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Universidad
de
Chile
Facultad
de
Ciencias
Químicas
y
Farmacéuticas
Bioquímica
I
Trabajo
Práctico
N°
2
Cuantificación
de
la
concentración
de
proteínas
Objetivos:
-‐
Determinar
la
concentración
de
proteínas
en
muestras
problema
utilizando
los
métodos
de
Bradford
(Bradford
y
cols,
1976)
y
Biuret
(Riegler
y
cols,
1914).
-‐
Discutir
las
ventajas
y
desventajas
de
cada
método.
-‐
Aplicar
los
conceptos
y
metodologías
relacionados
con
la
elaboración
de
soluciones
y
realización
de
curvas
de
calibración.
Antecedentes:
Existen
diversos
métodos
para
la
cuantificación
de
proteínas,
siendo
los
basados
en
técnicas
espectrofotométricas
lo
más
conocidos.
Estos
métodos
se
basan
en
la
formación
de
complejos
contienen
las
proteínas,
la
capacidad
de
estos
de
absorber
luz
en
alguna
longitud
de
onda,
y
la
relación
lineal
entre
la
absorbancia
y
la
concentración
del
complejo
formado.
La
capacidad
intrínseca
de
las
proteínas
de
absorber
luz,
también
permite
su
cuantificación
bajo
los
mismos
principios
descritos.
Entre
los
métodos
espectrofotométricos
podemos
mencionar,
-‐
Métodos
basados
en
la
formación
de
complejos
con
colorantes,
-‐
Método
de
Bradford
-‐
Métodos
basados
en
la
formación
de
complejos
de
cobre,
-‐
Reacción
del
Biuret
-‐
Método
del
Ácido
Bicinconínico
-‐
Método
de
Lowry
-‐
Métodos
basados
en
la
absorbancia
natural
de
los
aminoácidos
con
cadenas
aromáticas:
-‐
Medición
de
la
absorbancia
a
280
nm
en
muestras
puras
de
proteínas
-‐
Método
de
Warburg-‐Christian
Al
usar
cualquier
método
espectrofotométrico
es
indispensable
conocer
su
sensibilidad,
intervalo
de
concentración
de
respuesta
lineal
y
el
coeficiente
de
extinción
o
factor
de
calibración.
Como
se
determinó
en
el
trabajo
práctico
anterior,
esta
información
se
obtiene
mediante
una
curva
de
calibración.
En
general,
no
existe
un
método
completamente
satisfactorio
para
medir
la
concentración
de
proteínas
de
una
muestra.
La
elección
de
un
método
dependerá
de;
-‐
La
naturaleza
de
la
muestra
(pura
o
mezcla
de
proteínas),
-‐
La
presencia
de
compuestos
interferentes,
-‐
La
rapidez
y
sensibilidad
requerida,
-‐
Factores
como
la
complejidad
del
ensayo
y
los
costos,
1.
Cuantificación
de
proteínas
por
métodos
colorimétricos
basados
en
su
unión
a
colorantes:
1.1.
Método
de
Bradford
(Bradford
y
cols,
1976):
Figura
1
Estructura
química
del
Azul
de
Coomassie
G-‐250
El
reactivo
de
Bradford
contiene
un
compuesto
denominado
azul
de
Coomassie
G-‐250,
el
cual
se
encuentra
disuelto
en
ácido
fosfórico,
H3PO4.
En
este
ambiente
ácido,
el
colorante
azul
de
Coomassie
presenta
un
color
café
rojizo,
con
un
máximo
de
absorbancia
a
los
465
nm.
Este
compuesto
puede
formar
complejos
con
proteínas,
lo
que
determina
un
cambio
de
color,
al
azul,
y
un
cambio
del
máximo
de
absorbancia
a
los
595
nm.
La
formación
de
complejos
entre
azul
de
Coomassie
y
proteínas
se
debe
al
establecimiento
de
interacciones
no
covalentes,
particularmente
a
través
de
residuos
de
aminoácidos
básicos
(especialmente
arginina,
histidina
y
lisina)
y
aromáticos.
