LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL II 1

Determinación de azucares en residuos de aprovechamiento del cacao por cromatografía

liquida de alta resolución (HPLC)

Juliana María Patiño Medina

Universidad Santo Tomás, Bucaramanga, División de Ingenierías y Arquitectura, Facultad

de Química Ambiental

Febrero 28 de 2018

Resumen

El cacao es una planta que pertenece al orden Malvales, familia Esterculiáceas, género Thebroma,
especie cacao. Se originó en la cuenca del Amazonas, en estribaciones orientales de los Andes,
cerca de los límites de Colombia, Ecuador y Perú (Malespín, 1982, pág. 10). En la práctica de
laboratorio se analizó por medio de cromatografía liquida de alto desempeño (HPLC) un residuo
generado a partir del aprovechamiento del cacao, producto de diferentes procesos de
aprovechamiento de él, por el método de AGVS y metabolitos, el cual permite identificar la
existencia de azucares. Se empleo como fase móvil ácido sulfúrico 0,005M. Se encontró presencia
de los azúcares en evaluación, los cuales son glucosa, xilosa, arabinosa y celobiosa.

Palabras claves: Arabinosa, azúcar, cacao, celobiosa, cromatografía, glucosa, HPLC, residuos,
xilosa.

1 Introducción
El cacao es una planta que se cultiva cerca al ecuador por sus condiciones climáticas, ya que es
sensible a la escasez y exceso de agua. Los factores más influyentes sobre los cultivos de cacao
son la temperatura, precipitación, vientos, humedad relativa, suelo, luz y sombra. A este fruto se
le han realizado diferentes procesos químicos para obtener un aprovechamiento total de este, ahora
se plantea dar un uso a los residuos de dichos procesos, iniciando por la identificación de azucares
por medio de cromatografía liquida de alto desempeño.
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2 Objetivos
2.1 Identificar azucares en residuos de procesos químicos del cacao por medio de la
cromatografía liquida de alto desempeño (HPLC).
2.2 Determinar la sensibilidad del equipo HPLC por medio de la pendiente de la recta obtenida
de la curva de ajuste.
2.3 Reconocer por medio de la comparación entre los estándares visibles en la curva de ajuste y
la muestra según el cromatograma, los azucares que se encuentran presentes en el residuo de
cacao.
2.4 Cuantificar la concentración de azucares que se encuentren en el residuo de cacao a partir de
la ecuación de la recta.

3 Marco Teórico
La cromatografía liquida es una técnica analítica que permite la separación de diversos
compuestos, esta emplea como fase estacionaria una columna de separación y como fase móvil o
eluyente un líquido. Es empleada para análisis cualitativos y cuantitativos de compuestos
orgánicos solubles. La técnica de HPLC garantiza mayor sensibilidad y precisión con respecto a
la cromatografía liquida. (Giannini & Roani, 2003, pág. 64)

4 Estado del arte

El cacao es una planta de estrato bajo de los bosques húmedos tropicales, con clima cálido y
húmedo durante casi todo el año. Por ello sus cultivos se limitan a las zonas terrestres próximas al
Ecuador. Esta planta puede alcanzar de 15 a 20 metros de altura, y su máximo desarrollo a los 30
años. Su raíz es pivotante de rápido crecimiento con seis series de raíces secundarias laterales. El
cacao es cauliflor, esto significa que forma flores y frutos en el tallo, su flor es hermafrodita,
pentámera y sostenida por un pedicelo de 1 a 3 cm, en ella se encuentran cinco sépalos; en cuanto
sus pétalos, están formados por un capuchón, cogulla o concha encargada de cubrir las anteras del
estambre; también se encuentran los estambres y el pistilo. La forma y disposición de las flores
permiten una polinización únicamente entomófila. (Malespín, 1982, pág. 19)

El fruto de la planta de cacao es una vaina que contiene una pulpa dulce, antiguamente era
empleado para la elaboración de bebidas alcohólicas mientras que las semillas son las utilizadas
para fabricar el chocolate.
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5 Resultados y discusión
En la figura 1 se presenta el cromatograma del HPLC tomado de los residuos del cacao, para
obtenerlo, se empleó como fase móvil H2SO4 0,005M, relación residuo-agua 4 (0.4 mL) – 6 (0.6
mL), pH 3, con detector DAD y RID durante 30 minutos. Se debe tener en cuenta que el pH 3 es
la mínima concentración de H+ que se debe tener para evitar el deterioro de la columna.

Figura 1 Cromatograma relación 4-6

En la tabla 1 se observan los datos obtenidos en el cromatograma para la relación 4-6, la cual
corresponde a 0,4 mL de residuo de cacao y 0,6 mL de agua.

