UNIVERSIDAD PERUANA LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA

HUANCAYO – PERU
2017
 UNIVERSIDAD PERUANA LOS ANDES
UNIVERSIDAD DEL SIGLO XXI
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PRACTICA DE MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA

CATEDRATICO : _________________________________________________

ALUMNO (a) : _________________________________________________

LABORATORIO :___________________TURNO_______________________

HUANCAYO – PERÚ
 PRESENTACION
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), millones de personas se enferman y
muchas mueren por consumir alimentos insalubres; por estas razones, seriamente
preocupados adoptaron en el año 2000 una resolución en la cual se reconoce el papel
fundamental de la inocuidad alimentaria para la salud pública. La realización del presente
trabajo tiene como objetivo garantizar la salud alimentaria mediante la unión sistemática de
medidas de seguridad, bioseguridad y control, dentro del área hospitalaria ayudando a
promover dentro del ámbito gastronómico medidas preventivas en la cadena de manejo y
manipulación de alimentos. Se trabajará con los Manuales elaborados por el Ministerio de
Salud Pública, Manual de Buenas Prácticas de Manufactura, el Códex Alimentario, POES
(Procesos Operativos Estandarizados de Saneamiento), el sistema HACCP, Manual de
Bioseguridad del Ministerio de Salud pública; conceptos de diferentes publicaciones, autores y
fuentes de internet sobre normativas operacionales y de funcionamiento en seguridad,
manipulación y manejo de equipos; con la finalidad de sustentar en la teoría y en la práctica
que es posible crear un Manual de Buenas Prácticas, Seguridad e Higiene en la preparación de
alimentos; mejorando los sistemas de salubridad, inocuidad e higiene en elaboración y
servicio; brindando de tal modo una alimentación de calidad.
El trabajo en un laboratorio de Microbiología de Alimentos implica la exposición a
microorganismos y algunos pueden ser potencialmente patógenos. La aplicación correcta de
las reglas de seguridad e higiene determina la seguridad de las personas que se encuentren en
el laboratorio. Las normas de seguridad y contención microbiológica describen los requisitos
indispensables para los laboratorios en donde se manipulan microorganismos. La siguiente
clasificación de riesgos se basa en la patogenicidad del microorganismo, el modo de
transmisión y la gama de huéspedes, la disponibilidad de medidas preventivas y la
disponibilidad del tratamiento eficaz.
 MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA

INDICE

PRACTICA Nº 01.- Bioseguridad en el laboratorio de microbiología

PRACTICA Nº 02.- Coloraciones bacterianas

PRACTICA Nº 03.- Esterilización de materiales y medios de cultivo

PRACTICA Nº 04.- Preparación de medios de cultivo

PRACTICA N°05.- Técnicas de siembra y aislamiento de bacterias

PRACTICA N°06.- Aislamiento de Staphylococcus

PRACTICA Nº 07.- Recuento de coliformes totales y fecales.

PRACTICA Nº 08.- Investigación de Salmonella

PRACTICA Nº 09.-Pruebas bioquímicas de Entero bacterias

PRACTICA Nº 10.- Antibiograma

PRACTICA Nº 11.- Aislamiento de hongos y levadura

PRACTICA N° 12.- Observación e identificación de parásitos microscópicos

PRACTICA N°13.- Observación de ectoparásitos

 PRACTICA N° 01

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Introducción
Desde hace tiempo la Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce que
la seguridad y, en particular, la seguridad biológica son importantes cuestiones de
interés internacional. En 1983, la OMS publicó la primera edición del Manual de
bioseguridad en el laboratorio; en la que se alentaba a los países a aceptar y aplicar
conceptos básicos en materia de seguridad biológica, así como elaborar códigos
nacionales de prácticas para la manipulación sin riesgo de microorganismos
patógenos en los laboratorios que se encuentran dentro de sus fronteras nacionales.
La tercera edición del Manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
(2005) proporciona la información más actualizada para abordar los aspectos de la
seguridad y la protección biológica que se plantean en el nuevo milenio. Asimismo,
subraya la importancia de la responsabilidad personal. Además, hace reflexionar sobre
los recientes acontecimientos mundiales que hacen evidente los peligros para la salud
pública derivados de la liberación o el uso indebido de agentes y toxinas microbianos.
Como profesionales de estas disciplinas, es importante conocer los principios
básicos de seguridad en el trabajo con microorganismos, considerando los peligros
relativos que implican su manejo. De acuerdo con el potencial que tienen los
microorganismos para infectar al ser humano y los animales, se les ha clasificado en
grupos de riesgo, que se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Clasificación de microorganismos infecciosos por grupos de riesgo.

Grupo de riesgo 1 Microorganismos que tienen pocas probabilidades
(riesgo individual y poblacional escaso o nulo) de provocar enfermedades en el ser humano o los
animales.
Grupo de riesgo 2 Agentes patógenos que pueden provocar
(riesgo individual moderado, riesgo poblacional enfermedades humanas o animales pero que
bajo) tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo
grave para el personal de laboratorio, la población,
animales o el medio ambiente. La exposición en el
laboratorio puede provocar una infección grave,
pero existen medidas preventivas y terapéuticas
eficaces y el riesgo de propagación es limitado.
Grupo de riesgo 3 Agentes patógenos que suelen provocar
(riesgo individual elevado, riesgo poblacional enfermedades humanas o animales graves, pero
bajo) que de ordinario no se propagan de un individuo a
otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas
eficaces.
Grupo de riesgo 4 Agentes patógenos que suelen provocar
(riesgo individual y poblacional elevado) enfermedades graves en el ser humano o los
animales y que se transmiten con facilidad de un
individuo a otro, directa o indirectamente. Por lo
regular no existen medidas preventivas y
terapéuticas eficaces

La OMS y los NationalInstitutes of Health(NIH) de los Estados Unidos, han propuesto las bases
para la jerarquización de loslaboratorios en función del grupo de riesgo al que pertenecen los
microorganismos que manejan, indicando las condiciones deacceso, tipo de personal, equipo
especial y diseño específico de las instalaciones.

