UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

PROYECTO DE TESIS

BIORREMEDIACIÓN DE Pb MEDIANTE UN CONSORCIO MICROBIANO

AISLADO A PARTIR DE LAS RAÍCES DE Eichornia crassipes

AUTORES:

FABIÁN POMA, Yenny

POLO CABRERA, Estéfani Celina

ASESOR:

Biol. Microbiol. Villanueva Carlos, José Manuel

NUEVO CHIMBOTE – PERÚ

2015
 PROYECTO DE TESIS

RESUMEN

Los metales pesados como el plomo son tóxicos en altas concentraciones tanto
para el ser humanos como la diversidad biológica, pero mediante la aplicación
de biorremediación es posible reducirlas, es así que la biorremediación es el
proceso por el cual los organismos vivos son empleados para la
descontaminación efectiva de un sistema. Una de ellas es usando un consorcio
microbiano aislado a partir de las raíces de la plata de Eichornia crassipes ya
que esta sirve como hospedera de diferentes microorganismos que tienen la
capacidad de bioabsorción y/o bioacumulación del metal en su biomasa,
aprovechando algunos nutrientes que les otorga la planta como el nitrógeno y
carbono para reducir el nivel de plomo existente en los desechos de dicha
planta de tratamiento de plomo. Para esto se procederá a sembrar Eichornia
crassipes en presencia de plomo para que luego se logre aislaran el consorcio
microbiano otorgándole las mismas condiciones en el laboratorio,
estableciendo su cinética y evaluando la eficacia biorremediadora del plomo a
diferentes concentraciones del relave minero proporcionado de la empresa
Denwood Holding S.A.C.
 I. GENERALIDADES

1.1. Título
BIORREMEDIACIÓN DE Pb MEDIANTE UN CONSORCIO MICROBIANO AISLADO A
PARTIR DE LAS RAÍCES DE Eichornia crassipes

1.2. Personal investigador

1.2.1. Autores:
 Fabián Poma Yenny
 Polo Cabrera Estefani

1.2.2. Asesor:
 Villanueva Carlo José Manuel

1.2.3. Co-asesores:
Padilla Sevillano Alejandro

1.3. Tipo de investigación

1.3.1. Por su propósito:

 Aplicada

1.3.2. Por su naturaleza:

 Explicativa

1.4. Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto

El presente proyecto se realizará en los laboratorios de microbiología del
departamento de E.A.P de Biotecnología y en las instalaciones de Instituto de E.A.P
Agroindustria

1.5. Cronograma de trabajo

Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre

Personas
Actividades
responsables 1s 2s 3s 4s 1s 2s 3s 4s 1s 2s 3s 4s 1s 2s 3s 4s 1s 2s 3s 4s 1s 2s 3s 4s

Planificación y Investigadores
elaboración y X X X X X
del proyecto asesor
Presentación y Investigadores X X X
aprobación del y
proyecto asesor
Investigadores
Recopilación
y X X X
de datos
asesor
Procesamiento Investigadores
X X X X X X X
y análisis y estadístico
Elaboración
del informe Investigadores X X X X X X
final
Período de actividades programadas por semanas

1.6. Recursos

1.6.1. Disponibles:

1.6.1.1. Recursos humanos.

 2 Tesistas
 Asesor
 Co-asesor

1.6.1.2. Bienes y servicios.

 Agua.
 Energía Eléctrica.

1.6.2. No disponibles:

1.6.2.1. Bienes. Servicios.

Código Descripción Nombre del recurso Cantidad Costo S/.

