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Hidrólisis granular de almidón del residuo agroindustrial de babassu: un

bioprocesamiento en el contexto de la biorrefinería

Resumen

La conversión de materias primas renovables en una gama de productos comerciales y


energía es el principio subyacente en el concepto de biorrefinería. En este trabajo, dos
subproductos agroindustriales de babassu se utilizaron como biomasas no
convencionales para desarrollar un proceso sostenible. La torta de babasú se usó para
producir un complejo multienzimático, que podía hidrolizar los gránulos de almidón y
liberar nitrógeno amino libre de la harina de babasú, produciendo un hidrolizado rico
en nutrientes de carbono y nitrógeno. Para ejemplificar sus posibles aplicaciones, se
investigaron diferentes estrategias para la producción de etanol mediante
sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) y las que comprendieron un paso de
hidrólisis de 4 h a 50 ° C seguido de 44 h de SSF a 32 ° C mostraron los resultados más
prometedores ( 53.6 g / L de etanol, 83% de eficiencia de almidón en etanol y
productividad de 1.12 g / (L h)). Las enzimas in situ promovieron mejores resultados
que un producto enzimático comercial (110.9 ± 6.6 g / L versus 74.5 ± 1.8 g / L de
liberaciones de glucosa, respectivamente) y mostraron una alta eficiencia y
productividad también en la harina de maíz, ya sea similar o superior a las reportadas
Para el proceso de molienda en seco a escala industrial.

Palabras clave

Produccion de enzimas Fermentación en estado sólido Hidrólisis fría Sacarificación y


fermentación simultáneas (SSF)Etanol

Introducción

En los últimos años, ha habido una tendencia creciente hacia una utilización más
eficiente de los subproductos agroindustriales para la conversión a una gama de
productos biológicos de valor agregado. Además, el bioprocesamiento de estos
residuos puede ayudar a resolver los problemas ambientales asociados con su
eliminación. Por lo tanto, la exploración de bioprocesos nuevos y eficientes para
biomasas infrautilizadas está a la vanguardia de la investigación en biotecnología y la
aplicación industrial [1] , [2]. El desarrollo de procesos eficientes, con potencial para
agregar valor a estos residuos agroindustriales se convirtió en uno de los mayores
desafíos en la biotecnología actual. Por lo tanto, el desarrollo de bioprocesos para
convertir materias primas biológicas en productos intermedios industriales y productos
finales es un punto clave para un futuro sostenible. El concepto de biorrefinería
implica una planta de procesamiento donde las materias primas de biomasa
renovables se convierten en un espectro de productos comercializables y energía, de
manera análoga a una refinería petroquímica. La glucosa es un producto químico clave
para los procesos microbianos, y se puede derivar de ella una amplia variedad de
productos biotecnológicos o químicos, como el ácido láctico, el etanol, el ácido acético,
el ácido succínico, el butanol, el sorbitol, el ácido levulínico y otros [3] .

Las tecnologías actuales para la producción de etanol a partir de fuentes de almidón


(por ejemplo, maíz) requieren enzimas específicas y presentan una alta demanda de
energía debido a las altas temperaturas necesarias para la gelatinización del almidón
(por encima de 100 ° C) [4] . Para superar estos problemas, una alternativa interesante
es reducir la temperatura de hidrólisis del almidón a la del proceso de fermentación.
También conocido como "hidrólisis fría", este enfoque comprende una acción conjunta
de un complejo de enzimas amilolíticas sobre almidón en forma granular, a
temperaturas inferiores al inicio de la gelatinización del almidón, que requiere menos
energía [4], y por lo tanto potencialmente permitiendo una ventaja económica. La
hidrólisis granular del almidón o la hidrólisis fría se han discutido ampliamente en la
literatura reciente, y se han destacado varias ventajas de este proceso en comparación
con los procesos convencionales: reducción de la viscosidad del medio de hidrólisis,
menor inversión de capital, menores costos de mantenimiento e insumos asociados
con estas operaciones , y potencialmente mayores rendimientos [5] , [6] , [7] .

Además de los granos de maíz, el almidón se puede encontrar en grandes cantidades


en otras plantas, como el babassu ( Orbygnia phalerata ). Babassu es una palma muy
cultivada en Brasil debido a sus aplicaciones industriales, como en las industrias de
alimentos, detergentes y cosméticos, y también a la utilización de su aceite para la
producción de biodiesel [8] . En 2011, se cosecharon 102,499 toneladas de nuez de
babasú en Brasil, principalmente en la región noreste [9] . El proceso para la extracción
de aceite genera una torta, compuesta principalmente de proteínas (23%),
carbohidratos (62%) y lípidos residuales (4.5%), mientras que la harina de babasú, que
se obtiene de la trituración mecánica del mesocarpio de coco, contiene
aproximadamente 50% (m / m) de almidón y 10% (m / m) de fibra en base húmeda
[10]. La composición de la torta de babasú la convierte en una buena materia prima
para los procesos de fermentación en estado sólido, especialmente para el cultivo de
hongos filamentosos que permiten la producción de complejos de multienzimas que
contienen amilasas, xilanasas, celulasas y proteasas, que son capaces de hidrolizar
gránulos de almidón crudo [ 11] , [12] . Por otro lado, la harina de babasú es muy rica
en almidón y, por lo tanto, es un candidato potencial para una investigación más
profunda como materia prima para los procesos de fermentación.