Normas de bioseguridad en el laboratorio

En el trabajo de laboratorio es fundamental la seguridad e integridad física de las
personas involucradas; por ello, no podrá realizarse ninguna práctica o actividad
experimental si el ejecutante no cuenta con los elementos de protección
indispensables para su desarrollo o no cumple con las disposiciones normativas
aplicables, para lo cual se deberán cumplir siempre las siguientes reglas.
 El uso de mandilón es obligatorio cuando se realizan experimentos.
 Es recomendable vestir ropa sencilla, que proteja la mayor parte del cuerpo,
de preferencia de algodón, zapatos cerrados, con suelas gruesas y sin tacones
o plataformas, así como traer el pelo recogido.
 No introducir ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio. No fumar, ni
tocarse la cara o los ojos con las manos.
 Lavarse de manera meticulosa las manos con jabón y agua antes de salir del
laboratorio, incluso cuando salgan por breves periodos.
 Al manipular sustancias químicas corrosivas o peligrosas se utilizarán guantes,
lentes protectores y/o mascarillas. No se deberá pipetear oralmente ningún tipo
de solución o cultivo microbiano. Siempre se utilizarán pro pipetas adecuadas
para este fin.
 No se admitirán visitas personales ni el uso de aparatos que distraigan la
atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo.
 Evitar la acumulación de materiales innecesarios en las mesas de trabajo.
Realizar las actividades de manera ordenada y en silencio para evitar
accidentes.
 Localizar extintores, botiquín y salidas de emergencia.
Sobre los procedimientos
 Antes y después de cada sesión práctica, los alumnos limpiarán las mesas de
trabajo con el desinfectante que se le proporcionará.
 Cuando se utilice el mechero, este será colocado en un lugar alejado del
microscopio y otros equipos.
 En el caso de derrame de cultivos o ruptura de recipientes con cultivos activos,
tratar de conservar la calma, inmediatamente informar al profesor y/o realizar el
siguiente procedimiento:
o Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su
dispersión.
o Agregar abundante solución desinfectante sobre las toallas.
o Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el
receptáculo destinado a la eliminación de materiales contaminados.
o Al concluir cada sesión práctica, el estudiante se asegurará de que los
materiales de desecho u objetos contaminados sean colocados en
recipientes específicos para ello, así como en lugares apropiados
o Deberán esterilizarse tal y como indique el profesor.

Sobre el uso de instalaciones y equipos de laboratorio

 Operar un instrumento o aparato solamente cuando se sabe hacerlo, de otra
manera, solicitar la ayuda del profesor, del ayudante o del técnico del
laboratorio, para adquirir la destreza necesaria.
 Una vez concluido el uso de un aparato o instrumento, seguir el procedimiento
adecuado para apagarlo, desconectarlo, guardarlo y entregarlo al responsable
de su custodia.
 Siempre dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados
(microscopios, balanzas analíticas, autoclave, potenciómetros, etc.) y reportar
al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.
 Verificar que las tomas de agua, gas y aire en el lugar de trabajo estén bien
cerradas. Dejar limpias y secas las mesas de trabajo.
Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio
 El Manual de laboratorio.
 Mascarillas, guantes de látex y gorro.
  Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar (masking-
tape), marcador indeleble o etiquetas pequeñas, jabón para manos, alcohol gel
y papel toalla.
Resultados
 Reportar la importancia de bioseguridad en el laboratorio de microbiología.

PRACTICA N° 02

COLORACIONES BACTERIANAS

Introducción
Una de las características más importante de las bacterias es su morfología, definida
por el tamaño, la forma, el arreglo y la estructura. Existen bacterias en forma redondeada
denominadas cocos, en forma cilíndrica, denominadas bacilos y una tercera morfología como
son las que tienen forma de espirales, denominadas espirilos. A su vez cada categoría puede
sub clasificarse con base a diferentes arreglos. Estas características pueden determinarse
examinando muestras al microscopio. Las células no teñidas son prácticamente transparentes,
pero pueden observarse al microscopio de luz haciendo preparaciones entre lámina y laminilla
o con microscopios especiales como por ejemplo: de contraste de fases o de campo oscuro.
Cuando se dispone de un microscopio de luz, se pueden teñir las bacterias para facilitar su
visualización. Si se tiñe una muestra del cultivo extendida y fijada en una lámina portaobjeto
con un colorante dado, las células adquirirán el color del colorante añadido y podrá observarse
la forma, tamaño y el arreglo de las mismas. Este tipo de coloración se conoce con el nombre
de coloración simple. Para obtener mayor información sobre la morfología y composición
química de las bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales que involucran el uso de
varios reactivos y éstas pueden diferenciarse con base al color que retienen. Ej. Tinción de
Gram y Tinción de Ziehl Neelsen.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tiene alguna afinidad
específica por algún componente celular. De gran importancia en la microbiología porque
permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias Gram positivas y Gram negativas. Según
se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared
celular de ambos grupos: Las bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de
peptidoglicano en su pared, mientras las bacterias Gram negativas tiene una capa de
peptidoglicano más fina una capa de lipopolisacaridos externa.
Técnicas de tinción de bacterias:
 Tinción simple
 Tinción Gram
 Tinción de Alcohol acido resistente
 Tinción de esporas
 Tinción de flagelos
Objetivos
 Aprender a realizar frotis o extendidos y preparaciones fijas de bacterias.
 Conocer los métodos de tinciones, aprender a realizar la técnica de tinción
simple usada en bacteriología.
 Conocer y distinguir que es tinción diferencial así como aplicar la técnica de
Tinción de Gram.
Materiales
 Muestra con mezcla bacteriana
 Láminas portaobjetos
 Cubre objeto o lamillas
 Asa bacteriológica de Kolle en aro o en punta
 Colorante Azul de metileno
 Colorante Gram
 Colorante de Ziehl Neelsen
  Mechero de Bunsen
 Varillas para coloración
 Aceite de cedro o de inmersión
 Papel lente
 Microscopio compuesto
Procedimiento.-
Preparación del extendido
 Colocar en cada una de las láminas limpias, secas y desgrasadas, una gota de solución
salina utilizando el asa de platino previamente esterilizada.
 Tomar asépticamente con el filamento una pequeña muestra del cultivo sólido
suministrado por el profesor y mezclar con la gota de solución salina para obtener una
suspensión. También puede utilizarse un cultivo líquido, en dicho caso, la muestra se
toma con el asa de platino y no es necesario colocar la gota de solución salina.
 Extender la suspensión con el asa de platino previamente esterilizada y enfriada.
 Dejar secar la lámina a temperatura ambiente.
 Fijar la muestra extendida a la lámina utilizando calor. Esto se logra pasando la lámina
varias veces por la llama del mechero (máximo 3 veces). La lámina no debe calentarse
mucho y ello se verifica tocando suavemente el dorso de la mano con lámina. El
operador debe soportar el calor, sin quemarse.
Coloración simple.-
 Colocar las láminas extendidas y fijadas en una bandeja adecuada y cubrir su superficie
con azul de metileno por cinco minutos. Lavar con agua destilada y escurrir
 Secar las láminas utilizando papel absorbente.
 Observación bajo el microscopio de luz. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre
las láminas teñidas y secas y examinarlas bajo un microscopio de luz, utilizando el
objetivo de inmersión. (90X-100X).Observar varios campos hasta encontrar aquél,
donde las células están adecuadamente separadas, para permitir la visualización de la
morfología.
Coloración de Gram.-
 Colocar las láminas extendidas y fijadas en una bandeja adecuada y cubrir su superficie
con cristal violeta por un minuto. Lavar con agua destilada y escurrir.
 Cubrir la superficie de la lámina con la solución de lugol por un minuto. Lavar con agua
destilada y escurrir.
 Colocar cada una de las láminas en posición inclinada y decolorarlas con alcohol a 95°
hasta que el color libre deje de salir (aproximadamente 10-20 segundos). Lavar con
agua destilada y escurrir. Este es el paso más importante de la coloración ya que una
excesiva adición del alcohol permite la salida del colorante primario de las células
Gram positivas.
 Cubrir las láminas con safranina por 30 segundos. Lavar con agua destilada y escurrir.
 Secar las láminas utilizando papel absorbente.
 .Observación bajo el microscopio de luz. Colocar una gota de aceite de inmersión
sobre las láminas teñidas y secas y examinarlas bajo un microscopio de luz, utilizando
el objetivo de inmersión. (90X-100X). Observar varios campos hasta encontrar aquél,
donde las células están adecuadamente separadas, para permitir la visualización de la
morfología.
Coloración de Ziehl Neelsen
 Colocar las láminas extendidas y fijadas en una bandeja adecuada y cubrir su superficie
con fucsina por tres minutos y flamear hasta tres vapores. Lavar con agua destilada y
escurrir.
 Cubrir la superficie de la lámina con la el alcohol acido por un minuto. Lavar con agua
destilada y escurrir.
 Cubrir las láminas con azul de metileno por un minuto. Lavar con agua destilada y
escurrir.
 Secar las láminas utilizando papel absorbente.
 Observación bajo el microscopio de luz. Colocar una gota de aceite de inmersión
sobre las láminas teñidas y secas y examinarlas bajo un microscopio de luz, utilizando
el objetivo de inmersión. (90X-100X). Observar varios campos hasta encontrar aquél,
donde las células están adecuadamente separadas, para permitir la visualización de la
morfología.
Resultados
 Discutir en que grupo bacteriano se aplica los diferentes tipos de coloraciones y
como clasificarlo sus observaciones microscópicas
Cuestionario
 ¿Por qué se colorean de color azul o morado y color rojo?
 ¿Qué grupo de bacterias se realiza la coloración Gram?
 ¿Por qué necesita flamear la fucsina en la coloración Ziehl Neelsen?

