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LINEA DE INVESTIGACIÓN
Biotecnología
DELIMITACION DE LA INVESTIGACION
Área: BQPI17
Subárea: Agrícola
Sector: Plantas
Subsector: Metabolitos vegetales
EJECUCIÓN
Autor: Eliana Catalina Ramos Lalaleo
Tutor: PhD. Orestes López
Unidad Ejecutora: Laboratorio de Unidad Operativa de la Dirección de Investigación y
Desarrollo (UODIDE-ICIA), FCIAL, UTA.
Periodo: septiembre 2018 – febrero 2019
Lugar y Fecha de presentación: Ambato, 19 de diciembre de 2018
FINANCIAMIENTO
Costo total estimado: $720
Aporte personal: $720
.............................................
Eliana Catalina Ramos Lalaleo
i
UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS
CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
Ambato – Ecuador
2018
ii
1. TEMA DE INVESTIGACIÓN ............................................................................................. 1
2. JUSTIFICACIÓN.................................................................................................................. 1
3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 2
3.1. Objetivo General ........................................................................................................... 2
3.2. Objetivos específicos..................................................................................................... 2
4. FUNDAMENTACIÓN CIENTÍFICO TÉCNICA ................................................................ 3
4.1. Descripción de la planta ................................................................................................ 3
4.1.1. Brassica oleracea fo. rubra................................................................................... 3
4.1.2. Taxonomía............................................................................................................. 4
4.1.3. Compuestos fitoquímicos en (Brassica oleracea fo. rubra) ................................. 4
5. METODOLOGÍA ................................................................................................................. 5
5.1. Trabajo de campo .......................................................................................................... 5
5.1.1. Recolección de la planta ........................................................................................ 5
5.2. Trabajo de laboratorio ................................................................................................... 5
5.2.1. Preparación del material vegetal ........................................................................... 5
5.2.2. Obtención de extractos vegetales líquidos .......................................................... 65
5.2.3. Determinación de sólidos totales ......................................................................... 65
5.2.4. Análisis por espectrofotometría............................................................................. 6
5.2.5. Determinación de condiciones óptimas de extracción ........................................ 76
5.2.6. Microencapsulación ............................................................................................ 76
5.2.7. Evaluación de la actividad antioxidante .............................................................. 76
6. RECURSOS ........................................................................................................................ 98
6.1. Recursos humanos ....................................................................................................... 98
6.2. Recursos institucionales .............................................................................................. 98
6.3. Recursos materiales ..................................................................................................... 98
6.4. Recursos tecnológicos ................................................................................................... 9
6.5. Recursos económicos ................................................................................................ 109
Tabla 1. Recursos económicos .............................................................................................. 109
7. CRONOGRAMA ................................................................................................................ 10
Tabla 2. Cronograma de actividades ....................................................................................... 10
Figura 2: Cronograma de actividades ..................................................................................... 11
8. BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................. 12
0
1. TEMA DE INVESTIGACIÓN
2. JUSTIFICACIÓN
Las frutas y vegetales rojos, morados y de color azul se han utilizado tradicionalmente por sus
efectos beneficiosos; . Estas plantas poseen un color característico, debido a la presencia de
antocianinas, las cuales han sido ampliamente estudiadas por sus valores medicinales (Khoo,
Azlan, Tang, & Lim, 2017). Una de las plantas con abundante cantidad de antocianinas es el
repollo rojo o morado ( Brassica oleracea fo.rubra), Este un cultivo nativo de la región
mediterránea de Europa, que en la actualidad se cultiva como un vegetal de mercado fresco en
todo el mundo (Song, H., Yi, H., Lee, M., Han, C.-T., Lee, J., Kim, H., … Hur, Y. 2018). Las
verduras crucíferas, en particular las incluidas en el género Brassica, son una parte importante de
la dieta del ser humano, porque le. Así, proporcionan gran cantidad de nutrientes y compuestos
bioactivos (Sotelo, Cartea, Velasco, & Soengas, 2014).
Por su parte, las antocianinas extraídas de plantas comestibles son ingredientes farmacéuticos
potenciales, ya que poseen efectos antidiabéticos, anticancerígenos, antiinflamatorios,
antimicrobianos y antiobesidad., Tambiénademás, pueden mejorar la función visual y también
ayudar en la prevención de enfermedades cardiovasculares ( Khoo, H. E., Azlan, A., Tang, S. T.,
& Lim, S. M. 2017). Se han publicado investigaciones sobre las propiedades de la col lombarda
como hepatoprotector, estabilizadora de membrana y neuroprotectora, en la que su potencial
terapéutico es atribuido a su alto contenido de antocianinas (Jana et al., 2017).
