Introdução

Polissacarídeos, também conhecidos como glicanos, são polímeros de média a alta

massa molecular e constituem a maioria dos carboidratos encontrados na natureza. O que
diferencia os polissacarídeos entre sí são suas unidades monossacarídicas, os tipos de
ligação que as unem, o comprimento de suas cadeias e o grau de ramificação. Dentre os
polissacarídeos há os homopolissacarídeo e os heteropolissácarideo. Os
homopolissacarídeo contém apenas um único tipo de unidade monomérica enquanto que
os heteropolissacarídeos contém dois ou mais tipos diferentes.

O amido (Figura 1) é um homopolissacarídeo, pois contém como unidade

monomérica a glicose apenas. Esta, no entanto, forma dois tipos de polímeros – a amilose
e a amilopectina. A amilose é formada por cadeias longas e não-ramificada de unidades
de D-Glicose unidas por ligações (α1à4). A amilopectina, entretanto, contém um alto grau
de ramificações nos quais as ligações glicosídicas nos pontos de ramificações são (α1à6).

Figura 1: Estrutura do polissacarídeo amido.

Com aquecimento, ocorre hidrólise das ligações glicosídicas que constituem o

amido. Porém, além da ação da temperatura, é necessária também a ação de catalizadores,
podendo ser catalise ácida ou enzimática. Com o tempo de hidrólise do amido são
formados intermediários de dextrinas e oligossacarídeos, porém, o produto final da
hidrólise ácida é a glicose.
Assim, um possível teste qualitativo e quantitativo é o teste com iodo, onde as
dextrinas desenvolvem diferentes colorações, dependendo do tamanho, podendo dar
coloração azul ou púrpura, as de tamanho intermediário dão coloração avermelhada e as
menores não desenvolvem cor em presença do iodo.
Outro teste utilizado para acompanhar a reação de hidrólise do amido é pela reação
com 3-5-dinitro-salicilato (DNS), sendo utilizada para dosagem dos açúcares redutores,
que são produzidos na hidrólise. Sabendo que o produto final de hidrolise do amido é a
glicose, esta por sua vez, reduz o corante 3,5-dinitro-salicilato à 3- amino- 5 nitro -
salicilato, produzindo uma coloração alaranjada, na qual, quanto maior a concentração de
açúcar redutor presente no meio da reação, mais intensa é a coloração.
Em geral, os monossacarídeos atuam como bons agentes redutores, podendo ser
oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves como íons férrico (Fe3+) ou cúprico
(Cu2+). O carbono do grupo carbonila é o responsável pela reação de oxido-redução,
sendo este grupo oxidado a carboxila. No caso da glicose ocorre a oxidação à gliconato.
Esses monossacarídeos são chamados de açucares redutores. (Figura 2)

Figura 2- Representação da reação do DNS com açúcares redutores.

OBJETIVOS

· Demonstrar que um polissacarídeo (amido) pode ser hidrolisado com a produção

de açúcares redutores.
· Verificar os diferentes tipos de catálise: por ação de ácido e enzima específica
(α amilase salivar).
· Verificar através de reações específicas o desaparecimento do amido e o
concomitante aparecimento de açúcares redutores durante o curso da hidrólise.
· Elaborar curvas de tempo para a hidrólise ácida como para a enzimática, através
da dosagem de açúcares redutores formados.

III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

1. Curva de calibração para dosagem de açúcar redutor pelo método 3-5-dinitro-salicilato.

 Numerou-se 6 tubos de ensaio de 1 a 6 e preparou uma curva padrão de glicose.
As concentrações de padrão de glicose foram: 0,0 mg (branco), 0,2 mg; 0,4 mg; 0,8 mg;
1,6 mg e 2,0 mg. Aqueceu em banho-maria fervente por 5 minutos, resfriou os tubos e
acrescentou a cada tubo 7,5 mL de água destilada, homogeneizando-os bem. Realizou a
leitura das absorbâncias em 540 nm.

2. Hidrólise ácida do amido

Preparou duas baterias com 7 tubos de ensaio cada, identificando os tubos como
Branco, T0, T5, T10, T20, T40, T50. A primeira bateria foi utilizada para o teste do iodo,
colocando em cada tubo 3 gotas de lugol e 10 mL de água destilada. Na segunda bateria
que foi utilizada para dosagem de açúcares redutores colocou-se 1,3 mL de água destilada
e 1,0 mL de reativo DNS.Após as baterias prontas, colocou 5 mL de solução de amido
em um tubo de ensaio seco e limpo e levou-o a um banho-maria fervente por 5 minutos.
Retirar o tubo do banho-maria e adicionou 0,2 mL de ácido clorídrico. Homogeneizou e
imediatamente retirou 0,2 mL para o teste do iodo e 0,2 mL para o teste de açúcares
redutores, transferindo esses volumes para tubos previamente identificados como tempo
zero ( T0 ) da reação. Imediatamente após a retirada das alíquotas do tempo zero,
recolocou o tubo de hidrólise no banho fervente e manteve no banho até o final do
experimento, com a pipeta dentro do tubo. Em seguida, nos tempos 5, 10, 20, 40 e 50
minutos de hidrólise, retirou novas alíquotas de 0,2 mL para os testes de iodo e 0,2 mL
para dosagem de açúcar redutor, transferindo as alíquotas para os respectivos tubos de
ensaio previamente identificados. Após a retirada de todas as alíquotas, aqueceu os tubos
referentes à segunda bateria (dosagem para açúcares redutores) em banho-maria fervente
por 5 minutos. Resfriou os tubos, acrescentou 7,5 mL de água destilada a cada tubo,
homogeneizou bem e leu a absorbância em 540 nm.