PRÁCTICA N° 03

ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

Introducción
La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo que
asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o
manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones,
resultados erróneos o pérdida del material biológico. Por ello, se requieren buenas prácticas
de laboratorio para su adecuado manejo. La esterilización por calor seco o húmedo son los
métodos que se utilizan con mayor frecuencia en el Laboratorio de Microbiología. El calor seco
destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo, al exponerlos directamente a la
flama de un mechero o en horno a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican en la
esterilización de asas de inoculación y para todo tipo de material de vidrio y quirúrgico. Los
procesos con calor húmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas; se
aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y
cultivos bacterianos que se desechan. El equipo de uso común es la autoclave, que utiliza
vapor de agua a presión (15 lb/in2); con esta presión el material alcanza una temperatura de
121 °C y si se mantiene durante 15 minutos se asegurará la inactivación de endosporas, que
son las estructuras bacterianas más resistentes al calor. Como en los estudios de microbiología
se requiere la esterilización de espacios, superficies y materiales de naturaleza diversa
(plástico, vidrio, instrumentos, medios de cultivo, cultivos para desechar, etc.), hay diferentes
métodos que se aplicarán de acuerdo con el tipo de materiales requeridos, tal como se
observa en la Tabla 2.

Tabla 2. Métodos de esterilización. Métodos físicos calor húmedo vapor a presión (autoclave)
Húmedo vapor a presión
(autoclave)
Métodos Calor aire caliente (horno)
físicos Seco Flameado
Incineración
discos de membranas o
Filtración filtros absolutos
flujo laminar
No rayos ultravioleta
Radiaciones ionizantes

Gases óxido de etileno

Métodos químicos
Líquidos Formaldehído
β-propiolactona
Objetivos
 Explicar el concepto de esterilización y su aplicación en microbiología.
 Preparar correctamente el material que se someterá a esterilización.
 Aplicar algunas metodologías para esterilizar material y medios de cultivo.
 Comprobar la efectividad del proceso de esterilización.
 Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación
microbiana en el laboratorio.
Materiales:

Materiales de vidrio.
 10 unidades de placas Petri
 20 unidades Tubos tapa rosca 16x150 mm
 04 unidades Pipetas volumétricas graduadas
 02 unidades Matraz de 500 ml
 02 unidades Gradillas
 10 unidades Tubos 13x100
Medios de cultivo
 Agar Plate count
 Agar nutritivo
 Caldo nutritivo
 Agar SS
 Caldo selenito
Otros.
 Algodón
 Papel kraf
 Balanza analítica
 Incubadora bacteriológico
 Autoclave

Procedimientos
 Envolver las placas Petri, pipetas, matraces, varillas de vidrio, cucharas, etc.
con papel kraf.
 Los tubos de ensayo con tapas de algodón
Preparación del material de vidrio
 Lavar en forma respectiva el material de vidrio y enjuagar con abundante agua
corriente.
 Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada. Dejar
escurrir el material sobre una toalla o papel de envolver.
Esterilización de materiales
 Las placas Petri y pipetas envueltas con papel kraf se colocarán en un horno a
150ºC durante 2 horas. Después de sacarlas, dejar enfriar y abrir los paquetes
únicamente en área aséptica (cerca del mechero).
 Los medios de cultivo se esterilizara en el autoclave a 121°C X 15minutos
o Revisar que el agua en la autoclave esté limpia y el nivel coincida con la marca
en el tubo indicador. En caso necesario cambiar o añadir agua destilada.
o Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento máximo. Con el uso
de guantes de asbesto, acomodar los medios y materiales en la canasta de la
autoclave y colocarla dentro.
o Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y
esperar a que salga el vapor por el orificio de purga, después cerrarlo con la
válvula.
 o Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o 15 lbs /in2 de
presión y mantener estas condiciones durante 15 minutos. Revisar
continuamente el manómetro y regular el control de temperatura a valor
medio o mínimo.
o Apagar la autoclave y dejar que la presión baje al valor de cero. Quitar la
válvula y con la ayuda de guantes de asbesto, abrir cuidadosamente la tapa,
desde la parte trasera para evitar que el vapor caliente cause quemaduras.
o
Resultados
 Discutir los resultados con base en la efectividad de la esterilización y manejo
de los materiales.

Cuestionario
 ¿Cómo clasifica los materiales para su esterilización y como garantizar su
esterilidad?
 ¿Qué diferencia encuentra entre el vapor húmedo y calor seco?
 ¿Por qué es importante el uso de materiales estériles?