En este contexto, el objetivo del presente estudio fue investigar el uso de


subproductos de la agroindustria babassu, que son materiales renovables, para
producir un complejo de enzimas hidrolíticas para obtener un medio de cultivo con
alta concentración de glucosa. Dicho medio de cultivo genérico rico en glucosa puede
usarse como un bloque de construcción para varias bioconversiones dentro del
concepto de biorrefinería. En el presente estudio, investigamos el proceso de
producción de etanol a partir de la hidrólisis granular simultánea y la fermentación.

.1 . Materias primas

El pastel de babasú y la harina de babasú fueron proporcionados amablemente por


TOBASA Bioindustrial de Babaçu SA (Tocantinópolis, Brasil). La harina de babasú se
recibió con un tamaño de partícula promedio de 142 ± 9 μm, determinado con
tamices de 24 a 400 mallas Tyler. La harina se usó para todos los experimentos de
hidrólisis sin ningún tratamiento previo.

La caracterización química de la harina de babasú (determinación del almidón,


proteína, hemicelulosa, celulosa y lignina) se llevó a cabo de acuerdo con los métodos
estándar publicados por el Instituto Adolfo Lutz [13] y AOAC [14] . También se adoptó
el método de fibra detergente neutra modificado para muestras con alto contenido de
almidón [15] . Los análisis se realizaron por triplicado.

Una harina de maíz amarilla comercial (Yoki Alimentos, Brasil) utilizada presentó un
12,6% de humedad y su composición, según el proveedor, fue de 82% de almidón y
7,4% de proteína, en seco.

2.2 . Mantenimiento de microorganismos

La cepa Aspergillus awamori IOC-3914 se obtuvo de la colección de cultivos del


Instituto Oswaldo Cruz (IOC) (Río de Janeiro, Brasil) y se seleccionó por su capacidad
para producir amilasas en un trabajo anterior [16] . El hongo se mantuvo
rutinariamente a 30 ° C en medio de avena como se describe en Castro et al. [11] .

Para la producción de etanol, se utilizó una cepa de levadura industrial (


Saccharomyces cerevisiae JP1). Para propagar el inóculo, las células de levadura se
cultivaron a 32 ° C durante 18 h en medio YPD estándar (en g / L, extracto de
levadura: 10; peptona: 20 y glucosa: 20).

2.3 . Extracto de enzima de fermentación en estado sólido y producto de enzima


comercial.

Se utilizaron dos preparaciones de enzimas en los experimentos de hidrólisis: uno


comercial y otro producido in situ por fermentación en estado sólido de torta de
babassu. Para la producción de este último, la propagación del inóculo consistió en la
inoculación de esporas de hongos (2,5 × 10 5 / mL) en medio líquido (35 g / L de
extracto de malta) en matraces cónicos de 250 mL y el cultivo a 30 ° C durante 28 h a
200 rpm. La biomasa fúngica así obtenida se inoculó en torta de babassu (9.2 mg de
células secas / g de torta seca ) y el contenido de humedad se ajustó al 62%. Las
bandejas se incubaron en incubadoras humidificadas durante 120 horas a 23ºC .
Bandejas enteras fueron sometidas a extracción de enzimas, como se describió
anteriormente.[11] . El extracto enzimático hidrolítico (HEE) resultante se liofilizó, se
almacenó a -20 ° C y se solubilizó en agua estéril en el momento de su uso.

También se analizó un producto enzimático comercial (CEP) que contiene α-amilasas


de Aspergillus kawachi y glucoamilasas de Trichoderma reesei , comercializado para la
hidrólisis del almidón, con el fin de buscar esta comparación.

2.4 . Hidrólisis enzimática del almidón.

Los experimentos de hidrólisis se llevaron a cabo en condiciones de temperatura


controlada, ya sea a temperaturas constantes (30–60 ° C) o con un cambio de
temperatura hasta 32 ° C después de 4 h. Los experimentos de hidrólisis se realizaron
por duplicado.

El HEE se usó en diferentes actividades amilolíticas (4.5–45 U / mL) para hidrolizar la


harina de babasú en concentraciones de 126 a 236 g / L. El pH de las suspensiones se
ajustó a 4,8 usando ácido sulfúrico, cuando fue necesario. Los experimentos de
hidrólisis se llevaron a cabo por triplicado en reactores pequeños, ya sea en modo
discontinuo o en modo alimentado por lotes, hasta 72 h. La agitación se realizó con un
agitador magnético y se añadió azida sódica (0,2 g / L) a todos los experimentos de
hidrólisis para evitar la contaminación. Las muestras de la mezcla de reacción se
tomaron periódicamente, se centrifugaron a 10.000 g durante 10 minutos y los
sobrenadantes se recogieron para la cuantificación de la glucosa. Las muestras se
almacenaron a 4 ° C si no se analizaron inmediatamente para determinar su contenido
de glucosa.

2.5 . Produccion de etanol

Las fermentaciones alcohólicas se llevaron a cabo mediante sacarificación y


fermentación simultáneas (SSF) o hidrólisis y fermentación separadas (SHF) utilizando
harina de babassu. Todas las fermentaciones por lotes se realizaron por duplicado, en
las mismas condiciones de babassu o harina de maíz (190 g / L) y actividad enzimática
(20 U / mL). Las diferentes estrategias investigadas se resumen en la Tabla 1 .

Tabla 1 . Descripción de estrategias con condiciones de hidrólisis y fermentación.

