IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE

BACILOS GRAM POSITIVOS

Bacteriología
 PROTOCOLO DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGÍA

ESQUEMA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAMPOSITIVOS OBJETIVOS:

1. Aislar e identificar bacterias bacilares grampositivas (BGP) desde suelo.

2. Conocer el fundamento de las pruebas empleadas en la identificación de BGP.
2. Desarrollar los protocolos para colorear y visualizar esporas.

MATERIAL REQUERIDO:

• Material consignado como obligatorio para todas las prácticas (mandil, papel toalla, ron,
alcohol, fósforos, marcador indeleble, libreta de apuntes).
• Suelo o tierra de jardín (200 gramos)
• Agar agar, SSFe
• Medios de cultivo: Agar nutritivo o agar base, Agar extracto de suelo, Caldo para carbohidratos
(glucosa, lactosa, maltosa, manitol, xilosa, otros)
• Tubos con Agar Citrato de Simmons, Caldo VP, Caldo para carbohidratos, Agar almidón.
• Asas de siembra, mecheros.
• Colorantes para coloración de esporas (verde de malaquita, safranina)
• Equipos: Incubadora a 37°C, Microscopio óptico.

PROTOCOLOS:
PROTOCOLO PARA OBTENER BACTERIAS DE SUELO

• Colectar muestras de suelo. Preparar una suspensión en 90 ml de SSFe.

• Preparar diluciones seriadas de suspensión de suelo.
• Sembrar las diluciones por incorporación en Agar nutritivo o Agar base.
• Incubar a 35-37°C en incubadora por 24-48 horas.
• Lecturas a las 24 y 48 horas buscando colonias grandes, cremosas, blancas y de borde
irregular.

PROTOCOLO PARA PREPARAR AGAR EXTRACTO DE SUELO (AES)

• Suspender 10 g de suelo en SSFe, agitar vigorosamente por 3 min, dejar reposar por 20 min y
volver a agitar. Repetir 3 veces.
• Filtrar en gasa el sobrenadante, colectar el sobrenadante.
• Preparar el AES, agregando 15 g de Agar por cada 100 ml de extracto de suelo obtenido.
• Esterilizar el medio en autoclave.
• Re-aislar los cultivos en AES.
• Incubar a 35-37°C por 24 horas. Lecturas a las 24 horas.
• Anotar los resultados.
 PROTOCOLO IDENTIFICAR BACILOS GRAMPOSITIVOS

• Inocular en los medios de prueba: Caldo VP, Agar citrato, Agar Almidón, Caldo para
Carbohidratos.
• Incubar por 18 a 24 horas a 37°C.
• Anotar los resultados.

PROTOCOLO DE COLORACIÓN DE ENDOSPORAS DE BGP

• Prepara extendidos en láminas portaobjetos de los cultivos puros.
• Realizar la coloración de esporas con verde de malaquita (revisar protocolo completo)

Resultados

OBTENER BACTERIAS DE SUELO

Se adjunta un ppt con los procedimientos

PREPARAR AGAR EXTRACTO DE SUELO (AES)

Se dividió en dos pasos

Extracto de suelo

 Se peso 10g de suelo en 200ml de suero fisiológico estéril

 Homogeniza por 20 minutos con el fin de desprender los microorganismos del suelo
 Se coloca a incubar por 24h

Fig1. Homogeniza el extracto

 Fig2. Se coloca a incubar por 24h

Agar extracto de suelo

 Si coloca en un matraz estéril 200ml del extracto de suelo

 Se le añade 3g de agar (se repitió el proceso por malos cálculos)
 Se Sirve en placas
 Coloca a incubar por 24h

Fig3. Agar extracto de suelo listo para servir

IDENTIFICAR BACILOS GRAMPOSITIVOS

Se realizo lo siguiente:

Identifico las mejores colonias

Fig4. Identifico las mejores colonias

Se identifico las siguientes colonias, a las cuales se les realizo una tinción Gram arrojando un
resultado de bacilos Gram negativos en el 100% de casos

Colonia 3c
Colonia 4a
Colonia 4b
Colonia 4c
Colonia 5a
Colonia 5b
Colonia 5c
Colonia 5d
Colonia 5e
Fig5. Colonia 3c