Tabla 1 Resultados del cromatograma para la relación 4-6

Relación 4-6
RID
Pico Tiempo de Azúcar Área Concentración Concentración
retención (min) (mUA*s) (diluida) (ppm) (ppm)
1 0,547 No identificado 9,097
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2 0,994 No identificado 113,973

3 1,256 No identificado 67,017
4 1,404 No identificado 40,109
5 1,606 No identificado 62,937
6 1,746 No identificado 46,528
7 1,868 No identificado 131,822
8 2,264 No identificado 103,967
9 2,488 No identificado 68,692
10 2,725 No identificado 16,043
11 2,956 No identificado 86,063
12 3,222 No identificado 14,779
13 3,373 No identificado 40,528
14 3,614 No identificado 16,335
15 3,913 No identificado 16,168
16 4,226 No identificado 34,662
17 4,568 No identificado 67,686
18 4,86 No identificado 85,237
19 5,076 No identificado 135,115
20 5,26 No identificado 109,680
21 5,501 No identificado 81,385
22 6,337 No identificado 138912,000
23 7,186 Celobiosa 40286,800 0,292 0,731
(inferior)
24 7,511 Celobiosa 48784,700 0,353 0,883
25 8,155 Glucosa 305025,000 2,205 5,512
(inferior)
26 8,865 Glucosa 935556,000 6,756 16,890
27 9,715 Xilosa 1413620,000 10,320 25,800
28 10,714 Arabinosa 43147,500 0,314 0,786
29 11,537 No identificado 7233,589
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30 11,93 No identificado 15639,500

31 12,667 No identificado 3618,096
32 13,298 No identificado 10762,800
33 14,04 No identificado 5314,052
34 15,353 No identificado 24997,600
35 16,582 No identificado 137,078
36 16,945 No identificado 2462,768
37 17,921 No identificado 2256,578
38 18,905 No identificado 38861,800
39 20,43 No identificado 445,158
40 20,52 No identificado 298,495
41 20,831 No identificado 592,176
42 21,249 No identificado 114,335
43 21,632 No identificado 762,069
44 23,118 No identificado 7953,202
45 24,714 No identificado 64,226

Bajo esta relación 4-6, para el RID, detector del índice de refracción, se obtienen tiempos de
retención entre 0.547 min y 24.714 min, en él se destacan seis picos donde se encuentran los
azucares evaluados, encontrados desde el 23 hasta el 28. No es posible identificar los otros tiempos
de retención porque no se encuentran dentro de la curva, o pueden ser otro tipo de compuesto, sin
embargo, los que tienen “(inferior)” es porque se encuentra un poco por debajo de la curva de
ajuste, pero que igualmente se le realizo el análisis de concentración.

Para la cuantificación de los azucares se tuvo en cuenta la curva de calibrado, realizada

previamente por Carolina Ochoa, en la cual se manejaban concentraciones de 0.01 a 0.1 ppm y
otra de 0.2 a 6 ppm, bajo las mismas condiciones de análisis, dependiendo de la concentración se
empleaba la ecuación obtenida en cada recta y en específico para cada azúcar. La concentración
determinada se encontraba diluida bajo la proporción ya mencionada, por ello fue necesario aplicar
el factor de dilución, lo que nos permite identificar la concentración real de la muestra, en su
totalidad. Se identifica en la muestra total una concentración de 0,731 y 0.883 ppm para la
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celobiosa, con mayor confiabilidad de la segunda concentración, glucosa 5.512 y 16.890 ppm,
nuevamente se genera una mayor veracidad al segundo valor, la xilosa 5,514 ppm, y la arabinosa
0,786 ppm. Estos cálculos se realizaron mediante el despeje en la ecuación de la recta, de x
correspondiente a la concentración. Según el coeficiente de variación es posible determinar el
porcentaje de confiabilidad de los resultados donde se obtienen en la glucosa 99.75% y 99.81%,
Xilosa 99.90% y 99.80%, Arabinosa 99.62% y 99.80% finalmente Celobiosa 99.89 y 99.82% para
concentraciones en el rango de 0.01 a 0.1 y de 0.2 a 6 ppm respectivamente. También es posible
determinar que existe una relación lineal fuerte entre el área y la concentración, donde el área va
a depender de la concentración del azúcar. La sensibilidad del equipo corresponde a la pendiente
de la recta la cual varía entre 143384 y 136843.