PRACTICA N° 04

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Introducción
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el
crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie
que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente.
Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios normales. Hay
microorganismo muy exigente que necesitan determinadas sustancias como las
vitaminas, suero o sangre para crecerExisten medios cuya composición permite el
crecimiento de:
Según su estado físico:
 Medios líquidos: Comúnmente llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente por
extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la
obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración.
 Medios sólidos: Se agrega un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el
agar.
 Medios semisólidos: Se prepara a partir del medio líquido, agregándose a estos un
agente solidificante en una proporción menor para preparar medios sólidos.
Según su función:
 Medios comunes: Son aquellos que poseen minimos para que pueda producirse el
crecimiento de las bacterias que no necesitan requerimiento especial. Ejemplo agar
nutritivo.
 Medios enriquecidos: Son aquellos que además de las sustancias nutritivas normales,
incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de
microorganismos exigentes. Este requerimiento se hace por adición de sangre u otros
productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.). Agar sangre, Medio
Ogawa, Agar chocolate.
 Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas
bacterias. Contenida en una población poli microbiana. El fundamento de este medio
consiste facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana
específica. Agar SS, Agar TCBS.
 Medios diferenciales: Se utiliza para poner en evidencia características bioquímicas
que ayuden a diferenciar género o especies. La adición de una azúcar fermentable, o
un sustrato metabolizable. Agar TSI, Agar CS, Medio SIM.
Según su origen:
  Medios naturales: Son preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o
vegetal cuya composición química no se conoce.
 Medios sintéticos: Son medios que contienen una composición química definida
cualitativamente y cuantitativamente
 Medios semisinteticos: Son los sintéticos a los que se añaden factores de crecimiento
bajo una forma de un extracto orgánico complejo como extracto de levadura.
Factores ambientales en un crecimiento bacteriano
Temperatura.- Cada microorganismo es capaz de crecer en un rango de temperatura.
 Temperatura mínima: Es el microorganismo que ya no se detecta crecimiento o valores
más bajos de temperatura. La actividad metabólica es mínima las membranas se
hacen más rígidas y los procesos de transporte son limitados o no existentes.
 Temperatura óptima: cuando el microorganismo registra la máxima velocidad de
crecimiento y las reacciones enzimáticas ocurren a la máxima velocidad posible
 Temperatura máxima: Es en la que el crecimiento no existe y se hace insostenible todo
proceso bioquímico por la desnaturalización de proteínas y enzimas.
Acidez o alcalinidad.-
 Al igual que con la T° cada microrganismo tiene un rango de pH dentro del que se
puede desarrollar.
 Acido filo: Son los microorganismos que viven a valores de pH por debajo de 2.
 Alcalofilos: Son aquellos microorganismos que viven a valores de pH superiores a 10.
 Neutrófilos: Son aquellos microorganismos que viven a valores de pH cercano a la
neutralidad (pH 6 a 8)
Actividad de agua (aw).-
 Para el crecimiento microbiano es fundamental contar con agua para realizar todas las
reacciones bioquímicas y enzimáticas. El agua difunde de una zona de alta
concentración a una zona de baja concentración. La actividad del agua depende de la
disponibilidad de esta en el medio ambiente y de la concentración de solutos presentes
en ella. Por lo que se relaciona bien con la concentración de NaCl.
Halófilos: Microorganismos que requieren el ion sodio para desarrollarse.
 Halófilos discretos: (1 – 6 %)
 Halófilos moderados: (6 – 15%)
 Halófilos extremos: (15 – 30%)
Osmófilos: Microorganismos que viven en presencia de alto valor de azúcar.
Xerófilos: Microorganismos que viven en presencia de alta sequedad o ausencia de agua.
Nutrientes:
 Los microrganismos que son patógenos son considerados heterótrofos. Requiere:
Carbono, Nitrógeno, azufre y micro elementos.
Oxigeno.-
 Aerobio: Microorganismo que viven en ambientes con tensiones normales de oxígeno
(21% O2)
 Microaerofilos: Microorganismos que viven en presencia de niveles de oxígeno que
están bajo la concentración presente en el aire (<21%)
 Anaerobios facultativos: Microorganismos que pueden vivir en ausencia de oxigeno o
en su presencia.
 Anaerobios: Microorganismos incapaces de crecer en presencia de oxígeno.
Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en
presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.
Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en
los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en
las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua
que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar
así que se deseque el medio.
Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
 crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos
medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave
(que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).
Objetivos:
 Conocer los diferentes conceptos sobre la preparación de medios de cultivo como
soporte para diferentes análisis microbiológicos.
 Indicar los diferentes pasos para la preparación de los medios de cultivo teniendo en
cuenta los métodos de esterilización adecuados.
 Preparar los medios de cultivo adecuadamente teniendo en cuenta sus ingredientes y
los cálculos apropiados para todo el proceso
 Identificar los diferentes pasos a seguir en la elaboración de un medio de cultivo.
Materiales
 Placas de Petri grande
 Tubos de ensayo 9 ml
 Erlenmeyer
 Pipeta 10 ml
 Papel filtro
 Probeta
 Pizeta
 Asa de Kolle
 Autoclave
 Estufa o incubadora
 Balanza
 Estufa o mechero
 Medios de cultivo: Agar nutritivo, agar EMB, agar SS, caldo selenito, caldo
peptonado.

Procedimiento.-
 Cada mesa de trabajo se encargara de la preparación de una cantidad
suficiente de un determinado medio de cultivo para ser utilizado en su
momento, por todos los alumnos del grupo de práctica.
 Pesar y disolver los componentes del medio de cultivo en agua destilada. En
muchos casos se parte de un preparado comercial con todos los componentes
deshidratados. Siguiendo las indicaciones del fabricante, añadir la cantidad de
agua adecuada para conseguir la concentración deseada de los mismos.
 Si el medio contiene un agente solidifícante (agar-agar) hay que calentar el
preparado hasta la ebullición del mismo agitando de vez en cuando, para
asegurar una completa disolución del agar (medio sólido y semisólido), para
medios líquidos no es necesario calentar únicamente se agita la mezcla hasta
la completa disolución de la misma.
 Esterilizar la disolución.- una vez disuelta el medio se debe esterilizar para
evitar el crecimiento de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya
a utilizarse el medio el procedimiento será diferente.
 A.- Medios sólidos en placas: Tapar el matraz con tapón de algodón y cubrir
con papel de aluminio. Llevar a esterilizar a la autoclave a 121 ° C X 15
minutos. Una vez estéril repartir en placas de Petri estériles y dejar en reposo
para que solidifique.
 B.- Medios líquidos: Una vez disuelto los componentes repartir en tubos a
razón de 2 a 4 mL por tubo, tapar con tapón de algodón y papel kraf Y auto
clavar.
Resultados
 Discutir la importancia de los diferentes medios de cultivo en el aislamiento
bacteriano

Cuestionario.-
 1. ¿Porque es importante un medio de cultivo en microbiología?
 2. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo?
 3. ¿Qué nutriente son necesarios en un medio de cultivo?
 PRACTICA N°5

TECNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

Introducción
El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de
técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o
mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios
morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos, entre otros.
Existen diferentes técnicas de siembra: por suspensión de la muestra en medios líquidos;
extensión de diluciones de un cultivo en superficie de medios en caja de Petri; por estría en
caja de Petri y tubos con medios solidificados en forma inclinada; por piquete o picadura en
tubos con medios sólidos o semisólidos. Con la aplicación de cada técnica se obtiene
información de importancia para el estudio básico o aplicado de los microorganismos de
interés. En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran en poblaciones,
formando parte de comunidades de gran complejidad, por lo que uno de los objetivos de
estudio más importantes en microbiología es aislarlos. El aislamiento de bacterias a partir de
muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la técnica de estría cruzada
para producir colonias aisladas en cultivos sólidos y así, obtener un cultivo puro o axénico,
también conocido como cepa, que contiene un solo tipo de microorganismo con la misma
composición genética. Cuando la técnica por estría se aplica para aislar un microorganismo de
interés a partir de mezclas donde se encuentra en pequeñas cantidades, generalmente se
obtendrán las bacterias dominantes. En este caso, se utilizan medios selectivos o de
enriquecimiento, los que contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones
de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura que incrementarán la población del
microorganismo de interés y se facilitará su aislamiento. Si se agregan a los medios de cultivo
otros componentes como: sangre, colorantes, indicadores, es posible distinguir entre especies
bacterianas por la forma en que metabolizan los sustratos y que se manifiesta por cambios en
la apariencia del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales
y son de gran utilidad para la caracterización e identificación de especies bacterianas.
Objetivos
 Aplicar diferentes técnicas de siembra y aislamiento de cultivos de bacterias y en
medios sólidos.
 Aprender las técnicas de inoculación de microorganismos en las que se aislara hasta
conseguir un cultivo puro por medio de inoculación en estrías
 Reconocer diferentes técnicas para el aislamiento de microorganismos.
Materiales
 Placas petri con agar nutritivo
 Placas Petri con agar EMB
 Tubos con caldo nutritivo
 Mechero
 Asas de Kolle
 Pizeta con agua destilada
 Incubadora
 Refrigeradora
 Autoclave
Procedimientos
 Proporcionar cultivos puros de bacterias Gram positivas y negativas
 Dividir las placas Petri en cuatro cuadrantes
 Esterilizar el asa con calor en el mechero
 Dejar enfriar el asa y tomar la muestra de una colonia
  Inocular la muestra haciendo 4 ó 5 estrías simples muy juntas del lado a lado sobre el
primer cuadrante de la caja cerrar la caja
 Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja Petri un cuarto de vuelta.
 Abrir nuevamente la caja y con el asa de siembra esterilizada y fría tocar la superficie
tocar la superficie del de estrías recién hechas en un punto alejado del inicio.
 Hacer un segundo grupo de estrías como el caso anterior Realizar el mismo
procedimiento en el tercer cuadrante y en el último cuadrante, sin flamear el asa de
siembra hará una estría más abierta.
 Las placas con la base arriba se incuban a 35°C durante 24 a 48 horas.
 Observar la aparición de colonias y reportar la forma de crecimiento de los
microorganismos.

Resultados
 Discutir los resultados de las diferentes colonias en los medios de cultivos.

Cuestionario
 1. ¿Cuántas técnicas de siembra se aplica en los medios de cultivo?
 2. ¿Qué formas presentan las colonias de los medios de cultivos?
 3. ¿Por qué es importante flamear el asa de siembra?
 PRACTICA N°06

AISLAMIENTO DE STAPHYLOCOCCUS

Introducción
La intoxicación estafilocócica se produce por el consumo de alimentos en los que se
ha multiplicado S.aureus, produciendo toxinas muy termorresistentes, activas por vía
oral, que se encuentran ya preformadas en el alimento (Escobar, 1994, p 94). Los
estafilococos enterotoxigénicos pueden encontrarse, por lo tanto, ya en los alimentos
en el momento de su obtención, en especial en los de origen animal, o bien llegar
posteriormente a ellos a partir principalmente de los manipuladores. Un alto
porcentaje de personas sanas son portadoras de S. aureus en fosas nasales y
faringe, también se encuentran en la piel, cuero, cabelludo y, sobre todo en procesos
cutáneos (acné, furúnculos, heridas infectadas)
Objetivo
 Realizar recuento de Staphylococcus aureus a partir de alimentos de origen
animal o vegetal.
 Reconocer e interpretar con habilidad el crecimiento de Staphylococcus
aureus en los medios empleados.

Materiales
 Agua peptona 0.1%
 Agar Baird –Parker (Manitol Salado)
 Plasma fresco
 Caldo cerebro corazón
 Cuchillos-cucharas
 Pipetas 1 y 10mL
 Asa bacteriológica
 Bolsas de polipropileno
 Gradilla
 Tubos de ensayo
 Placas de petri
 Balanza
 Incubadora bacteriológico

Procedimiento
 Preparar las muestras y realizar las diferentes diluciones
 En condiciones asépticas, añadir 10 ml o 10 gr de muestra en un matraz con
90 ml de caldo peptonado (dilución 10-1). Hacer diluciones decimales hasta
10-4.
 Depositar 1.0 ml de cada dilución en la placa
 Añadir 20 ml aprox. de agar EMB a 03 placas.
 Incubar las placas Petri en forma invertida a 37°C x 24 a 72 hrs y realizar la
cuenta de las colonias.
 Realizar la identificación.
Resultados
 Que nos indica UFC, en las placas con medios de cultivos

Cuestionario
 1. ¿Qué entiende por intoxicación alimentaria?
 2. ¿Cómo aislamos estafilococos en diferentes muestras?
 3. ¿Qué pruebas bioquímicas diferencia entre las especies de estafilococos?

PRACTICA N° 07

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES

Introducción
Con el análisis bacteriológico del agua o de los alimentos se puede determinar
parcialmente si son aptos o no para el consumo humano. Con este tipo de estudios es
posible detectar a microorganismos que son muy numerosos en las aguas negras y en
las heces fecales, son las bacterias coliformes fecales de la familia Enterobacteraceae.
Cuando estos organismos se encuentran presentes en el agua o alimentos, nos indica
que han sido contaminados con aguas negras o materia fecal. Puede ser que
contengan bacterias que causen enfermedades como la tifoidea o disentería.
Objetivo
 Realizar una prueba confirmativa para coliformes.
 Comprender y realizar adecuadamente la determinación de Coliformes totales a partir
de productos de origen animal o vegetal.  Diferenciar las técnicas de NMP y vertido
en placa para recuento de coliformes.  Analizar correctamente los resultados que se
obtengan en cada prueba.
Materiales:
 Muestras de alimentos
 Caldo peptonado
 Agar EMB
  03 Placas Petri estériles
 02 Pipetas de 01 ml estériles
 Mechero de Bunsen
 03 Matraz de 100 ml o de 150 ml
 Fósforos
 03 Matraz de 500 ml
 Papel Kraft

Procedimiento.-
 En condiciones asépticas, añadir 10 ml o 10 gr de muestra en un matraz con
90 ml de caldo peptonado (dilución 10 -1). Hacer diluciones decimales hasta 10
-4.
 Depositar 1.0 ml de cada dilución en la placa
 Añadir 20 ml aprox. de agar EMB a 03 placas.
 Incubar las placas Petri en forma invertida a 37°C x 24 a 72 hrs y realizar la
cuenta de las colonias.
 Realizar la identificación.