Estrategia HEE CEP Pre-SSF a Hidrólisis a Inóculo De Tiempo de


50 ° C (h) 32 ° C (h). Levadura (g / L) fermentación (h)
Estrategia I Y Y 4 - 0.5 68
Estrategia I - Y norte 4 - 0.5 68
Maíz
Estrategia II Y norte 4 44 4.5 24
Estrategia III Y norte - - 0.5 72
Lote de Y norte 4 - 0.5 68
Estrategia HEE CEP Pre-SSF a Hidrólisis a Inóculo De Tiempo de
50 ° C (h) 32 ° C (h). Levadura (g / L) fermentación (h)
alimentación
SHF Y norte - 24 0.5 72

Todas las estrategias de producción de etanol se describen a continuación:

•Estrategia I - La preparación de enzimas (HEE liofilizada o CEP) se disolvió en agua y


luego se aplicó para iniciar la hidrólisis de babassu o harina de maíz. La hidrólisis se
inició en pequeños reactores con agitación magnética colocados en un baño de agua a
50 ° C. El pH se ajustó a 4,8 con ácido sulfúrico para experimentos con CEP. Después
de 4 h de hidrólisis inicial (pre-SSF), se añadió la levadura propagada (0,5 g / l de
levadura de masa seca). La fermentación se mantuvo a 32 ° C con agitación magnética
durante 72 h. Los reactores tenían un sistema de bloqueo de aire para la liberación de
CO 2 y para prevenir la contaminación.

•Estrategia II: en esta estrategia se utilizó un inóculo de levadura superior (4.5 g / L de


levadura de masa seca), y la hidrólisis inicial fue más larga, comprendiendo 4 horas a
50 ° C más 44 horas a 32 ° C, seguida de una fermentación más corta Tiempo (24 h).
Esta estrategia se realizó solo para HEE y harina de babassu.

•Estrategia III: esta estrategia fue idéntica a la estrategia I, excepto que no se realizó
pre-SSF de 4 h de longitud, es decir, los experimentos se realizaron durante todo el
tiempo a 32 ° C. Esta estrategia se realizó solo para HEE y harina de babassu.

•Estrategia IV (estrategia de lotes alimentados): esta estrategia fue similar a la


estrategia I, pero con adiciones de harina de babasú (10% de su masa inicial cada vez)
después de 1 h, 2 hy 4 h de pre-SSF, seguido de 24 h de fermentación. Esta
estrategia se realizó solo para HEE y harina de babassu.

•Estrategia V (SHF): la hidrólisis se mantuvo durante 24 horas a 50 ° C. Al final de la


hidrólisis, se centrifugó a 11,000 g en condiciones estériles, seguido de filtración al
vacío (membrana con 0,45 µm) y se transfirió nuevamente al sistema de reacción,
donde se transfirió el inóculo de la levadura. La fermentación alcohólica se llevó a cabo
posteriormente durante hasta 72 h.

2.6 . métodos analíticos

La actividad amilolítica de los extractos crudos de fermentación en estado sólido se


analizó de acuerdo con Castro et al. [11] utilizando un kit de análisis de glucosa
(Laborlab, Brasil) para cuantificar el producto de la reacción enzimática. En este
trabajo, la actividad de la enzima se expresó en unidades por volumen de extracto de
enzima (U / mL).
La glucosa liberada durante los experimentos de hidrólisis se cuantificó utilizando el
mismo kit de ensayo de glucosa. La concentración de nitrógeno aminoacídico libre
(FAN) se analizó mediante el método colorimétrico de ninhidrina, como se informó
anteriormente [17] .

El etanol y el glicerol se analizaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento


(HPLC) (Agilent Technologies, EE. UU.), Utilizando una columna HPX-87H (Bio-Rad
Laboratories, EE. UU.). La fase móvil fue ácido sulfúrico 0,005 M en agua ultrapura, se
inyectó a un caudal de 0,6 ml / min y la temperatura del horno fue de 65 ° C. Además,
algunas muestras de glucosa también se analizaron con una columna HPX-87P (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, EE. UU.), Las temperaturas del horno y el detector se ajustaron
a 80 ° C y 35 ° C respectivamente y se utilizó agua desionizada como fase móvil a una
temperatura móvil. Caudal de 0,6 ml / min.

Los datos se expresan como media ± una unidad de desviación estándar.

2.7 . Microscopía electrónica de barrido (SEM)

Para la observación de los gránulos de almidón antes y después de la hidrólisis, la


biomasa se lavó dos veces con agua destilada, se deshidrató con etanol y luego se
liofilizó. El polvo de almidón seco se colocó en una placa metálica y se cubrió con una
capa de oro de 30 nm utilizando un dispositivo de pulverización de iones JFC-1500
(JEOL Co. Ltd., Japón) bajo atmósfera de argón. Las muestras se examinaron luego con
un microscopio electrónico de barrido Quanta 200 (FEI, EE. UU.). Se examinaron
múltiples micrografías de cada muestra con diferentes aumentos. Los experimentos de
control se llevaron a cabo utilizando agua destilada en lugar de extracto enzimático y
las muestras extraídas se sometieron a los mismos tratamientos descritos
anteriormente.

3 . Resultados y discusión

3.1 . Composición de la harina de babasú

La harina de babasú se analizó para determinar su composición ( Tabla 2 ). Su


componente principal es el almidón (60%), pero también comprende otras fracciones
que se pueden convertir en azúcares fermentables mediante hidrólisis enzimática (por
ejemplo, celulosa que también se puede convertir en glucosa). Estos datos están en el
mismo rango que los reportados para la harina de babasú por Baruque Filho et al. [10]
, 58% de almidón y 2,7% de proteína en base seca. El alto contenido de almidón hace
de esta materia prima una excelente fuente de carbono, con un gran potencial para su
hidrólisis por enzimas amilolíticas para producir un medio rico en azúcar que se puede
utilizar en procesos de fermentación con muchos microorganismos.
Tabla 2 . Composición media de la harina de babasú.