Papel bond A4 1 millar 60.00

Memoria USB de 4Gb 2u 65.00
Tinta para impresora Hp 2 cartuchos 120.00
Plumones de tinta indeleble 2u 6.00
Materiales de Correctores líquidos 2u 5.00
2. 3. 1 5 .1 2 escritorio Libreta de campo 2u 8.00
Lapiceros Faber Castell 4u 8.00
Calculadora 1u 50.00
Laptop 1u 1800.00
Tipeo e impresión 250 hojas 25.00
Fotocopiado 100 hojas 10.00
Servicios de Agua destilada 8l 75.00
2. 3. 2 2. 1
energía eléctrica, Cámara digital Sony 15 MPx 1u 450.00
agua y gas Depósitos de plástico de 3L. 3u 10.00
Viáticos y asignaciones de
2. 3. 2 1 .2 Viaje doméstico 2 50.00
desplazamiento
Servicio de
2. 3. 2 2. 2 3 Internet 90 días 180.00
internet
2. 3. 1 10. 1 Material biológico Adquisición de la planta E.crassipe. 10u 150
2
Análisis químico 10 1000
Total 4270.00
1.7. Presupuesto y financiamiento

Financiamiento Aporte (S/.) Participación (%)

U.N.S.
600.00 14.1
Recursos externos
Autofinanciamiento 3670.00 85.95
Total 4270.00 100

II. PLAN DE INVESTIGACIÓN

2.1. Antecedentes

Actualmente uno de los mayores problemas que afrontamos es el deterioro constante