Se observa que el azúcar encontrado en mayor cantidad es la xilosa, este monosacárido permite
evaluar la absorción del intestino de los seres humanos, al medir la cantidad de este presente en la
orina y en la sangre. (Deska Pagana & James Pagana, 2006, pág. 1) Para emplear este residuo
como fuente de xilosa en el tratamiento de pacientes es necesario evaluar los procedimientos
previos a este, para evitar cualquier resultado no deseado. La alta concentración de xilosa
encontrada se puede deber a que en los tratamientos que recibió el fruto del cacao hasta llegar al
residuo evaluado, se realizó una hidrolisis, ya que este compuesto se aísla de las plantas, mediante
dicha técnica.

Para la determinación de azucares es recomendado emplear el DOR, detector de rotación óptica,

ya que estos tipos de compuestos poseen más de un carbono asimétrico, razón por la cual puede
presentar diferentes tipos de estereoisómeros. No se evalúa el detector DAD, detector de arreglo
de diodos, a causa de que en él no es posible determinar azucares porque como se generan tantas
rotaciones se observan longitudes de ondas más cortas, que se visualizan mejor en el DOR. El uso
del DAD en el método AGVS y metabolitos es para la determinación de ácidos grasos, mientras
que el RID si corresponde a los azucares. (Connors, 1981, pág. 301)

En la figura 2 se expone el cromatograma HPLC tomado de los residuos del cacao, para su
generación, se emplearon las mismas condiciones mencionadas con anterioridad, pero en este caso
se manejó una relación residuo-agua 2-8.
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Figura 2 Cromatograma relación 2-8

En la tabla 2 se observan los datos obtenidos en el cromatograma para la relación 2-8, la cual
corresponde a 0,2 mL de residuo de cacao y 0,8 mL de agua.

Tabla 2 Resultados del cromatograma para la relación 2-8

Relación 2-8
RID
Pic Tiempo de Área Concentración Concentració
Azúcar
o retención (min) (mUA*s) (diluida) (ppm) n (ppm)
1 0,576 No identificado 27,817
2 0,853 No identificado 27,993
3 1,001 No identificado 24,598
4 1,926 No identificado 364,576
5 2,009 No identificado 71,819
6 2,142 No identificado 93,904
7 2,311 No identificado 161,786
8 2,660 No identificado 278,357
9 2,776 No identificado 69,952
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10 2,857 No identificado 111,288

11 2,956 No identificado 78,523
12 3,032 No identificado 224,629
13 3,240 No identificado 97,526
14 3,383 No identificado 75,346
15 3,496 No identificado 74,695
16 3,582 No identificado 215,203
17 3,989 No identificado 100,790
18 4,108 No identificado 55,536
19 4,252 No identificado 74,387
20 4,383 No identificado 69,048
21 4,590 No identificado 82,499
22 4,835 No identificado 41,655
23 5,461 No identificado 159,082
24 5,663 No identificado 104,061
25 6,338 No identificado 73782,300
Celobiosa
26 7,190 21661,800 0,155 0,777
(inferior)
27 7,517 Celobiosa 25769,400 0,185 0,925
161205,00
28 8,145 Glucosa (inferior) 1,167 5,834
0
491080,00
29 8,869 Glucosa 3,548 17,739
0
747335,00
30 9,717 Xilosa 5,460 27,299
0
31 10,728 Arabinosa 22444,700 0,160 0,798
32 11,563 No identificado 3661,592
33 11,927 No identificado 8613,057
34 12,668 No identificado 2234,866
35 13,302 No identificado 5967,204
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36 14,044 No identificado 2805,293

37 15,356 No identificado 13143,000
38 16,502 No identificado 121,814
39 16,650 No identificado 104,111
40 16,974 No identificado 1149,688
41 17,968 No identificado 1232,628
42 18,899 No identificado 20833,000
43 20,020 No identificado 132,929
44 20,524 No identificado 749,813
45 20,617 No identificado 931,505
46 21,22 No identificado 107,311
47 21,344 No identificado 148,526
48 21,712 No identificado 409,333
49 21,899 No identificado 206,664
50 22,007 No identificado 120,652
51 22,172 No identificado 183,552
52 22,316 No identificado 175,880
53 23,0000 No identificado 4055,903
54 24,037 No identificado 1577,988

Respecto a la relación 2-8 se obtienen concentraciones más bajas, como es de esperarse porque
hay menor cantidad de analito, pues bien, si hay presencia de todos los azucares en evaluación. No
es posible de igual manera identificar los otros tiempos de retención generados por el detector
porque no se encuentran dentro de la curva, sin embargo, los que tienen “(inferior)” como se
explicó anteriormente es porque se encuentra un poco por debajo de la curva de ajuste, pero
igualmente se le realizo el análisis de concentración. Empleando nuevamente el factor de dilución
se encuentran concentraciones que según la lectura del RID, se obtienen tiempos de retención entre
0.576 min y 24,037 min, en él se destacan seis picos donde se encuentran los azucares evaluados,
encontrados desde el 26 hasta el 30. La concentración para la celobiosa es 0,777 y 0,925 ppm,
considerando la segunda medición correcta, glucosa 5,834 y 17,739 ppm, nuevamente se tienen en
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cuenta solamente la segunda concentración como aceptable, xilosa 27,299 ppm, y arabinosa 0.798
ppm. Se manejan los mismos porcentajes de confiabilidad y sensibilidad del equipo previamente
presentados, así como la relación lineal fuerte entre el área y la concentración.