Componentes Contenido (% m / m)
Humedad (base húmeda) 11.06 ± 0.68
Almidón (base seca) 60.05 ± 1.37
Proteína (base seca) 2.98 ± 0.08
Hemicelulosa (base seca) 7.94 ± 0.27
Celulosa (base seca) 13.53 ± 0.31
Lignina (base seca) 15.79 ± 0.32

3.2 . Hidrólisis en frío de almidón crudo utilizando HEE producido por fermentación en
estado sólido

Estudios previos de nuestro grupo habían demostrado que el complejo HEE producido
por la fermentación en estado sólido de la torta de babassu mostraba una actividad
amilolítica óptima en un rango de pH entre 4.0 y 5.0 y una temperatura cercana a 50 °
C [17] . En el presente trabajo, se evaluaron algunas condiciones experimentales para
el desarrollo de la estrategia de hidrólisis de almidón granular. Los experimentos a
diferentes temperaturas constantes (30 ° C, 32 ° C, 40 ° C, 50 ° C y 60 ° C) se
realizaron durante 24 h para evaluar el efecto de esta variable sobre la hidrólisis
enzimática de la harina de babassu ( Fig. 1 ) . Una carga de enzima de 20 U / mL de
actividad amilasa (base de exoamilasa) y 190 Se usaron g / l de harina de babasú. El pH
se mantuvo durante toda la reacción a 4,8, sin necesidad de ajuste.

Fig. 1 . Perfiles cinéticos de hidrólisis de almidón de harina de babasú a diferentes


temperaturas. El control negativo se realizó sin enzima a 60ºC

A 50 ° C y 60 ° C, la producción de glucosa fue considerablemente mayor en


comparación con otras temperaturas, alcanzando altas concentraciones de glucosa
(30–40 g / L) tan pronto como en 2 h de reacción. Se puede observar que, incluso a
bajas temperaturas (30 ° C y 32 ° C), la concentración de glucosa alcanzó 49.5 g / L y
56.0 g / L después de 24 h, representando el 38.5% y 43.7% de la eficiencia de
hidrólisis, respectivamente. A 50 ° C, la eficiencia final de hidrólisis fue del 70,0% (89,4
g / L de glucosa) y la velocidad de hidrólisis a las 4 h de la reacción fue de 10,8 g / (L
h). Hidrólisis enzimática a 60ºC. Los ° C llevaron a concentraciones aún mayores de
glucosa, pero a esta temperatura la materia prima estaba cerca de la gelatinización.
Este proceso, que comienza alrededor de 4–10 ° C por debajo de la temperatura de
gelatinización promueve un aumento de la viscosidad, además se informa que se
encuentra entre 63 ° C y 73 ° C para el almidón de la harina de babassu [18] . De
hecho, se observó un aumento de la viscosidad durante el experimento llevado a cabo
a 60 ° C. Por lo tanto, las temperaturas superiores a 50 ° C no se usaron en
experimentos adicionales.

La estrategia de la hidrólisis de la harina de babasú con una temperatura constante de


50 ° C para la hidrólisis inicial y la sacarificación (pre-SSF) se examinó adicionalmente
enfocando la tasa de hidrólisis y la estabilidad de las enzimas amilolíticas. Por lo tanto,
se evaluó una estrategia de hidrólisis que comprende un primer paso corto a 50 ° C,
seguido de un segundo paso a 32 ° C hasta el final del experimento. Esta estrategia,
llamada almidón híbrido SSF, tenía como objetivo tener una alta tasa de hidrólisis al
comienzo del proceso, mientras se mantenía la hidrólisis después de la inoculación de
la levadura. El pre-SSF proporciona hidratación a la materia prima, lo que hace que los
gránulos de almidón sean más susceptibles a la acción hidrolítica y también promueve
una liberación inicial de glucosa [19] , [20] . Li et al. [21]estudió el efecto de un
tratamiento previo a 5 ° C por debajo de la temperatura de gelatinización de los
almidones de maíz y triticale. Según los autores, este paso incrementó la productividad
de la hidrólisis (4-8% a 48 h de hidrólisis), como se indicó en el presente trabajo.

La Tabla 3 muestra los resultados de los experimentos realizados para evaluar la


influencia de la carga de enzimas (de 4.5 a 45 U / mL) con un cambio de temperatura
de 50 ° C a 32 ° C, utilizando 190 g / L de harina de babassu. Los resultados
presentados en la Tabla 4 muestran la eficiencia de hidrólisis y la producción de
glucosa que fija una carga de enzimas, evaluando 126-236 g / L de harina de babasú,
con una producción máxima de glucosa obtenida a 190 g / L de harina. La Tabla 3
muestra que en el rango de 4.5 U / mL – 20 U / mL, a mayor actividad enzimática, se
liberó una mayor glucosa, obteniendo un máximo de eficiencia de hidrólisis de 54.9% a
20 U / mL. Sin embargo, los resultados en la Tabla 3 yLa Tabla 4 muestra que el uso de
una carga de enzimas por encima de 20 U / mL no produjo un aumento en la eficiencia
de la hidrólisis. Además, el aumento en la concentración de harina de babassu no
representó un aumento en la producción de glucosa por encima de 190 g / L, sino
todo lo contrario: un mayor contenido de sólidos podría haber causado una limitación
en la transferencia de masa, lo que llevó a una menor producción de glucosa. Vale la
pena mencionar que el extracto de enzima comprende un conjunto complejo de
enzimas no purificadas obtenidas de la fermentación en estado sólido, que agrega un
alto contenido de sólidos al sistema. Por lo tanto, las condiciones seleccionadas para
llevar a cabo los siguientes experimentos fueron la concentración de harina de babasú
de 190 g / L y la carga de enzimas de 20 U / mL, según la alta productividad de glucosa
alcanzada.