del medio ambiente a causa de contaminantes que son vertidos sobre la superficie
terrestre y el agua. Muchos de estos contaminantes son metales pesados que, en
altas concentraciones, son tóxicos para el ser humano y demás organismos que
habitan el medio ambiente, trayendo como consecuencia una alteración en la vida
natural de los ecosistemas. (Núñez Chavez, 2007)
La determinación de metales pesados en el ambiente es de gran importancia, entre los
más importantes están el plomo y arsénico, la acumulación de estos en el organismo
humano causan enfermedades muy graves que pueden ocasionar la muerte. El plomo
ocasiona enfermedades como alternaciones neurológicas (disminución del coeficiente
intelectual infantil), nefroxicidad, anemia y cáncer de riñón. (Hernandez Picazo, 2014).
Por ello los avances tecnológicos para sanear ambientes contaminados por metales
tóxicos han conducido al desarrollo de alternativas que se basan en el empleo de
organismos vivos para prevenir o restaurar daños provocados por acciones
antropogénicas que alteran la estabilidad de los diferentes ecosistemas. En este
sentido, tenemos diferentes técnicas como la fitorremediación, lixiviación y la
biorremediación. (Marrero-Coto, Amores-Sánchez, & Coto-Pérez, 2012)
La Biorremediación es el proceso mediante el cual los microorganismos se estimulan
para degradar contaminantes orgánicos peligrosos hasta niveles ambientalmente
seguros en suelos, materiales subsuperficiales, aguas y lodos. Los microorganismos
utilizan los contaminantes como fuentes de alimentos y convierten los contaminantes
en biomasa y subproductos inocuos, tales como CO2 y sales inorgánicas. Los
microorganismos heterótrofos son los principales utilizadores de la materia orgánica en
la biosfera y son pieza clave en el ciclo del carbono del estado orgánico al inorgánico.
Si están presentes suficientes cantidades de nutrientes inorgánicos y hay un aceptor
final de electrones, eventualmente todas las sustancias inorgánicas pueden ser
degradadas. Para que exista biorremediación los microorganismos deben tener
actividad catabólica para degradar el contaminante a una velocidad razonable hasta
alcanzar los niveles de concentración que indican los estándares de regulación. El
contaminante debe ser biodisponible y las condiciones del suelo y el agua deben ser
tales que conduzcan al crecimiento de los microorganismos o plantas o al desarrollo
de su actividad enzimática. (Del Rio, 2009)
Los consorcios microbianos tienen mayor poder biodegradativo porque la información
genética que codifica al sistema enzimático del consorcio es más completa y por tanto
es más probable la degradación de las mezclas complejas de hidrocarburos presentes
en un área dañada. Además, se establece una compleja interacción entre las especies
microbianas: algunas atacan a un compuesto y otras culminan su degradación, por lo
que generalmente se consideran más eficientes que los cultivos puros. Los
consumidores primarios inician el proceso degradativo y los consumidores secundarios
se encargan de degradar completamente los productos generados por éstos. (Martín,
2011)
En el suelo, aire, agua, relaves mineros e hidrocarburos, en raíces de plantas que
sirven como hospederas o también que trabajan en simbiosis, los microorganismos se
encuentran en poblaciones mixtas, su identificación se consigue mediante el estudio
de cepas o consorcios aislados y cultivados. El estudio molecular conduce a la
identificación de los microorganismos, aún en poblaciones mixtas. La técnica que más
se ha utilizado para adaptar la biota edáfica al contaminante es el medio enriquecido y
se aplica antes de aislar a los microorganismos. Consiste en agregar una muestra de
suelo a un medio enriquecido que contiene los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios para los microorganismos. Las concentraciones y tipos de nutrientes
pueden variar en ésta técnica y el contaminante a degradar se añade como fuente de
carbono. (TiradoTorres, 2015)
Teniendo en cuenta esto es que, este trabajo está abocado a usar la técnica de la
biorremediación del plomo de la planta DENWOOD HOLINGS mediante un consorcio
bacteriano aislado de la planta de EICHORNIA CRASSIPES
Dentro de la localidad de Chimbote y a sus alrededores no se han aplicado técnicas de
fitorremediación, al menos con la planta que se hace mención no hay ningún trabajo
realizado.
Según (Ana Marlene Guerrero Padilla, 2013) el trabajo realizado en España tuvo como
objetivo determinar la concentración de plomo y cadmio por bioacumulación en
Brassica oleracea subsp. capitata (L.) Metzg. y Raphanus sativus L., regadas con
aguas a diferentes concentraciones de cada metal. Para ello se trabajó con 20 plantas
de B. oleracea subsp. capitata (L.) Metzg. y R. sativus L., con 14 días de desarrollo
vegetativo, trasplantadas aleatoriamente y de forma individual en pozas
experimentales con suelo homogenizado franco arenoso libre de metales plomo y