Debido
a
que
la
cantidad
de
proteínas
determina
la
cantidad
de
complejo
formado
con
azul
de
Coomassie,
la
medición
de
absorbancia
a
595
nm
permite
evaluar
la
concentración
de
proteínas.
Este
método
permite
la
determinación
de
proteínas
en
un
intervalo
de
concentraciones
de
1
a
10
µg/ml.
Figura
2
MÉTODO
DE
BRADFORD
A.
Formación
del
complejo
entre
el
colorante
Azul
de
Coomassie
y
las
proteínas,
B.
Espectro
de
absorción
del
colorante
Azul
de
Coomassie
en
presencia
(máximo
de
absorbancia
a
los
595
nm)
y
ausencia
de
proteínas
(máximo
de
absorbancia
a
los
465
nm)
A
B
Desventajas:
-‐
Debido
a
que
la
formación
del
complejo
proteína-‐Coomassie
está
determinada
por
la
presencia
de
aminoácidos
particulares,
la
cantidad
de
estos
puede
influenciar
la
determinación.
-‐
Incompatible
con
detergentes
en
concentraciones
que
se
utilizan
normalmente
en
el
laboratorio.
-‐
Algunas
sustancias
particulares,
incompatibles
con
este
método,
son;
Buffer
Systems
Buffer
Additives
ACES,
pH
7.8
100
mM
Ammonium
sulfate
1.0
M
N-‐Acetylglucosamine
in
PBS,
pH
7.2,
100
mM
Aprotinin
10
mg/L
Bicine,
pH
8.4
100
mM
Asparagine
10
mM
Bis-‐Tris,
pH
6.5
100
mM
Cesium
bicarbonate
0.1
M
Calcium
chloride
in
TBS,
pH
7.2
10
mM
Glucose
1.0
M
CelLytic
B
Reagent
undiluted,
no
interference
Glycerol
10%
CHES,
pH
9.0
100
mM
Guanidine•HCl
3.5
M
Cobalt
chloride
in
TBS,
pH
7.2
10
mM
Hydrochloric
Acid
0.1
M
EPPS,
pH
8.0
100
mM
Imidazole,
pH
7.0
200
mM
Ferric
chloride
in
TBS,
pH
7.2
10
mM
Leupeptin
10
mg/L
Glycine
100
mM
Phenol
Red
0.5
mg/ml
HEPES,
pH
7.5
100
mM
PMSF
1
mM
Imidazole,
pH
7.0
200
mM
Sodium
azide
0.5%
MES
(0.1
M),
NaCl
(0.9%),
pH
4.7
undiluted
Sodium
chloride
5.0
M
MES,
pH
6.1
100
mM
MOPS,
pH
7.2
100
mM
Sodium
Hydroxide
0.1
M
Nickel
chloride
in
TBS,
pH
7.2
10
mM
PBS;
Phosphate
(0.1
M),
NaCl
(0.15
M),
pH
7.2,
undiluted
PIPES,
pH
6.8
100
mM
Sodium
acetate,
pH
4.8
180
mM
Sodium
bicarbonate
0.1
M
Sodium
citrate,
pH
4.8
or
pH
6.4
200
mM
Sodium
Citrate
(0.6
M),
MOPS
(0.1
M),
pH
7.5,
undiluted
Sodium
phosphate
0.1
M
TBS;
Tris
(25
mM),
NaCl
(0.15
M),
pH
7.6,
undiluted
Tricine,
pH
8.0
100
mM
Triethanolamine,
pH
7.8
100
mM
Tris
2.0
M
Tris
(25
mM),
Glycine
(192
mM),
pH
8.0,
undiluted
Tris
(25
mM),
Glycine
(192
mM),
SDS
(0.1%),
pH
8.3,
1:2
dilution
Zinc
chloride
in
TBS,
pH
7.2
10
mM
2.
Cuantificación
de
proteínas
por
métodos
colorimétricos
basados
en
la
formación
de
complejos
de
cobre:
2.1.