Tabla 3 . Efecto de la carga de enzimas en la hidrólisis del almidón a partir de 190 g / L


de harina de babasú. La hidrólisis se llevó a cabo a 50 ° C durante 6 hy luego a 32 ° C
durante 18 h más.

Respuesta 4.5 U / mL 20 U / mL 32.5 U / mL 45 U / mL


Glucosa inicial (g / l) 0.27 ± 0.06 0.51 ± 0.19 0.64 ± 0.07 0.61 ± 0.05
Glucosa a las 24 h (g / L) 42.57 ± 3.66 70.17 ± 3.19 61.03 ± 1.57 60.19 ± 0.77
Eficiencia de hidrólisis (%) 33.4 ± 2.91 54.9 ± 2.37 47.6 ± 1.24 47.0 ± 0.61
Tabla 4 . Efecto de la concentración de harina de babasú en la hidrólisis del
almidón de la harina de babasú usando 20 U / mL de actividad amilolítica.

Respuesta 126 g / l 158 g / l 190 g / l 236 g / l


Glucosa inicial (g / L) 0.25 ± 0.04 0.27 ± 0.02 0.51 ± 0.19 0.62 ± 0.04
Glucosa a las 24 h (g / L) 50.32 ± 1.93 53.77 ± 1.51 70.17 ± 3.19 63.54 ± 3.26
Eficiencia de hidrólisis (%) 59.5 ± 2.34 50.8 ± 1.42 54.9 ± 2.37 39.9 ± 2.04

Con el fin de evaluar el proceso de hidrólisis para un período más largo (72 h), una
carga enzimática de 20 U / ml a pH = 4,8 y una concentración inicial de harina de
babasú de 190 g / L se investigó a 50 ° C durante 4 h seguido de 68 ha 32ºC . Estos
experimentos se llevaron a cabo no solo con el HEE, sino también con un producto
enzimático comercial (CEP) para buscar esta comparación ( Fig. 2 ). La misma carga de
enzimas (20 U / mL) se usó para HEE y CEP para facilitar la comparación, aunque este
es un valor mayor que la carga sugerida por el proveedor de CEP, (5.4 g / kg de
materia prima utilizada, en comparación con 1.2 g / kg materia primasugirió).
También es importante mencionar que la temperatura de 50–32 ° C está en el rango
recomendado por el proveedor de CEP. La producción de nitrógeno amino libre (FAN)
durante la hidrólisis de babasú se controló durante la hidrólisis con HEE y también se
muestra en la Fig. 2 .
Fig. 2 . Perfiles cinéticos de la hidrólisis del almidón a partir de harina de babasú
durante 72 h. La línea de puntos indica el cambio de temperatura de 50 ° C a 32 ° C.

La producción de glucosa con HEE fue superior a la obtenida con CEP. Al final de las 72
h, la HEE producida in situ por la fermentación en estado sólido promovió la liberación
de 110.9 ± 6.6 g / L de glucosa en comparación con 74.5 ± 1.8 g / L de glucosa
obtenida al utilizar la preparación de enzimas comerciales. La eficiencia de hidrólisis
con HEE fue de 87.0%. Sin la presencia de los biocatalizadores (control negativo), la
hidrólisis del almidón fue insignificante.

Estos resultados indican que la HEE producida por A. awamori muestra un excelente
potencial para la hidrólisis granular del almidón. Pickens y Niekamp [22] evaluaron la
hidrólisis enzimática del almidón granular a 55 ° C durante 96 h y observaron una
eficiencia de hidrólisis del 88%. Li et al. [21] investigaron durante 96 h la hidrólisis del
almidón granular a 30 ° C mediante enzimas comerciales, utilizando maíz y triticale,
obteniendo 60% y 64% de eficiencia de hidrólisis, respectivamente. Božid et al
evaluaron la digestión de almidón crudo de triticale, trigo, papa, rábano picante y maíz,
a una concentración de 10 g / L de la materia prima. [23]y la eficiencia alcanzó el 63%,
60%, 59%, 52% y 37%, respectivamente, en un período de 4 horas a 65 ° C. Por lo
tanto, los datos de este trabajo presente, en comparación con la literatura, muestran
que el proceso propuesto basado en babassu es prometedor.

Los mejores resultados obtenidos con HEE en comparación con CEP se deben
probablemente a las enzimas accesorias que están presentes en HEE [17] , ya que el
producto comercial se compone básicamente de enzimas amilolíticas. Otras enzimas,
como las proteasas y las xilanasas, contribuyen a una mejor degradación de los
gránulos de almidón, lo que conduce a una mejor accesibilidad del almidón por las
amilasas. Wang et al. [24] demostró que el uso de proteasas aumentó la producción de
etanol a partir de maíz en un 8% y redujo la carga del producto enzimático comercial
utilizado (Stargen ™).