V. RESULTADOS E DISCUSSÕES

1. Curva de calibração para dosagem de açúcar redutor pelo método 3-5-di-nitro-salicilato.

Para montagem da curva de calibração, preparou 6 amostras de padrão de glicose

em diferentes concentração. Após aquecer em banho-maria fervente por 5 minutos para
acelerar a reação de redução do açúcar, resfriou os tubos e acrescentar a cada tubo 7,5 mL
de água destilada, homogeneizando-os bem e, em seguida, mediu a absorbância das
soluções em 540 nm. Traçou-se o gráfico (Absorbância) vs (mg de glicose) (figura 1):

1,2 Equation y = a + b*x

Weight No Weighting
Residual Sum of 0,0169
Squares
Pearson's r 0,9913

1,0 Adj. R-Square 0,97835

Value Standard Error
B Intercept -0,03806 0,04014
B Slope 0,54447 0,03614

0,8
absorbância

0,6

0,4

0,2

0,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Solução padrão Glucose (mg)

Figura 1. Curva de Calibração – Padrão Glicose

A partir da curva de calibração, traçou-se o ajuste linear obtendo a equação da reta:

Y = 0,03806 + 0,54447 X

A equação anterior pode ser aplicada a Lei de Beer, no qual a absorbância medida
é proporcional à concentração da espécie analisada de acordo com a equação: A=εbc, em
que A= absorbância, ε=constante de absortividade molar, b= distância do caminho ótico
(cm) e c= concentração.

2. Hidrólise ácida do amido

Foram realizadas duas baterias de testes, cada uma contendo 7 tubos de ensaio,
identificando cada bateria como Branco, T0, T5, T10, T20, T40, T50. A primeira bateria
foi utilizada para o teste do iodo, diluindo lugol em água deionizada. A segunda bateria
 foi utilizada para dosagem de açúcares redutores, portanto adicionou reativo 3,5-dinitro-
salicilato (DNS) diluindo-o em água.
Após as baterias prontas, preparou-se a solução de amido levando-o em banho-
maria fervente. Após, retirou o tubo contendo a solução de amido do banho-maria e
adicionou o ácido clorídrico para facilitar a hidrolise. Imediatamente após homogeneizar,
retirou 0,2 mL para o teste do iodo e 0,2 mL para o teste de açúcares redutores,
transferindo esses volumes para os tubos T0, sendo referente ao tempo zero de reação. O
mesmo foi feito para os tempos 5, 10, 20, 40 e 50 minutos de hidrólise.
A quantidade de açúcar redutor formado (em mg de glucose) no curso da hidrólise
foi calculado utilizando a equação obtida na curva de calibração e, em seguida, traçou um
gráfico mg de glicose vs tempo.
Tabela 1. Dados obtidos nos testes da hidrolise ácida do amido

Tubo nº 1 2 3 4 5 6 7
Tempo (min) (branco) 0 5 10 20 40 50
Teste do iodo (branco) marrom castanho amarelo amarelo Amarelo amarelo
Dosagem do
açúcar redutor (branco) 0,076 0,205 0,516 0,692 0,983 0,678
(Absorbância)
Dosagem do
açúcar redutor (branco) 0,204 0,434 1,00 1,331 1,902
(mg de glicose)
 2,0

1,8

1,6

1,4

1,2
absorbância

1,0

0,8 y = Intercept +
Equation B1*x^1 + B2*x^
0,6 Weight 2
No Weighting
Residual 0,09631
Sum of
0,4 Squares
Adj. R-Squar 0,9176
Value Standard Err
0,2 B
B
Intercept
B1
0,11703 0,14428
0,00159 2,86941E-4
B B2 -3,85291E- 9,23819E-8
0,0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
tempo (s)