Método
de
Biuret
(Riegler
y
cols,
1914):
El
reactivo
de
Biuret
está
constituido
de
una
mezcla
de,
KOH,
Cu+2
y
tartrato
de
sodio
((2R,3R)-‐2,3-‐
dihydroxybutanedioate,
que
permite
estabilizar
los
iones
Cu+2
en
solución).
Los
iones
Cu+2
del
reactivo
pueden
formar
complejos
con
péptidos
(de
3
o
más
aminoácidos),
a
través
de
su
interacción
con
los
nitrógenos
del
enlace
amida.
El
complejo
de
cobre
formado
presenta
un
color
azul,
con
absorbancia
a
540
nm.
En
condiciones
alcalinas,
posteriormente,
se
produce
la
reducción
de
Cu+2
a
Cu+1.
Debido
a
que
la
formación
de
complejos
de
cobre
depende
de
la
cantidad
de
enlaces
peptídicos
(los
cuales
están
determinados
por
la
cantidad
de
proteínas),
la
evaluación
de
la
absorbancia
a
540
nm
permite
calcular
la
concentración
de
proteínas.
Figura
3
MÉTODO
DE
BIURET
+2
Formación
del
complejo
proteína-‐Cu ,
el
cual
presenta
un
máximo
de
absorbancia
a
los
540
nm
OH-‐
PROTEÍNAS
+
Cu+2
Cu+2
Cu+1
AZUL
A
max
=
540
nm
El
nombre
de
este
método,
Biuret,
tiene
su
origen
en
la
siguiente
reacción;
Figura
4
REACCIÓN
DE
BIURET
Corresponde
a
la
condensación
de
dos
moléculas
de
urea
formando
un
compuesto
denominado
Biuret,
la
molécula
más
simple
capaz
de
formar
un
2
complejo
con
Cu
En
esta
reacción,
el
denominado
compuesto
Biuret
(que
corresponde
a
la
condensación
de
2
moléculas
de
urea),
se
compleja
con
Cu+2
en
un
medio
alcalino.
La
molécula
Biuret,
es
la
forma
química
más
pequeña
capaz
de
formar
un
complejo
con
Cu+2.
Ventajas:
-‐
Es
un
método
rápido
y
fácil
de
realizar.
-‐
Presenta
pocas
interferencias.
-‐
La
determinación
no
se
ve
influenciada
por
la
composición
aminoacídica
de
la
proteína.
-‐
El
complejo
es
estable
durante
1
hora.
Desventajas:
-‐
Baja
sensibilidad
(requiere
altas
concentraciones
de
proteínas).
El
intervalo
útil
es
desde
0,5
a
10
mg/ml
de
proteína.
*
La
formación
de
este
complejo
de
Cu+2
y
su
posterior
reducción
a
un
ion
cuproso,
Cu+,
son
la
base
para
el
desarrollo
de
métodos
de
mayor
sensibilidad
como
el
método
de
Lowry
(Lowry
y
cols,
1951)
y
el
método
del
ácido
bicinconínico
(Smith
y
cols,
1985).
2.2.
Método
del
Ácido
Bicinconínico
BCA
(Smith
y
cols,
1985):
Este
método
se
fundamenta
en
la
determinación
de
absorbancia
a
562
nm,
longitud
de
onda
a
la
cual
absorbe
el
compuesto
formado
en
este
ensayo,
que
corresponde
a
un
complejo
de
BCA
con
iones
Cu+1.
La
formación
de
este
complejo
se
produce
en
2
etapas;
Primera
etapa:
corresponde
a
una
reacción
de
Biuret
típica,
en
la
cual
péptidos
que
contengan
3
o
más
residuos
aminoacídicos
actúan
como
quelantes
de
iones
Cu+2,
el
cual
en
condiciones
alcalinas
es
reducido
a
Cu+,
generándose
un
complejo
de
color
azul
que
absorbe
a
540
nm.
Segunda
etapa:
Los
iones
Cu+1,
generados
en
la
primera
etapa,
forman
un
complejo
con
2
moléculas
de
BCA,
el
cual
presenta
un
color
violeta
con
absorbancia
en
los
562
nm.