Según Arrazola, Herazo, & Alvis, (2013), también juegan un rol fundamental quizá en la
reducción de enfermedades coronarias, cáncer, diabetes, y comportamiento cognitivo. Todos
1
estos efectos preventivos y terapéuticos se asocian a sus propiedades antioxidantes (Longo & Formatted: English (United States)
Vasapollo, 2004; Garzón Gloria A., 2008). Field Code Changed
Formatted: English (United States)
Las antocianinas (perteneciente a los flavonoides), además de mejorar la salud y curar Field Code Changed
enfermedades, se emplean ampliamente en la industria alimentaria, para aumentar la Formatted: English (United States)
Formatted: English (United States)
aceptabilidad del consumidor a ciertos productos (Zapata, 2014). Las antocianinas son de interés
Formatted: English (United States)
particular para la industria de colorantes alimenticios debido a su capacidad para impartir colores
Formatted: English (United States)
atractivos (Konczak & Zhang, 2004). El interés por los pigmentos antocianinos no solo es debido
Field Code Changed
al color que confieren; este tipo de colorantes se han usado habitualmente como colorantes
alimentarios naturales debido a que tienen baja o nula toxicidad, (Garzón Gloria A., 2008) además
de propiedades nutricionales y farmacéuticas para la salud.
3. OBJETIVOS
2
4. FUNDAMENTACIÓN CIENTÍFICO TÉCNICA
El repollo morado como también es conocida, tiene diferentes usos ya sea en el campo químico o
en el gastronómico. Está constituida por abundantes en compuestos de azufre, vitamina C y ácido
cítrico. Tiene un bajo contenido calórico, es rica en antioxidantes (1,88 millimoles/100 g) y
proporciona mucha fibra, por lo que se le adjudica propiedades laxantes (Salas Salvadó, Ros
Rahola, & Sabaté, 2005).
3
Figura 1: Brassica oleracea fo. rubra Fuente: (Plantas, 2018)
4.1.2. Taxonomía
Tabla 1: Taxonomía Brassica oleracea fo. rubra
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Brassicales
Familia Brassicaceae
Género Brassica
Variedad Capitata
Autor del epíteto específico Palacios Riera, J. U.
Nombre científico Brassica oleracea var. capitata f. rubra
Fuente: (Riera & Urcesino, 2014)
4
Los vegetales Brassicaceae tienen gran cantidad de sustancias que promueven la salud y reducen
el riesgo de enfermedades. Estas verduras son fuentes potenciales de glucosinolatos
anticancerígenos, gran cantidad de compuestos polifenólicos, como glucosinolatos, ácidos
fenólicos, antocianidinas, carotenoides y aminoácidos (Park et al., 2014).
La col, una verdura crucífera, contiene carbohidratos y metabolitos antioxidantes como vitamina
C y E (Chun, Smith, Sakagawa, & Lee, 2004). Además, se conoce que el repollo rojo contiene
varios flavonoides como por ejemplo miricetina, luteolina, delfinidina, cianidina y pelargonidina
y en especial kaempferol y quercetina, que se consideran compuestos antioxidantes,
antiinflamatorios, anticancerígenos, antitrombóticos y antivirales lo que puede tener un impacto
beneficioso en la salud humana (Park et al., 2014). Por otro lado (Wiczkowski, Topolska, &
Honke, 2014) a través de un estudio realizado con la col morada se determinó mediante el método
HPLC-DAD-MS / MS que Brassica oleracea fo. rubra cuenta con otra subclase de flavonoides,
20 antocianinas diferentes con la estructura principal de cianidina-3-diglucósido-5-glucósidos. Se
reconoció la presencia de forma no acilada, monoacilada y diacilada predominando en su mayoría
los compuestos no acilados y diacilados con ácido sinápico de cianidin-3-diglucósido-5-
glucósido.
5. METODOLOGÍA
5.1. Trabajo de campo
5.1.1. Recolección de la planta
El material vegetal fértil (fresco y en mejores condiciones) de la col morada será recaudado en el
Mercado Modelo, Provincia de Tungurahua, Ambato. La identificación taxonómica de la especie
será efectuada en el Herbario Nacional del Ecuador (QCNE), Quito. Un espécimen botánico se
depositará en el Herbario Misael Acosta Solís (AMAS), como colección de referencia.
5
un procesado (marca Thermomix®). Subsecuentemente, se extenderá la muestra en mallas
metálicas e introducirlas en una estufa (marca Gander MTN) a 60 °C de temperatura y reducir la
humedad hasta 9 %.
5.2.2. Obtención de extractos vegetales líquidos
Previa obtención del mejor extracto vegetal, se trabajará con diferentes variables, tales como: la
relación material vegetal/volumen de disolvente y el tiempo de extracción, manteniendo constante
la temperatura de ebullición. Como disolvente se usará etanol al 96 % en combinación con ácido
clorhídrico 1mol/l, en proporción 85:15. Se utilizarán tres variables de masa 3.3, 4.0 y 5.0 g de
material vegetal seco, que se pesarán utilizando una balanza analítica (marca Ohaus pioneer) y se
mezclarán respectivamente con 100 ml de disolvente.