La figura 2 también muestra el perfil de FAN que aumenta a partir de una


concentración inicial de 830–1113 mg / L después de 48 h de hidrólisis,
permaneciendo aproximadamente constante a partir de entonces. El valor inicial no
despreciable se debe al alto contenido de nitrógeno del propio HEE que resulta de los
aminoácidos liberados por hidrólisis durante la producción de enzimas y la extracción
de enzimas. Es importante señalar que los valores de FAN producidos con CEP, aunque
se midieron, ni siquiera se mostraron en el documento, ya que permanecieron cerca
de cero (el valor máximo medido fue de 36.9 mg / L FAN). La importancia del
contenido de FAN y su relación con la fermentabilidad se examinaron más a fondo
durante los ensayos de producción de etanol y se discutirán más adelante.

Con el fin de permitir la visualización de los gránulos de almidón y una mejor


comprensión de la acción de las enzimas presentes en el HEE, se extrajeron muestras
de los gránulos durante la hidrólisis y se analizaron mediante microscopía electrónica
de barrido (SEM). La Fig. 3 muestra fotografías SEM de gránulos de almidón nativos en
agua (control) y gránulos digeridos después de la hidrólisis con HEE. Como se muestra
en la Fig. 3 , los gránulos de almidón de la harina de babasú se degradaron
progresivamente a las 72 h de la hidrólisis. Los gránulos de almidón nativo tenían una
forma esférica y sus superficies eran lisas y prácticamente sin rasguños ( Fig. 3 a),
mientras que las superficies de los gránulos hidrolizados se erosionaban ampliamente
con numerosas grietas ( Fig. 3b – d). Es importante mencionar que después de 72 h,
los gránulos de almidón visibles eran solo unos pocos y mucho más dispersos. La
mayoría de ellos se desintegraron totalmente debido a la extensión de la
degradabilidad.

Fig. 3 . Micrografías SEM de gránulos de almidón de harina de babasú hidrolizados con


extracto de enzima hidrolítica. (a) Gránulos nativos (control negativo); (b) después de 4
h de hidrólisis; (c) después de 24 h de hidrólisis; (d) Después de 72 h de hidrólisis.
De acuerdo con las micrografías que se muestran, las enzimas presentes en HEE
parecen haber actuado sobre los gránulos de almidón que muestran una degradación
de tipo centrípeta, así como una degradación periférica de tipo centrífuga. La
degradación centrípeta se produce desde la superficie hasta el centro del gránulo, con
las enzimas progresando a lo largo de las cadenas de polisacáridos, formando
cavidades en la superficie. Por otro lado, la erosión centrífuga causada por enzimas
atrapadas dentro de los gránulos puede detectarse, desde una vista externa del
gránulo, a partir de la presencia de pequeños poros formados en la superficie [25] .
Sarikaya et al. [26] también observaron hidrólisis enzimática centrífuga y centrípeta en
los gránulos de almidón de maíz, arroz y trigo.

3.3 . Produccion de etanol

Los resultados de la hidrólisis granular de almidón de la harina de babasú por parte de


HEE indicaron la producción de una materia prima microbiana genérica que contiene
no solo carbono, sino también fuentes de nitrógeno. El hidrolizado de harina, por lo
tanto, se evaluó como medio de cultivo para la fermentación microbiana con la
levadura S. cerevisiae .

La Fig. 4 muestra el curso temporal de los procesos de fermentación alcohólica


realizados de acuerdo con la estrategia I con ambas preparaciones de enzimas (HEE y
CEP). Para el proceso basado en CEP, la adición de una fuente externa de nitrógeno al
medio fue necesaria para tener contenidos de nitrógeno comparables en medios de
fermentación. De este modo, se agregaron extracto de levadura y peptona (7,5 g / L y
15 g / L, respectivamente) para dar como resultado una concentración de FAN similar
a la del hidrolizado HHE (667 mg / L). La glucosa inicial se consumió y en 20-24 En la
fermentación, su concentración fue cercana a cero, permaneciendo baja hasta el final
del proceso. En base a esto, se puede inferir que, a partir de este tiempo de proceso,
las tasas de producción y consumo de glucosa fueron equivalentes, lo que dio como
resultado una condición de estado casi estable con respecto a la glucosa. La
concentración de etanol en el proceso basado en HEE fue de 32.3 g / L a las 20 h de
fermentación y de 53.6 g / L a las 48 h, lo que demuestra que hubo un consumo de
glucosa incluso sin acumulación de glucosa en el medio, lo que confirma que la
levadura se convirtió rápidamente en etanol. La glucosa se libera continuamente por
hidrólisis.
Fig. 4 . Los perfiles cinéticos de la producción de etanol a partir de harina de babasú se
llevaron a cabo de acuerdo con la estrategia I (pre-SSF durante 4 horas a 50 ° C,
seguidos de la inoculación de levadura y el proceso de SSF durante 68 h más)
utilizando extracto de enzimas hidrolíticas (HEE) en el sitio y comercial Producto
enzimático (CEP).

La producción de etanol en el proceso basado en CEP fue significativamente menor


que en el proceso basado en HEE: se obtuvo una concentración máxima de etanol de
aproximadamente 32 g / L con CEP a partir de 48 h, en comparación con
aproximadamente 54 g / L con HEE , bajo las mismas condiciones de proceso. A pesar
de las diferencias en la producción de etanol, los perfiles cinéticos de la glucosa y el
consumo de FAN fueron similares. Esto se debe principalmente a las características de
la levadura, que parece consumir un promedio de 300 mg / L de FAN a lo largo del
proceso SSF. Según Novo et al. [27] , el nitrógeno se consume principalmente en las
primeras 24 h de fermentación debido al hecho de que las células de levadura no
utilizan eficazmente el nitrógeno después de la fase de crecimiento exponencial.