Ya que la muestra empleada en ambos casos es la misma, solo difieren en la dilución que se le
realizó, la concentración inicial claramente es igual, por ello es necesario determinar la desviación
estándar, que permite visualizar que tan cercanos se encuentran los valores entre sí. Estos valores
se encuentran en la tabla 3 especificados para cada uno de los azucares, además del promedio de
concentración que se tendría del azúcar en la muestra problema.

Tabla 3 Relación entre las concentraciones de los azucares

Resultado Concentración 1 (4-6) Concentración 2 Promedio Desviación

Azúcar
(ppm) (2-8) (ppm) (ppm) estándar
1 Celobiosa
0,731 0,777 0,032
(inferior) 0,754
2 Celobiosa 0,883 0,925 0,904 0,030
3 Glucosa
5,512 5,834 0,227
(inferior) 5,673
4 Glucosa 16,890 17,739 17,314 0,600
5 Xilosa 25,800 27,299 26,549 1,060
6 Arabinosa 0,786 0,798< 0,792 0,009

La desviación estándar (σ) es una medida que permite visualizar la precisión, ya que indica que
tan cercanos se encuentran los valores entre sí, los cuales son relativamente pequeños teniendo
como excepción la xilosa, en el cual, si se obtiene una desviación estándar superior a 1, indicando
que se presenta un error en la curva de ajuste o en la determinación del azúcar. Se pensaría que es
la curva de calibrado, dado que los demás analitos se encuentran con σ inferior a 0.6 y son
diferentes curvas para cada uno, ya que el R2 en el caso de la xilosa es el más bajo correspondiente
a 0.9980, pero en realidad es que en el caso de la relación 4-6 la concentración de esta dilución se
encuentra fuera de las concentraciones evaluadas, y puede que el rango lineal no sea tan amplio,
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pues de la máxima concentración evaluada que es 6 ppm a la obtenida 10.320 ppm la diferencia es
grande.

6 Conclusiones
Mediante la cromatografía liquida de alto desempeño (HPLC) fue posible identificar los azucares
en estudio, glucosa, xilosa, celobiosa y arabinosa, en los residuos de procesos químicos del cacao,
mediante los tiempos de retención, con una sensibilidad alta, correspondiente a la pendiente de la
ecuación de la recta, elaborada con los estándares de cada analito.

La identificación fue posible de realizar, como se mencionó previamente al comparar los tiempos
de retención de los analitos en la muestra problema con los estándares de cada azúcar, además de
ser posible la evaluación de cuatro analitos en una sola muestra, sin necesidad de cambio, lo que
facilita la elaboración del análisis. Se recomienda poseer tiempo suficiente para realizar el
procedimiento, ya que el acondicionamiento del equipo y la posterior caracterización requiere de
bastante disponibilidad.

Fue posible cuantificar la cantidad de azucares teniendo como base la ecuación de la recta de cada
uno de los analitos, obteniendo resultados positivos, donde se encuentra en mayor cantidad la
xilosa, que confirman la capacidad del método y la técnica HPLC para análisis cuantitativos.
Además de que la resolución de los picos en el cromatograma es buena, ya que no se observa un
solapamiento o indicio de este entre picos. Las concentraciones de azúcares en los residuos de
procesos químicos del cacao obtenidas finalmente son: celobiosa 0.904 ppm, glucosa 17.314 ppm,
xilosa 26.549 ppm y arabinosa 0.792 ppm. Siendo la xilosa el azúcar con mayor concentración y
la arabinosa la de menor.

7 Bibliografía
Connors, K. A. (1981). Curso de análisis farmacéutico. Barcelona: Reverté.

Deska Pagana, K., & James Pagana, T. (2006). Guía de pruebas diagnósticas y de laboratorio
(Quinta ed.). Madrid, España: Elsevier.

Giannini, C., & Roani, R. (2003). Diccionario de restauración y diagnóstico . Aldamar: Nerea.

Malespín, M. (1982). El cacao. Nicaragua: Midinra.