Figura
5
MÉTODO
DEL
Á CIDO
BICINCONÍNICO,
BCA
+2
+1
Implica
la
reducción
del
Cu a
Cu ,
y
la
posterior
formación
de
un
complejo
con
BCA,
el
cual
presenta
un
máximo
de
absorbancia
a
los
562
nm
Cu+1 + 2
BCA
Complejo
BCA
–
Cu+1
VIOLETA
A
max
=
562
nm
Por
lo
tanto,
debido
a
que
el
número
de
enlaces
peptídicos
determina
la
cantidad
de
Cu+1
producido,
la
determinación
de
absorbancia
a
562
nm,
dada
por
el
complejo
BCA-‐Cu+1,
permite
estimar
la
concentración
de
proteínas.
Ventajas:
-‐
Compatible
con
surfactantes
y
denaturantes
(es
el
método
que
presenta
menos
interferencias).
-‐
Muy
sensible.
-‐
La
determinación
presenta
escasa
variación
entre
proteínas
(similar
al
método
de
Lowry
y
menor
a
los
métodos
basados
en
Azul
de
Coomassie).
-‐
Fácil
y
rápido
de
realizar.
Desventajas:
-‐
Incompatible
con
agentes
reductores
y
sustancias
que
puedan
quelar
Cu.
¿Por
qué?
-‐
Aminoácidos
libres
reductores
(triptófano,
tirosina
y
cisteína)
pueden
afectar
la
determinación.
-‐
La
determinación
es
dependiente
de
la
composición
aminoácidica
de
la
proteína,
siendo
influenciada
por
el
contenido
de
residuos
de
triptófano,
tirosina
y
cisteína.
2.3.
Método
de
Lowry
(Lowry
y
cols,
1951):
Este
método
se
basa
en
la
detección
de
la
forma
reducida
del
reactivo
de
Folin-‐Ciocalteu,
la
cual
presenta
un
color
azul
intenso
que
absorbe
a
los
750
nm.
Reactivo
de
Folin-‐Ciocalteu:
Na2MoO4
+
Na2WoO4
+
H3PO4.
La
formación
del
compuesto
coloreado
requiere
de
2
etapas.
Primera
etapa:
corresponde
a
una
reacción
de
Biuret
típica
(la
cual
también
está
presente
el
método
del
BCA).
Recordemos
que
en
esta
etapa
se
produce
Cu+.
Segunda
etapa:
se
incorpora
el
reactivo
de
Folin-‐Ciocalteu,
el
cual
es
reducido
por
el
Cu+
(esto
también
puede
ser
influenciado
por
residuos
de
aminoácidos
reductores.
La
forma
reducida
del
reactivo
es
azul
intenso,
y
absorbe
a
los
750
nm.
Debido
a
que
el
número
de
enlaces
peptídicos
determina
la
cantidad
de
Cu+1
producido,
la
magnitud
de
la
forma
reducida
del
reactivo
de
Folin-‐Ciocalteu
es
proporcional
a
la
cantidad
de
proteínas.
Figura
6
MÉTODO
DE
LOWRY
+1
Implica
la
reducción
del
reactivo
de
Folin-‐Ciocalteu
acoplada
a
la
oxidación
del
Cu .
L a
forma
reducida
del
reactivo
presenta
un
máximo
de
absorbancia
a
los
750
nm
-‐
OH
+1
Cu
-‐ PROTEÍNAS
Cu+2
-‐
PROTEÍNAS
Ventajas:
-‐
Buena
sensibilidad
y
precisión.
Desventajas:
-‐
Incompatible
con
agentes
reductores,
sustancias
que
puedan
quelar
el
Cu
y
detergentes.
-‐
Aminoácidos
libres
reductores
pueden
influenciar
la
determinación.
-‐
La
determinación
es
dependiente
de
la
composición
aminoácidica
de
la
proteína,
siendo
influenciada
por
el
contenido
de
residuos
de
triptófano,
tirosina
y
cisteína.