Resultados
 Para calcular las UFC, se aplicará lo siguiente:
 Número de colonias promedio X (FD)= UFC/ mL,
 El factor de dilución (FD) se calcula tomando en cuenta la dilución que se
seleccionó como válida para la cuenta (que tenga entre 30-300 colonias) y el
volumen de muestra inoculado en cada caja.
 Diferenciar los coliformes totales de las fecales, teniendo en cuenta sus
características morfológicas de cada colonia.

Cuestionario
 ¿Que indica un contaminador fecal?
 ¿Qué es una colonia en los medios de cultivos?
  ¿Por qué es importante las diluciones en los medios de cultivo?

PRACTICA N° 08

INVESTIGACION DE SALMONELLA
Introducción.
La Salmonella es un género de bacteria que pertenece a la familia
Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con
flagelos perítricos y que no desarrollan cápsula (excepto la especie S. typhi) ni
esporas. Son bacterias móviles que producen sulfuro de hidrógeno (H2S). Fermentan
glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen
ureasa. Es un agente productor de zoonosis de distribución universal. Se transmite
por contacto directo o contaminación cruzada durante la manipulación, en el
procesado de alimentos o en el hogar, también por vía sexual. Crece bien en los
medios ordinarios de cultivo, sin requerir factores esenciales. En el hombre causa
dos manifestaciones clínicas: fiebre tifoidea, y gastroenteritis (toxiinfección
alimentaria).
Los alimentos más implicados son la carne y productos cárnicos, la leche y los
huevos. La refrigeración de los alimentos y una correcta manipulación y cocción son
factores limitantes de la contaminación. En los alimentos como consecuencia de la
naturaleza de la contaminación, se ven acompañadas de gran cantidad de
Enterobacterias muy similares, de aquí la necesidad de su PRE-enriquecimiento.

Objetivos
 Familiarizar al estudiante con la investigación de Salmonella en muestras de
alimentos.
 Conocer la importancia del reconocimiento de Salmonella como indicador de
calidad en muestras de alimentos y su impacto sobre la salud
 Aplicar mecanismos de prevención de transmisión de: Salmonella spp.

Materiales
 Agua peptona 0.1%
 Agar Salmonella-Shigella
 Caldo Selenito
 Cuchillos-cucharas
 Pipetas 1 y 10mL
 Asa bacteriológica
 Bolsas de polipropileno
 Gradilla
 Tubos de ensayo
 Placas de petri
 Balanza
 Incubadora bacteriológico

Procedimiento
 Se pesan asépticamente 25 gr de la muestra
 Transferir a un frasco que contenga 225 ml de agua peptonada estéril. Mezclar
e incubar a 37°C por 18 a 20 horas.
 Inocular 1 ml del cultivo anterior sobre 10 ml de caldo selenito, incubado a 37ºC
durante 18-24 horas. - La recuperación óptima de Salmonella se obtiene entre
los 42 a 43ºC.
 A partir de los cultivos obtenidos en el medio líquido selectivo, sembrar por
agotamiento sobre: - Agar Salmonella- Shigella (S.S). - Agar XLD - Incubar a
37ºC durante 24 a 48 horas.
 Confirmación Bioquímica: - Realizar pruebas individuales de: TSI / LIA /
citrato / urea.
Resultados
 Por qué se utiliza medios enriquecidos y medios selectivos

Cuestionario
 1. ¿Qué muestras de alimento se aíslan las salmonelas?
 2. ¿Cómo prevenir la salmonelosis en los alimentos?
 3. ¿Por qué es importante el estudio de portadores asintomáticos de
salmonela?

PRACTICA N° 09

PRUEBAS BIOQUIMICAS DE LAS ENTEROBACTERIAS

OBJETIVO

El alumno observará algunas reacciones bioquímicas relacionadas con la fisiología

bacteriana, a la vez aprenderá su utilización para la identificación de enterobacterias

GENERALIDADES

El estudio bioquímico que se lleva a cabo como complemento de otros estudios

bacteriológicos es posible gracias a las reacciones fisiológicas y químicas que llevan a
cabo los microorganismos. Para esto se emplean medios de cultivo enriquecidos con
productos útiles para el metabolismo celular, los cuales además contienen algún
indicador que hace cambiar el color del medio al efectuar dichos microorganismos sus
funciones.

Los organismos varían en su capacidad para utilizar diferentes compuestos (por

ejemplo: carbohidratos, urea, citrato, etc.) para algunos microorganismos que se usan
en su identificación en el laboratorio. De acuerdo a los productos de su actividad
química, las bacterias se pueden clasificar como:

1. Zimógenas: las que fermentan los carbohidratos, desdoblándolos en alcohol, ácido

láctico o acético.

2. Aerógenas: las que producen gas como hidrógeno y dióxido de carbono como
resultado de su actividad metabólica.

3. Anaerógenas: las que no producen cantidades visibles de gas durante su actividad

metabólica.

4. Cromógenas: las que producen pigmentos solubles o insolubles.

5. Fotógenas: las que causan putrefacción y producen una débil fosforescencia

(algunas bacterias marinas)

Entre las pruebas bioquímicas más comunes tenemos:

Caldos de carbohidratos con indicador de pH, rojo de fenol: Al fermentar algunos

carbohidratos, muchas bacterias producirán ácido, y con un medio con pH original
alrededor de 7.4 al bajar éste a 6.8 por el ácido que produce un cambio de color
gracias a la incorporación de un indicador de pH como es el rojo de fenol

Agar de hierro y triple azúcar (TSI)

El agar TSI es uno de los más usados para ver la fermentación de carbohidratos en la
familia Enterobacteriaceae. Se pueden tener varias posibilidades de fermentación de
acuerdo a las características metabólicas del microorganismo como son: Utilización de
glucosa sola. Los microorganismos que fermentan solo la glucosa provocan en este
medio una reacción alcalina en la superficie (roja) sobre un fondo ácido (amarillo, k/a)
debido a que realizan una degradación aeróbica de la glucosa en la superficie,
convirtiendo el piruvato en agua y dióxido de carbono. Después de 18 a 24 horas de
incubación como la concentración de glucosa es baja (0.1%), los microorganismos
empiezan a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio, causando la liberación
de amoniaco y produciendo un pH alcalino (rojo) gracias al rojo de fenol que tiene el
medio como indicador de pH. En el fondo, como no hay oxígeno, se realiza una
degradación anaeróbica y el piruvato se convierte en lactato con lo cual el pH
disminuye quedando el pH ácido (amarillo).