Para la estrategia I, la harina de maíz también se examinó como materia prima para la
hidrólisis y producción de etanol ( Fig. 5 ), tanto para la comparación con la harina de
babasú como para buscar la evaluación del potencial HEE para actuar sobre una
materia prima generalizada. Se usó una harina de maíz amarilla comercial en las
mismas condiciones adoptadas para la harina de babasú (190 g / L de harina de maíz y
20 U / ml de actividad de amilasa HEE), con el objetivo de tener condiciones similares
a los experimentos anteriores con babasú. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el
contenido de almidón en la harina de maíz es más alto que en la harina de babasú,
82% y 60% en base seca, respectivamente.
Fig. 5 . Los perfiles cinéticos de la producción de etanol a partir de la harina de maíz se
llevaron a cabo de acuerdo con la estrategia I (pre-SSF durante 4 horas a 50 ° C,
seguidos de la inoculación de levadura y el proceso SSF durante otras 68 h) utilizando
extracto de enzima hidrolítica en el sitio (HEE).

En 24 h, el proceso se completó, por lo tanto, en menos tiempo que para la harina de


babassu para las mismas condiciones de hidrólisis y fermentación. La concentración de
etanol fue de 78.0 g / L después de 24 hy de 82.6 g / L después de 72 h. Con respecto
al perfil de FAN, se observó un consumo total de 236 mg / L a lo largo de todo el
proceso. La concentración de glicerol alcanzó un máximo de 1.7 g / L (en 48 h). Una
producción baja de este subproducto es deseable ya que cambia el metabolismo de la
glucosa a glicerol, disminuyendo así el rendimiento de etanol.

Sobre la base de los mejores resultados que se obtuvieron con HEE, se evaluó en
estudios adicionales que variaron las condiciones de hidrólisis / fermentación según las
estrategias II y III descritas anteriormente. La Tabla 5 resume los resultados obtenidos
en todos los experimentos de SSF y SHF, permitiendo una comparación de CEP y HEE
como biocatalizadores, de babassu y harina de maíz como materia prima, así como de
las diferentes condiciones de hidrólisis / fermentación.

Tabla 5 . Resumen de los procesos de SSF realizados con diferentes materias primas
(harina de babasú y harina de maíz), diferentes preparaciones de enzimas (HEE y CEP)
bajo diferentes estrategias (I, II, III y IV) y también la estrategia V (SHF). Los datos se
calcularon considerando un tiempo de fermentación de 48 h, excepción para la
estrategia I con harina de maíz y la estrategia II considerando 24 h.

Experimentar Glicerol (g Etanol (g / Rendimiento Productividad Eficiencia


/ L) L) (getanol / (g / L h) del proceso
g glucosa ) (%)
Estrategia I 1,68 ± 0,20 53.61 ± 1.07 0.42 1.12 82.98 ± 1.66
(HEE, harina de
babassu)
Experimentar Glicerol (g Etanol (g / Rendimiento Productividad Eficiencia
/ L) L) (getanol / (g / L h) del proceso
g glucosa ) (%)
Estrategia I 0.99 ± 0.07 32.08 ± 1.10 0.25 0.67 49.65 ± 1.71
(CEP, harina de
babasú)
Estrategia I 4.54 ± 0.27 77.98 ± 1.41 0.45 3,25 87.72 ± 0.79
(HEE, harina de
maíz)
Estrategia II 2.13 ± 0.58 45.57 ± 3.55 0.36 1.90 70.54 ± 5.50
(HEE, harina de
babassu)
Estrategia III 0.66 ± 0.03 44.88 ± 0.37 0.36 0.95 69.46 ± 0.58
(HEE, harina de
babassu)
Estrategia IV 3.00 ± 0.17 59.15 ± 0.62 0.36 1.23 70.70 ± 0.74
(HEE, harina de
babasú)
Estrategia V 1.57 ± 0.40 32.90 ± 0,67 0.26 0.69 50.92 ± 1.04
(HEE, harina de
babasú)

En base a los resultados presentados en la Tabla 5 , se puede observar que bajo las
mismas condiciones de la estrategia I, es decir, cuando se realizó pre-SSF durante 4
horas a 50 ° C, el proceso de fermentación con HEE mostró una ventaja considerable
frente al CEP. Además, la necesidad de suministrar una fuente externa de nitrógeno y
ajustar el pH en el caso del proceso basado en CEP son desventajas para el producto
comercial, ya que para el HEE solo se utilizaron extracto de enzimas, agua, harina de
babasú y levadura.

Los mejores resultados del presente trabajo se obtuvieron bajo la estrategia I con HEE
y harina de babasú o harina de maíz. Estos resultados se comparan bien con los
obtenidos por otros autores para otras materias primas. Pranamuda et al. [28]
obtuvieron una eficiencia de conversión de etanol de 70.5% a partir de gránulos de
almidón de sagú, mientras que Rattanachomsri et al. [2] reportaron una productividad
de 0.48 g / (L h) y una eficiencia de 85.4% con el uso de pulpa de tapioca no
gelatinizada. Bialas et al. [29] , utilizando harina de maíz, obtuvo una productividad de
1.32 g / (L h) y 84.6% de eficiencia en 72 h usando amilasas y proteasas comerciales.
Wang et al. [7]informó una eficiencia del 86.4% con el maíz, bajo la adición de una
fuente externa de nitrógeno (sulfato de amonio). Baruque Filho et al. [30] informaron
un rendimiento de 0,6 l de etanol por kg de almidón de harina de babasú con el
proceso convencional (licuefacción y gelatinización), que corresponde a una
conversión del 82,4% de almidón en etanol, utilizando enzimas comerciales. Por lo
tanto, el presente proceso con una hidrólisis granular de almidón a temperatura de
sub-gelatinización fue igualmente eficiente en comparación con el proceso
convencional para la misma materia prima.