cadmio. Éstas, asimismo, fueron sometidas a tratamientos de 0, 150 y 300 mg/L de
cada metal con 4 repeticiones durante 60 días, se recolectaron muestras de suelo, raíz
y parte aérea de cada especie vegetal para los análisis correspondientes de plomo y
cadmio por espectrofotometría de absorción atómica Perkin Elmer. Los resultados con
un nivel de confianza del 95% refieren que en la parte aérea de B. oleracea subsp.
capitata (L.) Metzg., en la raíz de R. sativus L., y en el suelo donde fueron cultivadas,
existe diferencia estadísticamente significativa entre las concentraciones de plomo y
cadmio de un tratamiento a otro. Se concluye, por tanto, que en la parte aérea de B.
oleracea subsp. capitata (L.) Metzg., y en la raíz de R. sativus L., el plomo y el cadmio
se bioacumulan con mayor concentración en soluciones de 300 mg/L, lo que
demuestra que existe una relación direccional ascendente con las soluciones
concentradas de los diferentes tratamientos.
Un trabajo realizado en Costa Rica tuvo como objetivo de estudio evaluar in vitro la
resistencia de bacterias endófitas a diferentes concentraciones de plomo. El muestreo
se realizó en el primer semestre de 2013, durante el cual se colectaron muestras de
tejidos de variedades comerciales de arroz en etapa de macollamiento cultivadas en el
municipio de Montería, Córdoba, Colombia. Cada tejido fue sometido a proceso de
desinfección superficial. Se aislaron bacterias endófitas en medio de cultivo agar R2A;
a partir de cada tejido se determinó la densidad poblacional (UFC/g de tejido) por el
método de conteo sobre la superficie de medio R2A; la separación de morfotipos se
realizó mediante la forma, color, tamaño y apariencia. Un total de 168 morfotipos
fueron aislados de raíz, macolla y hoja de diferentes variedades comerciales de arroz.
La prueba de resistencia a plomo se realizó in vitro, para esto se prepararon
suspensiones de bacterias en fase log, se inocularon en medio mínimo con cinco
concentraciones de plomo en forma de Pb(NO3)2. El ensayo se llevó a incubación con
agitación por 150 rpm, a 32 °C por cinco días. Cada hora después de iniciado el
ensayo se realizó lectura de la turbidimetría a 600 nm. Las bacterias mostraron la
capacidad de crecer a concentraciones de 100% de Pb en forma Pb(NO3)2. La
identificación con el kit API20E confirmó la presencia de Burkholderia
cepacia y Pseudomonas putida, las cuales mostraron resistencia a diferentes
concentraciones de plomo. (Alexander Pérez-Cordero, 2015)
Un estudio se usó estrategias para la remediación de suelos contaminados con
metales pesados. Sin embargo, son pocos los estudios sobre remediación con plantas
de zonas áridas y su asociación con micorrizas. El objetivo de este estudio fue evaluar
la capacidad extractora de Plomo (Pb) y Cadmio (Cd) del quelite (Amaranthus hybridus
L.) al adicionar una mezcla de micorrizas arbusculares (Entrophospora columbiana,
Glomus intraradices, G. etunicatum, G clarum) al sustrato contaminado con Pb o Cd.
Los resultados indican que la adición de micorrizas incrementó significativamente
conforme la edad de la planta. (Ortiz, 2009),
Trabajos ya realizados establece que la a fitorremediación es la captación de metales
contaminantes por las raíces de las plantas y su acumulación en tallos y hojas, Las
plantas seleccionadas se pueden utilizar para extraer los metales de suelo, de agua y
de sedimentos. De la cual se logró demostrar que los mecanismos de fitotoxicidad por
plomo se relacionan con cambios en la permeabilidad de las membranas celulares,
reacciones de grupos sulfihidrilo (- SH) con cationes y con la afinidad para reaccionar
con grupos fosfato y grupos activos de ADP o ATP22. Este autor afirma que la
toxicidad que causa el plomo hacia una especie de planta, varía en la longitud de la
raíz no se ve afectada por la concentración de plomo y la mayor concentración se da
en las raíces secundarias (Ruiz, 2012).
Un estudio demostró, que seleccionar una cepa que pueda servir como biosorbente
microbiano, se reactivaron 122 cepas aisladas en ambiente minero, a las que se les
probó la resistencia a metales pesados, velocidad de crecimiento y capacidad de
producción de biomasa. En base a estos parámetros se seleccionó la cepa de Serratia
marcescens M8A-2T para optimizar los parámetros físico químicos de remoción de
cadmio y plomo, la naturaleza física y genética de la resistencia, así como la
confirmación de la identificación de la cepa empleando el gen del RNAr 16S. Los
resultados, indican que la cepa es apta para ser empleada en procesos de
bioadsorción de cadmio y plomo y que el proceso está optimizado para su
escalamiento a nivel piloto. (Moreno, 2015)
Dentro de la provincia de Huaraz, el distrito de Chimbote y alrededores no se ha
encontrado ningún estudio realizado de biorremediación con utilización de consorcios
bacterianos aislados de la raíz de la planta Eichornia crassipes