Utilización de lactosa y/o sacarosa. Algunos microorganismos tienen la facultad de

fermentar la glucosa y la lactosa resultando una reacción ácida en la superficie
(amarilla) y ácida en el fondo (amarilla, a/a). En este caso después de 18 a 24 hrs como
la concentración de lactosa es alta (1.0%), o sea 10 veces más que la de la glucosa
presente, no se ha utilizado completamente y la acidez persiste tanto en el fondo
como en la superficie. En el caso de usar sacarosa la reacción sería la misma.

Sin utilización de ninguna de las anteriores. En el caso de no utilizar ninguno de los

carbohidratos presentes (glucosa, lactosa y sacarosa), lo que se usaría serían las
peptonas, ya sea aeróbicamente o anaeróbicamente. Sólo utilizándolas aeróbicamente
daría una superficie alcalina (roja, k) sobre un fondo sin cambio (sc) o sea k/sc). Si las
usara aeróbicamente daría una superficie alcalina (rojo) sobre fondo alcalino (rojo) o
sea k/k.

En este medio también es posible detectar la producción de gas por la formación de

burbujas dentro del medio, y la producción de ácido sulfhídrico, el cual reaccionará con
un indicador con base de fierro dando un color negro debido al sulfuro de hierro
formado.

Agar de hierro y lisina (LIA)

Algunos microorganismos son capaces de provocar la descarboxilacion de los

aminoácidos por inducción de enzimas específicas, el resultado de esta
descarboxilación es la producción de una amina (o diamina) y dióxido de carbono. Tal
es el caso de la producción de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar sobre la
lisina produce una diamina llamada cadaverina.
En el medio LIA se puede detectar la producción de la lisina descarboxilasa ya que se
produce una reacción coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como
indicador púrpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado)
hacia amarillo en el fondo indica una reacción ácida por la fermentación de una
pequeña cantidad de glucosa en el medio. Si el microorganismo produce lisina
descarboxilasa, la acción de esta enzima sobre la lisina dará lugar a la cadaverina, la
cual provocará un cambio de pH hacia la alcalinidad dando un color morado que
sobrepasa la acidez debida a la glucosa. Así pues, un fondo amarillo indica que no se
produce lisina descarboxilasa y un color morado que si es producida.

Prueba del citrato de Simmons.-Ciertas bacterias tienen la capacidad de utilizar el

citrato como única fuente de carbono en una serie de reacciones como sigue:

CITRATO OXALACETATO + ACETATO

OXALACETATO PIRUVATO + CO

2 PIRUVATO ACETATO + LACTATO + CO

Los ácidos orgánicos son posteriormente utilizados dando como producto final
carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El pH alcalino así logrado hace que el indicador de
pH en el medio, el azul de bromotimol vire de su color verde original a un azul intenso.

Prueba de la ureasa

La hidrólisis de la urea es catalizada en algunos microorganismos por una enzima

específica, la ureasa, dando lugar a dos moléculas de amonio, agua y dióxido de
carbono.

Todo esto da lugar a un cambio en el pH, lo que causa que cambie el color original del
medio (amarillo) a un color rojo bugambilia por el indicador rojo de fenol. De acuerdo
a la degradación de la urea el color será más o menos intenso.

(NH2)2C=O + 2H2O---> CO2+2NH3+H2O (NH4)2CO3

Medio MIO (Movilidad, Indol y Ornitina)

Este medio como su nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la produccíon
de indol y descarboxilación de la ornitina.

La movilidad se detectará por la presencia de turbidez alrededor del punto de

inoculación.

El indol se formará si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima triptofanasa

que desdoblará el aminoácido triptófano en indol, ácido pirúvico y amonio. El indol es
incoloro pero al reaccionar con el reactivo de Kovacs (p-dimetil-aminobenzaldehido)
que se adiciona después de que creció la bacteria, dará un color rojo violeta.
Por lo que respecta a la descarboxilacíon de la ornitina como el medio tiene púrpura
de bromocresol y una pequeña cantidad de glucosa cuando esta se fermenta se
produce un color amarillo en el fondo (ornitina descarboxilasa negativa), sin embargo
al descarboxilarse la ornitina se produce putresina la cual es alcalina y sobrepasa la
acidez dada por la fermentación de las glucosa resultando en un color morado en el
fondo

MATERIAL Y EQUIPO

Aguja bacteriológica

Mechero de Bunsen

Gradilla

Medios de cultivo (4 tubos cada uno)

Agar de hierro y triple azúcar (TSI)

Agar de hierro y lisina (LIA)

Agar Citrato de Simmons

Agar Urea según Christensen

Medio de MIO

TÉCNICA

1. Marque perfectamente cada uno de sus tubos, usando una serie de TSI, LIA, Urea,
Citrato y MIO

2. Inocule una serie para cada cepa como sigue:

MEDIO FORMA DE INOCULAR

TSI Superficie - picadura

LIA Superficie - picadura

Citrato de Simmons Superficie

Agar Urea Superficie

MIO Picadura

3. Tape los tubos procurando no apretar demasiado los tapones

4. Incube a 35° C por 24 hrs.

5. Lea e interprete los resultados de acuerdo a las tablas de identificación

PRESENTACÍON DE RESULTADOS
1. Anote las observaciones de cada tubo (antes y después de inocular), utilizando los
colores apropiados.

2. Anote los resultados de cada prueba usando las abreviaturas correctas. En caso de
no corresponder a la bacteria que se le dio con el resultado de sus pruebas
bioquímicas, especifique de que bacteria se trata.

Resultados:

 Reportar la importancia de las características bioquímicas de las bacterias

Cuestionario:

 1. ¿Qué medios de cultivo se utilizan para diferenciar las bacterias?

 2. ¿Qué función cumplen los indicadores en los medios de cultivo?
 3. ¿Para qué se realiza las pruebas bioquímicas de los microorganismos?

PRACTICA N°10

ANTIBIOGRAMA
 PRACTICA N° 11

AISLAMIENTO DE HONGOS Y LEVADURAS

Introducción

Los hongos son organismos eucariotas, de mayor tamaño y complejidad que

las bacterias. Se distinguen de otros eucariontes, como los animales, por ser inmóviles
y, de las algas y plantas, por carecer de pigmentos fotosintéticos. Son de nutrición
heterótrofa; es decir, dependen de nutrientes orgánicos disueltos por sistemas
enzimáticos específicos, que son absorbidos a través de su pared celular y membrana
plasmática.
Los hongos filamentosos (mohos) tienen una estructura vegetativa característica
denominada hifa. El conjunto de hifas ramificadas constituye el micelio. Las hifas de
algunos hongos presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los
hongos que pertenecen al grupo Zygomycota, las hifas no presentan estos septos y se
conocen como hifas cenocíticas.
El principal mecanismo de reproducción de los hongos es asexual por fragmentación
de hifas vegetativas o por la producción de esporas en conidióforos y esporangióforos,
formados en hifas aéreas, llamadas reproductivas.
La presencia de estructuras de reproducción sexual, es el principal criterio de
clasificación que permite ubicar a los hongos en tres divisiones o phyla: Zygomycota,
Ascomycotay Basidiomycota. Otros criterios importantes para la clasificación de los
hongos son las características de las hifas y las estructuras de producción de esporas
asexuales.