La estrategia II comprendió un pre-SSF más largo y un tiempo de fermentación más


corto. La productividad aumentó de 1.12 g / (L h) a 1.90 g / (L h) y se produjo 45.6 g
/ L de etanol en un tiempo de fermentación más corto (24 h). Sin embargo, el tiempo
total del proceso fue más largo (48 h de pre-SSF más 24 h de fermentación) en
comparación con la estrategia I (4 h de pre-SSF más 48 h de fermentación).

Una comparación entre las estrategias I y III muestra que el paso corto pre-SSF de 4
horas a 50 ° C incluido en la estrategia I mejoró el rendimiento del proceso. La
estrategia III, donde no se incluyó pre-SSF, condujo a una menor producción de etanol
(45.68 g / L) y menor eficiencia (70.7%). El proceso bajo la estrategia III mostró una
cinética más lenta, probablemente debido al hecho de que al comenzar la
fermentación no había una fuente de carbono disponible, mientras que en el proceso
llevado a cabo bajo la estrategia I, la glucosa estaba presente desde el inicio de la
fermentación.

Cuando se adoptó una estrategia de alimentación discontinua, la producción de etanol


fue de 59,15 g / L, que es mayor que la observada para la estrategia I para el mismo
tiempo de proceso (53,61 g / L), por lo que su productividad también fue mayor (1,23
g / L). h)). Sin embargo, hubo una pérdida en la eficiencia del proceso de 83.0%
(estrategia I) a 70.7% (estrategia IV). La razón detrás de la estrategia de alimentación
discontinua fue proporcionar más sustrato (almidón de babasú) para la hidrólisis sin
riesgo de enfrentar limitaciones de transferencia de masa, a fin de aumentar la
producción de etanol. Este objetivo se logró, pero como una fracción más baja de la
harina se convirtió en etanol, la eficiencia disminuyó. Además, cuando se comparan los
procesos SHF (estrategia V) y SSF (estrategia I), se puede observar que la estrategia V
presentó un rendimiento menor que el proceso simultáneo. Al final de las 48 h de
fermentación se produjeron (32.90 ± 0.67) g / L, con una productividad de 0.69 g / (L
h).

Con respecto a la fermentación alcohólica con HEE para la producción de etanol a


partir de maíz, productividades tan altas como 3.25 g / (L h) combinadas con un buen
rendimiento (0.45 g etanol / g glucosa ), una alta eficiencia (87.7%) y una
concentración significativa de etanol. (78 g / L) dentro de las 24 h de la fermentación
indican un alto potencial de los complejos multienzimáticos producidos por la
fermentación en estado sólido. Lamsal et al. (2011), utilizando una alta concentración
de sólidos (> 300 g de peso seco de maíz por L), obtuvieron una productividad de 1.32
g / (L h) y más del 18% (v / v) de etanol en 96 h de proceso. a 27 ° C. Weller et al. [31]
en 72 h a 32. ° C convirtió el 89.6% del almidón de maíz en etanol con una
productividad de 0.96 g / (L h) mientras que Lewis et al. [32] reportaron una
productividad de 2.32 g / (L h) y 88.9% de eficiencia para un proceso de SSF que
utiliza harina de maíz a 28 ° C durante 65 h. Con respecto al proceso de maíz
convencional de molienda en seco, los datos de la industria indican que la
concentración de etanol al final de la fermentación está en el rango de 80–110 g / L
[33] , [34] , [35] . Según Roehr [36] , las productividades están en el rango de 1.8–2.5 g
/ (L h) para procesos de lotes industriales y alrededor de 6 g / (L h) para procesos
continuos.

Por lo tanto, se puede concluir que el proceso propuesto en este trabajo, utilizando
enzimas producidas internamente por la fermentación en estado sólido de un
subproducto agroindustrial para la hidrólisis del almidón granular, muestra un
rendimiento comparable al del etanol convencional a escala industrial. Proceso de
producción a partir del maíz.

4 . Conclusiones

Los complejos de enzimas que contienen amilasas y otras hidrolasas se produjeron a


partir de un residuo agroindustrial mediante fermentación en estado sólido. El
extracto de enzima hidrolítica (HEE) en el sitio fue capaz de actuar sobre la harina de
babasú y la harina de maíz convirtiendo el almidón granular en glucosa y liberando
FAN de las materias primas. En 72 h, la concentración de glucosa alcanzó 110.9 g / L y
la eficiencia de hidrólisis alcanzó el 87%. El proceso de SSF con HEE realizado en un lote
simple de harina de babasú con un cambio de temperatura de 50 ° C a 32 ° C
(estrategia I) permitió la conversión del 83% del almidón de la harina de babassu en
etanol, mientras que al utilizar eficiencias y productividades de harina de maíz Los
resultados obtenidos fueron similares o superiores a los reportados en la literatura
para el proceso de molienda en seco convencional a escala industrial.

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