A continuación, en 3 matraces (marca Pyrex) con tapa, se calentará cada una de las muestras en
una plancha de calentamiento (marca Corning PC-620D) con agitación magnética a 400 min-1,
aplicando tres tiempos de extracción diferentes, 60, 90 y 120 min respectivamente para cada una
de las respectivas proporciones de masa; Se tomará el tiempo después de alcanzar la temperatura
de ebullición, así sucesivamente con cada una de las muestras. Posteriormente, se separarán los
residuos sólidos del extracto líquido, utilizando una centrífuga (marca Rotina 380) a 5000 min-1
durante 10 minutos. Se desechará el precipitado y conservará el sobrenadante en botellas de vidrio
color ámbar en refrigeración a 4 °C para evitar la descomposición de las antocianinas.
𝐴 𝑥 𝑀𝑊 𝑥 𝐷𝐹 𝑥 1000
𝑚𝑔 𝐿−1 =
𝜀𝑥1
6
donde, A es igual a absorbancia, PM equivale al peso molecular de la cianidina-3-glucósido
(449,6 g/L), FD es el factor de dilución y 𝜀 es coeficiente de absorción molar para la col morada
(38020) (Universidad de las Américas de Puebla, 2018).
5.2.6. Microencapsulación
La microencapsulación del extracto vegetal rico en antocianinas se llevará a cabo utilizando un
mini Spray Dryer BUCHI-B 290. Se procederá a secar por aspersión la solución de antocianinas
con el polímero, maltodextrina DE (dextrosa equivalente) 10. El material encapsulante se
solidificará sobre las partículas a medida que el disolvente se evapore formando microesferas.
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Para realizar la etapa de estrés oxidativo, se analizará un rango de concentraciones de H2O2. y se
incubarán durante 60 min a 28 ºC con H 2O2 de 0.25 a 6 mmol/l. También se llevará a cabo un
control no tratado. Luego, los oxidantes se eliminarán mediante centrifugación a 2700 g, durante
20 min, a 20 ºC y se realizará un lavado con PBS, el pellet se resuspenderá en medio YPD fresco
para su posterior análisis de crecimiento registrando la OD 600 nm.
Las curvas de relación de crecimiento se calcularán para cada cepa y condición a las 5, 9, 12, 16
y 18 h de incubación con la siguiente formula:
El efecto que ejerce el peróxido de hidrogeno y los agentes oxidantes a evaluarse se determinarán
mediante el análisis estadístico de la gráfica de curva de relación de crecimiento vs tiempo.
Una sola colonia de cepa de levadura se inoculará en 5 ml de medio YPD líquido fresco y se
incubará durante 6 horas a 28 ºC con agitación a 40 rpmin -1 . Una alícuota de 5 μl de la dilución
1/10 de este precultivo se inoculará en 3 mL de medio YPD líquido fresco con los ingredientes
antioxidantes durante 18 h a 28 ºC con agitación a 40 rpmin -1 en un rotador de tubo. Se analizarán
varias concentraciones de los ingredientes antioxidantes (50 mg EE/L a 700 mg EE/L de extracto
de antocianina y 0.5 a 25 mmol/l de vitamina C) para inducir una respuesta antioxidante
intracelular en la levadura.
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Para inducir un estrés oxidativo no letal, las células se incubaron durante 60 minutos a 28 ºC con
H2O2 (0.5 mmol/l y 4 mmol/l). Se llevará a cabo un control no tratado para cada muestra. Luego,
los oxidantes se eliminarán mediante centrifugación a 2700 g, durante 10 minutos, a 20 ºC y las
células se resuspenderán en medio YPD fresco para el análisis de crecimiento posterior
registrando la OD 600 nm como se describe anteriormente. Los experimentos se efectuarán por
triplicado. Las diferencias estadísticamente significativas (p <0,05) se calcularán mediante un
ANOVA de una vía con LSD post prueba. (Peláez Soto & Patricia Roig Montoya José Vicente
Gil Ponce Valencia, 2016)
6. RECURSOS
6.1. Recursos humanos
Investigador: Eliana Ramos
Docente tutor: PhD. Orestes López
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Equipo mini Spray Dryer
Computadora laptop con sistema operativo Windows 10
Software de análisis de datos estadístico y gráfico, Statgraphics XVII 64x
7. CRONOGRAMA
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Revisión bibliográfica 24-oct-18 145 18-mar-19
Revisión bibliográfica
Redacción de perfil de tesis
Correcciones de perfil de tesis
Recolección de material vegetal
Fase experimental: ensayos de laboratorio
Análisis de resultados
Redacción tesis
Corrección de tesis
Tramites de sustentación
Presentación de trabajo de graduación
Defensa del trabajo de graduación
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8. BIBLIOGRAFÍA
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Antocianinas. BIOtecnia, 13(2), 16–22. https://doi.org/10.18633/bt.v13i2.81
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(Solanum melongena L.) mediante Secado por aspersión y evaluación de la estabilidad de
su color y capacidad antioxidante. Informacion Tecnologica, 25(3), 31–42.
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Khoo, H. E., Azlan, A., Tang, S. T., & Lim, S. M. (2017). Anthocyanidins and anthocyanins:
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