Figura 2. Valores de absorbância das soluções de amido após hidrólise ácida

O amido é um polissacarídeo no qual sofre hidrolise liberando glicose. A reação

de hidrolise somente é favorável aquecendo em meio ácido. O ácido favorece juntamente
com o aquecimento favorece sua hidrolise.
Com o passar do tempo de hidrólise são formados produtos intermediários como
dextrinas e oligossacarídeos, no entanto, o produto final da hidrólise ácida é a glicose. As
dextrinas, dependendo do seu tamanho, desenvolvem diferentes colorações com o iodo:
as dextrinas maiores podem dar cor azul ou púrpura, as de tamanho intermediário dão
coloração avermelhada e as menores não desenvolvem cor, em presença do iodo. Assim,
na primeira bateria (Teste do iodo) observamos que no inicio da reação (T0) a solução
apresentou coloração marrom devido a presença desse intermediário. Com 5 minutos
apresentou uma coloração levemente castanha, pois ainda havia uma pequena fração do
intermediário no meio. Porém, a partir de 10 minutos de reação a solução apresentou
coloração amarelo claro referente ao lugol, portanto, o intermediário não estava mais
presente na solução.
A segunda bateria foi realizado dosagem do açúcar redutor utilizando DNS. A
glicose – monossacarídeo liberado pela hidrolise do amido – atua como um potente agente
 redutor, atuando na oxidação do corante 3,5-dinitro-salicilato à 3- amino- 5 nitro –
salicilato. Sua oxidação é evidenciada pela coloração alaranjada. A partir dos valores de
absorbância, calculou-se a concentração de glicose nas soluções. Nota-se que a
concentração de glicose aumenta com o passar do tempo, indicando um avanço na reação
de hidrolise.

3. Hidrólise enzimática do amido

Assim como na hidrolise ácida na hidrolise enzimática do amido realizou duas

baterias de teste – teste do iodo e dosagem do açúcar redutor. Os dados estão organizados
na tabela abaixo:
Tabela 2. Dados obtidos nos testes da hidrolise enzimática do amido

Tubo nº 1 2 3 4 5 6 7
Tempo (min) (branco) 0 5 10 20 40 50
Teste do iodo (branco) azul amarelo amarelo amarelo Amarelo amarelo
Dosagem do
açúcar redutor (branco) 0,141 0,164 0,1114 0,093 0,080 0,140
(Absorbância)
Dosagem do
açúcar redutor (branco) 0,301 0,4 0,262 0,242 0,223 0,331
(mg de glicose)
 0,18

0,16

0,14
absorbância

0,12 y = Intercept +
Equation
B1*x^1 + B2*
Weight x^2
No Weighting
Residual 1,24527E-4
0,10 Sum of
Squares
Adj. R-Squar 0,95945
Value Standard Err
B Intercept -0,2306 0,07794
B B1 1,9124 0,51658
0,08 B B2 -2,3242 0,82747

0,24 0,26 0,28 0,30 0,32 0,34 0,36 0,38 0,40 0,42
glicose (mg)

Figura 3. Valores da conc. das soluções de amido após hidrólise enzimática.

Utilizou a enzima amilase salivar para catalisar as reações de hidrolise do amido.

A reação de hidrólise é acompanhada através da (1) degradação dos polissacarídeos e pelo
(2) aumento do poder redutor. A degradação dos polissacarídeos (1) foi acompanhada
pela reação com iodo enquanto que o aumento do poder redutor (2) foi acompanhado pela
reação com o 3-5-di-nitro-salicilato.
Nota-se através das duas baterias de testes que a catalise enzimática é muito mais
eficiente do que a catalise ácida. Na primeira bateria (teste do iodo) cessou a identificação
do intermediário com 5 minutos de reação, enquanto que na catalise ácida o mesmo foi
observado com 10 minutos. Com relação a segunda bateria o mesmo foi observado. Pois
se notou maiores valores de absorbância comparando amostras das duas baterias no
mesmo tempo de reação. Sabendo que a absorbância medida foi referente ao corante DNS
na forma oxidada, e sabendo que sua redução se deve a glicose, conclui-se que os maiores
valores de absorbância indicam maiores concentração de glicose no meio e, portanto,
maior velocidade de hidrolise do amido. Dessa forma, conclui-se que a catalise
enzimática é muito mais eficiente do que a catálise ácida.
CONCLUSÃO

O amido como um polissacarídeo pode ser hidrolisado fornecendo seus

monômeros constituintes, neste caso, a glicose. Alguns fatores influenciam na velocidade
da reação como, por exemplo, altas temperaturas e o uso de catalisadores. Os tipos de
catalise estudados na presente prática foram: catalise ácida e catalise enzimática. Os
fatores estudados foram a velocidade que o intermediário desaparece, indicando que a
reação se completou (teste do iodo) e a velocidade de formação da glicose, um açúcar
redutor, no qual atua na redução do corante DNS, sendo sua redução indicada pela
coloração alaranjada. Dessa forma, com base nos dados obtidos, nota-se uma maior
eficiência da catalise enzimática quando comparada com a catálise ácida.

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

1) Roteiro de Bioquímica I – 6ª aula prática: HIDRÓLISE ÁCIDA E ENZIMÁTICA DE UM

POLISSACARÍDEO.

2) Nelson, D. L.; Cox, M. M. Lehninger Princípios de Bioquímica – 4 ed. – São Paulo: Sarvier.
2006.