2.2. Justificación del problema

Durante mucho tiempo diversas industrias y actividades humanas han contaminado las
aguas con desechos muy nocivos. Los metales pesados pueden convertirse en
contaminantes si su distribución en el ambiente se altera mediante actividades
humanas. La liberación de efluentes industriales, emisiones vehiculares, actividades
agrícolas, extracción de minerales y el refinamiento de productos mineros son
consideradas las principales fuentes de contaminación por metales pesados en los
ecosistemas terrestres, acuáticos y aéreos. A diferencia de los contaminantes
orgánicos, el impacto ambiental de la contaminación por metales se acentúa por estos
no ser biodegradables. Su permanencia en los ecosistemas provoca diversos y
agudos efectos en la biota. (Caldelas, Iglesia-Turiño, Araus, Febrero, & Bort, 2008)
El consorcio microbiano como excelente agente remediador de metales pesados,
conocida por su capacidad de eliminación de contaminantes del agua. Es por ello que
esta tesis está evocada a la aplicación dicha técnica en la degradación de metales
pesados especialmente del plomo, de los efluentes mineros de la localidad de Caráz
ubicada en la parte del Valle Interandino del Callejón de Huaylas desarrollado a ambas
márgenes del Río Santa, entre la Cordillera Blanca y Negra. Ante ello se ha planteado
el siguiente problema: ¿En qué medida utilizando un consorcio microbiano aislado de
las raíces de Eichornia crassipes se puede biorremediar el plomo proveniente de la
planta minera Denwood Holdings?

2.3. Importancia

La biorremediación es importante porque con el uso de microorganismos se pueden

degradar a los agentes dañinos. éste utiliza mecanismos de recuperación, como
bacterias y hongos y algunas plantas. (Remtavares, 2010) En los ambientes naturales,
el consorcio microbiano posee una notable capacidad de adaptación, incluyendo la
capacidad degradativa de compuestos contaminantes lo que se favorece por su
integración en poblaciones dentro de una comunidad. (Sanchez & Rodriguez Gallego)
Es por ello que el consorcio de microorganismos aislados de las raíces lirio acuático
(E. crassipes) podría aprovecharse como biorremediador. Debido a que la tecnología
de biorremediación es específica para la degradación de metales pesados en este
caso el plomo, en este estudio se valorará el uso potencial de consorcios microbianos
para que el grado de contaminación sea reducido y no traiga consigo agravios a la
flora y fauna de la localidad perteneciente de los efluentes mineros.

2.4. Objetivos:

2.4.1. Objetivo general

  Biorremediar la concentración de plomo de planta Denwood
Holdings mediante un consorcio microbiano aislado de las
raíces de la planta Eichornia crassipes.

2.4.2. Objetivos específicos

 Obtener un consorcio microbiano aislados a partir de las raíces de
Eichornia crassipes.
 Establecer la capacidad de absorción de Pb mediante el consorcio
microbiano aislado de las raíces de la planta E. crassipes.
 Cuantificar la biodegradación y efectividad del consorcio microbiano
en la biorremediación de Pb a diferentes concentraciones.

2.5. Hipótesis
Se esperaría que utilizando el consorcio microbiano aislado de las raíces la
E. crassipes se lograría biorremediar el Pb del relave minero provenientes
de la planta de Denwood Holings.
2.6. Diseño experimental
El diseño del proyecto es un experimento puro, donde se va manipular las variables
independientes correspondientes para analizar su consecuencia con respecto los
variables dependientes.
El tipo de diseño está determinado por una pre prueba, post prueba y grupo control:
 Se evaluará si la asignación aleatoria fue acertada respecto al control
 Se medirá la diferencia en puntuaciones entre la pre prueba y la pos
prueba

ANTES MANIPULACIÓN DESPUÉS

RG1 Pre prueba X1 Pos prueba

RG2 Pre prueba X2 Pos prueba

RG3 Pre prueba X3 Pos prueba

RG Pre prueba --- Pos prueba

MUESTRA (ml) H2O (ml)

RG1 700 300

RG2 500 500

 RG3 300 700

RG 0 1000

El tratamiento efectuado para biorremediación de plomo de relaves mineros con el

consorcio microbiano será de mil mililitros de dicho relave minero, la cual tendrá una
pre prueba (análisis) para ver cuál es la concentración del plomo inicial, luego serán
distribuido en tres diferentes diluciones de acuerdo al cuadro anterior, llevado a cabo
el tiempo de absorción se realizará una pos prueba (análisis) del relave minero.
El número de repeticiones será 3 veces para cada tratamiento.
Población:
Las plantas mineras del departamento de Áncash.
Muestra:
La planta minera Denwood Holdings que se encuentra en Caráz, ubicada en la parte
del Valle Interandino del Callejón de Huaylas desarrollado a ambas márgenes del Río
Santa, entre la Cordillera Blanca y Negra.

