INC.
Skoog, D. A. & Holler, F. (1998), Principles of Instrumental Analysis, Vol. 1, fifth edition
edn, Harcourt Brace and Company, Orlando Florida.
76
Índice Alfabético
Adsorbentes, 20 TCD
Aplicaciones, 48 NPD, 32
Asimetrı́a, 8 Difusión, 68
Dioxinas, 64
Co-cromatografı́a, 37
Coeficiente de difusión, 14 Eficiencia, 10, 51
Coeficiente de partición, 6 Electroforéris
Columnas, 51 capilar por zona
empacadas, 28 en gel, 74
tubulares abierta, 26 Electroforésis
Columnas analı́ticas, 52 capilar, 68
Constante de distribución, 7 convencional, 66
Constante RF, 25 Eluato, 4
Cosolventes, 63 Elución, 52
Cromatografı́a, 1 Eluyente, 4, 22
capa fina, 20
Factor de capacidad, 4
de fluı́dos supercrı́ticos, 3
Fluı́do supercrı́tico, 61
de gases, 2
Flujo electrosmótico, 69
fase reversa
fuerza del eluente, 52
fase normal, 53
Fuerzas
lı́quida, 2
iónicas
plana, 2
enlaces de hidrógeno, 9
Cromatografı́a de adsorción, 54
repulsión
Cromatograma, 4
Van Der Walls, 9
cut-off, 58
Gradiente, 56
Desorción, 43
desorción, 41 Inyección
Detector, 45 on column, 36
FID por presión
ECD, 31 electrocinética, 71
Fotométrico de llamas, 33 split
77
78 E.Lans
splitless, 36 Temperatura crı́tica, 61

Ionización Tiempo
por bombardeo de átomos rápidos muerto
electrospray, 44 retención ajustado, 5
por campo, 43
quı́mica Van Deemter, 14
quimı́ca negativa, 41
ionización, 44
EI, 41
ionización impacto electrónico, 41
ionización por campo, 41
ionización quı́mica, 41
Isotacoforesis, 74
Isoterma, 16
Lábil, 63
Métodos
quı́micos
fı́sicos , 24
Masas, 40
Número de plato, 69
optimizacion con solventes, 58
Placas, 21
Plato teórico, 11
Presión crı́tica, 61
Punto crı́tico, 61
Resolución, 12, 57, 68

Resolución de una columna, 3
Retención relativa, 4
Separación, 1, 59
Solventes, 56
Supercrı́tico, 63
supercrı́tico, 64
Tailing, 8, 53
Tandem, 47

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1 una pulgada + \hoffset 2 una pulgada + \voffset

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Edineldo Lans Ceballos. M.Sc

Octubre 16 del 2013

2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 20

2.2.1 Proceso de adsorción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

5 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) 50

5.2.3 Cromatografı́a lı́quido-lı́quido o de partición . . . . . . . . . . . . . 53

6 CROMATOGRAFÍA DE FLUÍDOS SUPERCRÍTICOS 61

7.5.2 Electroforesis capilar en gel (CGE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

1.1 Cromatografı́a en columna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.1 Placa cromatográfica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.1 Diagrama esquemático de un cromatógrafo de gas . . . . . . . . . . . . . . 27

4.1 Ionización por impacto electronico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

5.1 Cromatografı́a fase inversa.(Fase móvil de baja polaridad) . . . . . . . . . 54

7.1 Flujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

7.4 Componentes básicos de un sistema de electroforesis capilar . . . . . . . . 72

Este tipo de métodos se clasifican como electroseparaciones.

1.1 Clasificación de los métodos cromatográficos

1.1.1 Cromatografı́a en columna

1.1.2 Cromatografı́a plana

1.2 Clasificación de los métodos cromatográficos en

1.2.1 Cromatografı́a de Gases

1.2.2 Cromatografı́a lı́quida

Figura 1.1: Cromatografı́a en columna

1.2.3 Cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos

1.3 Algunos términos y ecuaciones utilizados en cro-

1.4 Velocidades de separación

µ = velocidad lineal media del movimiento de las moléculas de la fase móvil

moles de analito en la fase móvil

1.5 Tiempo de retención Vs coeficiente de partición

1.6 Relación entre el tiempo de retención y la con-

1.8 Tipos de fuerzas que están presentes en un sis-

Figura 1.2: Asimetrı́a de un pico cromatografico

1.8.1 Interacciones iónicas

1.8.2 Fuerzas de enalce de hidrógeno

1.8.3 Fuerzas de repulsión

1.8.4 Fuerzas de Van Der Walls

2. Inducción (dipolo inducido-dipolo) o Debye

3. Dispersión (dipolo inducido-dipolo inducido)o London

1.9 Bases fı́sicas de la cromatografı́a

Donde H es la altura de plato,

De las ecuaciones anteriores podemos concluir que la altura de plato es la constante

Las alturas de platos en cromatografı́a de gas son aproximadamente de 0,1 a 1mm, en

1.9.2 Numero de plato teórico

Si usamos la achura de la altura media en vez de la base, entonces:

La ecuación anterior se deduce teniendo en cuenta la figura 1.3 y usando la anchura de la

El movimiento del soluto a través de la columna cromatográfica, se propaga en forma

Factores que afectan la resolución

Figura 1.4: Resolución de un cromatograma

se incrementa cuando aumenta α y el factor de capacidad K2, .

1.9.5 Ecuación de Van Deemter

Figura 1.5: Ensanchamiento de banda debido a la difusión

Figura 1.6: Aplicación de la ecuación de Van Deemter en cromatografı́a de gas

En electroforesis capilar tanto el término A como el C son 0 disminuyendo la altura

Una grafica de Cs versus Cm (a una temperatura dada) es llamada isoterma. Figura

Figura 1.7: Isotermas comunes y formas de las bandas

Figura 1.8: Silanización

Las columnas de vidrio o de sı́lice usadas en cromatografı́a de gas o lı́quida tambien

2. La retención relativa de dos compuestos en cromatografı́a de gas es 1,068 en una

31,1 respectivamente. Calcular el porcentaje de cada compuesto si las respectivas

La cromatografı́a en capa fina se basa en la preparación de una capa uniforme, de un

2.1 Ventajas de la cromatografı́a en capa fina