Fig6. Colonia 4ª
Fig7. Colonia 4b

Fig.8 Colonia 4c
Fig9. Colonia 5a

Fig10. Colonia 5b
Fig11. Colonia 5c

Fig12. Colonia 5d
 Fig13. Colonia 5e

Pruebas

Colonias Catalasa

Colonia 3c Positivo

Colonia 4a Positivo

Colonia 4b Positivo

Colonia 4c Negativo

Colonia 5a Negativo

Colonia 5b Positivo

Colonia 5c Positivo

Colonia 5d Positivo

Colonia 5e Negativo

Cuadro1. Prueba de catalasa

Fig14. Prueba de catalasa 3c-4a

Fig15. Prueba de catalasa 4b-4c

 Fig16. Prueba de catalaza 5e

Colonias Oxidasa

Colonia 3c Negativo

Colonia 4a Negativo

Colonia 4b Positivo

Colonia 4c Positivo

Colonia 5a Negativo

Colonia 5b Negativo

Colonia 5c Negativo

Colonia 5d Negativo

Colonia 5e Negativo

Cuadro2. Prueba de oxidasa

Fig17. Prueba de oxidasa 3c

Fig17. Prueba de oxidasa 4ª

Colonias Citrato

Colonia 3c Positivo

Colonia 4a Negativo

Colonia 4b Positivo

Colonia 4c Negativo

Colonia 5a Negativo

Colonia 5b Negativo

Colonia 5c Negativo

Colonia 5d Negativo

Colonia 5e Negativo

Cuadro3. Prueba de citrato

Fig18 Prueba de citrato

Colonias VP

Colonia 3c Positivo

Colonia 4a Positivo

Colonia 4b Negativo

Colonia 4c Negativo

Colonia 5a Negativo

Colonia 5b Negativo

Colonia 5c Negativo

Colonia 5d Positivo

Colonia 5e Negativo

Cuadro4.Resultado de la prueba de VP

Fig19. Resultado de la prueba de VP

 Fig20. Resultado Positivo de VP

Colonias Caldo MR_VP

Colonia 3c Negativo

Colonia 4a Positivo

Colonia 4b Positivo

Colonia 4c Negativo

Colonia 5a Negativo

Colonia 5b Negativo

Colonia 5c Positivo

Colonia 5d Positivo

Colonia 5e Negativo

Cuadro5. Resultado de prueba caldo MR_VP

 Fig21. Resultado de prueba caldo MR_VP

Fundamentos de las pruebas utilizadas

Catalasa

La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del
oxígeno indica que la prueba es positiva. (pomif, 2018)

Oxidasa

Determina la presencia del citocromo C, El citocromo C oxida al NNN'N',tetrametil,1-

4,fenilendiamina (solución acuosa al 1% (p/v). La oxidación se detecta como color azul.
(pomif, 2018)

Citrato

Esta prueba nos permite diferenciar un grupo de bacterias que son capaces de crecer con
citrato como única fuente de carbono y sales amónicas inorgánicas como única fuente de
nitrógeno, provocando la alcalinización del medio.
El medio a utilizar es agar Citrato de Simons, que contiene citrato de sodio, fosfato de amonio
y azul de bromotimol como indicador de pH.
Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y
liberarán iones amonio lo que, junto con el metabolismo del citrato, generará una fuerte
basificación del medio que será aparente por un cambio de color del mismo de verde a azul
(goumh, 2015)
 VP

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la

glucosa con producción de ácido por la vía ácido mixta o con producción de un producto final
neutro (acetoína) por la vía butanodiólica.

La prueba rojo de metilo y Vogues-Proskauer son dos pruebas en una. Las bacterias que
siguen principalmente la vía de fermentación ácidos mixtos a menudo producen suficiente
ácido para mantener un ph menor de 4.4. (blogspo, 2011)

Caldo MR_VP

Es particularmente útil para la clasificación de entero bacterias. Fundamento En el medio de

cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la
glucosa es el hidrato de carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada por los
microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán
productos finales ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales
neutros (acetil metil carbinol). Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser
reconocida por la adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de
productos ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la
presencia de productos finales neutros. Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza
que aparecía después de adicionar hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos
microorganismos en medio con glucosa. Esta coloración se debe a la oxidación del acetilmetil
carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.
Contenido y composición Código B0213905: envase x 100 g. Código B0213906: envase x 500
g. FÓRMULA (en gramos por litro) (slideshar, 2018)

1. Bibliografía
blogspo. (2011). microcereus. Obtenido de http://microcereus.blogspot.com/
goumh. (2015). microbiologia. Obtenido de
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-
microbiologia/indice/identificacion-bacteriana/utilizacion-del-citrato
pomif. (2018). catalasa_oxidasa. Obtenido de http://www.ugr.es/~pomif/pom-
bac/pb-v/pb-v-3-catalasa_oxidasa.htm
slideshar. (2018). caldo mr_vp. Obtenido de
https://es.slideshare.net/YEIBRAY/caldo-mr