2.7. Estrategia de trabajo

Material biológico:
La planta de Eichornia crassipes será recolectada de los estanques de Biología en
Acuicultura pertenecientes a la Universidad Nacional del Santa.
Eichornia crassipes será sometida a un medio de adaptación en el relave minero a una
sola concentración del 50% cada componente hasta obtener la planta más resistente.
Relave minero (ml) Agua destilada (ml)
Eichornia crassipes 1000 1000

Aislamiento de consorcio microbiano

El consorcio microbiano será asilado de las raíces de la Eichornia crassipes una vez
ya acondicionada y siendo estable su crecimiento en el relave minero.
El medio de cultivo agar relave fresco más parte de la muestra original, aproximado el
25%
Cuantificación de relave minero
La cuantificación de plomo y metales de la muestra serán analizadas por un
espectrofotómetro de absorción atómica (EAA) Perkin Elmer Analyst.
Se realizara un primer análisis de la muestra en bruto, en su estado original.
Después del tratamiento al relave minero, se realizara un segundo análisis, para
establecer el porcentaje de disminución de plomo en la muestra tratada a comparación
de la muestra original.
Evaluación de cinética del consorcio microbiano.
Después de haber aislado el consorcio microbiano, a este se le evaluará la cinética de
crecimiento, estableciendo una curva de calibración para denotar la fase con mayor
estabilidad en la degradación de plomo. Para ello se utilizara un medio, caldo nutritivo
y como fuente de sales minerales un porcentaje del mismo relave minero para que
puedan degradar los metales pesados.
Tratamiento del relave minero
Una vez establecido la cinética del consorcio microbiano, se realizara el tratamiento
con el relave minero a diferentes concentraciones.
Para ello se prepara las tres diferentes concentraciones en matraces de 1L cada uno,
en la cual se inoculara el consorcio microbiano a los mismos.
Ya inoculado se procederá a colocarlo en el Shaker a una temperatura ambiente
controlada por 48 horas.
La toma de muestras será cada 12 horas y se evaluara en un espectrofotómetro,
estableciendo puntos donde se establecerá la actividad degradadora del consorcio
microbiano.
Una vez culminado el tratamiento se evaluara las diferentes concentraciones tratadas
mediante espectrofotometría de absorción atómica, para determinar el porcentaje de
disminución de plomo presente en el relave minero.
Análisis estadístico
Los datos obtenidos serán analizados usando el diseño inferencial, método ANOVA.

2.8. Referencias bibliográficas

Alexander Pérez-Cordero, Z. B.-R.-P. (28 de Octubre de 2015). Portal de revistas

académicas. Obtenido de Identificación de bacterias endófitas resistentes a
plomo, aisladas de plantas de arroz.:
http://revistas.ucr.ac.cr/index.php/agromeso/article/view/19281/19375
Ana Marlene Guerrero Padilla, M. H. (21 de Noviembre de 2013). BIOACUMULACIÓN
DE PLOMO Y CADMIO EN Brassica oleracea SUBSP. CAPITATA (L.) METZG.
Y Raphanus sativus L. Obtenido de SCIÉNDO:
http://revistas.unitru.edu.pe/index.php/SCIENDO/article/view/849
Caldelas, C., Iglesia-Turiño, S., Araus, J. L., Febrero, A., & Bort, J. (24 de Julio de
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Residuos: http://www.redisa.uji.es/artSim2008/agua/A4.pdf
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http://www.madrimasd.org/blogs/remtavares/2010/03/22/131435
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