Objetivos.-
 Adquirir los conocimientos básicos para la manipulación de hongos
filamentosos y técnicas de cultivo.
 Describir las características morfológicas macroscópicas y microscópicas e
identifique algunas especies de hongos.

Materiales y equipos.-
 04 placas con agar saboraud
 02 asas de siembra
 Microscopio óptico
 Aceite de inmersión
 Canastilla
 Incubadora bacteriológico
 Azul de lactofenol

Procedimientos
 En condiciones asépticas, añadir 10 ml o 10 gr de muestra en un matraz con
90 ml de caldo peptonado (dilución 10 -1). Hacer diluciones decimales hasta 10
-4.
 Depositar 1.0 ml de cada dilución en la placa
 Añadir 20 ml aprox. de agar Saboraud a 03 placas.
 Incubar las placas Petri en forma invertida a 37°C x 24 a 72 hrs y realizar la
cuenta de las colonias.
 Realizar la identificación.

Resultados
 Para calcular las UFC, se aplicará lo siguiente:
 Número de colonias promedio X (FD)= UFC/ mL
  El factor de dilución (FD) se calcula tomando en cuenta la dilución que se
seleccionó como válida para la cuenta (que tenga entre 30-300 colonias) y el
volumen de muestra inoculado en cada caja.
 Diferenciar los micelios de las levaduras, teniendo en cuenta sus
características morfológicas de cada colonia.

Cuestionario
 ¿Qué diferencias hay entre los procedimientos de observación e identificación
de las estructuras de levaduras y hongos filamentosos?
 ¿Cuáles son los principales criterios de identificación de los hongos?
 ¿Describa de manera breve tres problemáticas causadas al hombre por
hongos y tres ejemplos de sus aplicaciones industriales?

PRACTICA N°12

OBSERVACION E IDENTIFICACION DE PARASITOS

Introducción

La coprología es una ciencia que tiene por objeto el estudio macroscópico y

microscópico dela materia fecal. Su importancia en el diagnóstico de enfermedades
parasitarias se debe a que gran cantidad de helmintos y protozoarios se ubican en el
tracto gastro-intestinal, ocasionando enfermedades cuyo diagnóstico se realiza
comprobando las presencia en las heces de los agentes causales o de sus formas
evolutivas (huevos, larvas o quistes).
Es conveniente examinar las muestras después de ser recolectadas o bien en un
tiempo no mayor de 6 horas, ya que las heces sufren un proceso de fermentación.
El examen microscópico de la materia fecal, comprende el estudio de los elementos de
origen parasitario, tales como trofozoitos y quistes de protozoarios intestinales, huevos
y larvas de helmintos, así como el estudio de elementos normales y anormales no
parasitarios de origen vegetal y animal.

Objetivo.-
 Observar las diferentes técnicas microscópicas en parasitología

 Reconocer las diferentes formas de parásitos como trofozoitos, quistes,

huevos, larvas y adultos.

Materiales y equipos.-
 Muestras aguas estancadas
 Laminas cubre objeto
 Laminas portaobjeto
 Lugol parasitológico
 Solución salina 0.9 %
 Microscopio binocular
 Guantes de protección

Procedimiento

 Colocar en el centro de una lámina portaobjetos bien limpia una gota de

solución salina 0.9%.
 Tomar una pequeña porción de la muestra a examinar empleando un palillo de
dientes y homogenizar con la solución salina o lugol.
 Cubrir con una laminilla cubreobjetos
 Observar al microscopio y enfocar comenzando con el objetivo de menor
aumento, para aumentar paulatinamente el número de aumentos.
Resultados
 Reportar sus resultados observados.

Cuestionario
 ¿Cuál es el examen de laboratorio de elección para la búsqueda de larvas?
 ¿Cuál es el examen de laboratorio de elección para la búsqueda de trofozoítos
en heces?
 ¿Qué entiende por examen copro parasitológico cualitativo?

PRACTICA N°13

OBSERVACION DE ECTOPARASITOS

Objetivo.-
 Observar las diferentes técnicas macroscópicas en parasitología

 Reconocer las diferentes formas de parásitos como huevos, larvas y adultos.

Materiales y equipos.-

 Muestras piel
 Láminas con cinta escoch
 Laminas cubre objeto
 Laminas portaobjeto
 Lugol parasitológico
 Solución salina 0.9 %
 Microscopio binocular
 Bisturí
 Guantes de protección

Procedimiento
  Colocar en el centro de una lámina portaobjetos bien limpia una gota de
solución salina KOH al 10%.
 Tomar una pequeña porción de la muestra a examinar empleando un palillo de
dientes y homogenizar con la solución del KOH
 Cubrir con una laminilla cubreobjetos
 Otra lámina con cinta escoch pegar en la piel y observar.
 Observar al microscopio y enfocar comenzando con el objetivo de menor
aumento a mayor aumento.
Resultados:
 Reportar los resultados observados
Bibliografía

 Alvarez M., Mendoza E. 1994. Manual Básico de Bacteriología. UNAM.

151pp.

 Atlas R., Bartha R. 2005. Ecología microbiana y microbiología ambiental.

Addison Wesley Longman. 677 pp.

 Bradshaw J. 1976. Microbiología del laboratorio. Ed. Manual Moderno. 231

pp.

 Campbell, R. 1987. Ecología Microbiana. Ed. Limusa. México. 586 pp.

Cowan K. y Park. K. T. 2006. Microbiology systems approach. McGraw Hill

International Edition. Boston. USA. 806 pp.

 Pelczar M.1982. Microbiología, Mc. Grall-Hill. 824.pp.

 Prescott, H. K. 2004. Microbiología, Mc. Graww Hill 1240.pp.

 Sánchez-Yáñez J. M. 2005. Tópicos selectos de microbiología. UMSNH

141.pp.

 Stanier, R. Y., Adelberg, E. A. y Ingraham, J. L. 1989. Microbiología. Cuarta

Edición. Editorial REPLA- España. 836.pp. Tortora, F. C. 2001.

Microbiology. Addison Wesley Longman

WEB GRAFIA

 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi

 http://www.inab.org/ (Instituto Nacional de Bioinformática)

 http://www.redgb.org (Red Nacional de Genómica Bacteriana)

 http://www.cect.org/ (Colección española de cultivo