-‐
Requiere
mayor
tiempo.
-‐
Algunos
interferentes
específicos
son;
urea,
guanidina·∙HCl,
sacarosa,
sulfato
de
amonio,
Tris·∙HCl
>
0.1M,
acetato
de
sodio
>1M
o
fosfato
de
sodio,
EDTA.
3.
Cuantificación
de
proteínas
por
métodos
basados
en
su
absorbancia
natural:
3.1.
Cuantificación
de
proteínas
por
medición
de
absorbancia
a
280
nm:
Las
proteínas
presentan
un
máximo
de
absorbancia
a
los
280
nm
como
consecuencia
de
la
presencia
de
los
aminoácidos
aromáticos
triptófano
y
tirosina
(también
contribuyen,
aunque
en
menor
grado,
fenilalanina
y
los
puentes
disulfuro).
Por
lo
tanto,
es
posible
cuantificar
proteínas
a
través
de
la
medición
directa
de
la
absorbancia
a
280
nm,
esto
es,
sin
un
tratamiento
previo,
aunque
como
en
todas
las
metodologías
se
requiere
la
realización
de
una
curva
de
calibración.
Ventajas:
-‐
Fácil
y
rápido
de
realizar.
-‐
Es
un
método
de
determinación
directa,
ya
que
no
involucra
una
reacción.
-‐
Bajo
costo.
-‐
Requiere
pequeñas
cantidades
de
muestra.
-‐
La
muestra
puede
ser
recuperada.
Desventajas:
-‐
Debe
utilizarse
en
muestras
puras
de
proteínas
que
no
presenten
contenido
de
ácidos
nucleicos,
ya
que
estos
últimos
presentan
un
máximo
de
absorbancia
a
260
nm
(cercano
a
los
280
nm
a
los
cuales
se
ubica
en
máximo
de
absorbancia
de
las
proteínas),
lo
cual
puede
afectar
la
determinación.
-‐
Elevada
variabilidad.
Debido
a
que
la
absorbancia
a
280
nm
depende
del
contenido
de
tirosina
y
triptófano,
existe
diferencia
en
la
absorbancia
a
280
nm
entre
diferentes
proteínas.
-‐
Incompatible
con
detergentes
y
agentes
denaturantes.
3.2.
Cuantificación
de
proteínas
por
medición
de
absorbancia
a
280
y
260
nm,
Método
de
Warburg-‐Christian
(Warburg
y
Christian,
1941):
Este
ensayo
se
realiza
en
las
mismas
condiciones
que
el
anterior,
y
tiene
como
objetivo
establecer
la
concentración
de
proteínas
excluyendo
la
interferencia
de
los
ácidos
nucleicos.
Consiste
en
medir
la
absorbancia
a
260
y
280
nm,
longitudes
de
onda
a
las
cuales
presentan
un
máximo
de
absorbancia
ácidos
nucleicos
y
proteínas
respectivamente.
El
cociente
de
estas
absorbancias
permite
establecer
el
porcentaje
de
ácidos
nucleicos
en
la
muestra,
y
un
factor
de
corrección
que
posibilita
determinar
la
concentración
de
proteínas
excluyendo
la
interferencia
de
los
ácidos
nucleicos.
Conociendo
el
factor
de
corrección
previamente
mencionado,
se
puede
determinar
la
concentración
de
proteínas
de
la
siguiente
manera;
𝒎𝒈
𝑷𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂 = 𝑨𝟐𝟖𝟎 ×𝑭𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒓𝒓𝒆𝒄𝒄𝒊ó𝒏
𝒎𝒍
A
continuación
se
muestra
el
porcentaje
de
ácidos
nucleicos
y
factor
de
corrección
en
función
de
la
relación
A280/A260;
Razón
%
Ácidos
Factor
de
corrección
para
una
Razón
%
Ácidos
Factor
de
corrección
para
una
A280/A260
Nucleicos
celda
de
1
cm
A280/A260
Nucleicos
celda
de
1
cm
1.75
0
1.105
0.84
5.50
0.69
1.60
0.25
1.075
0.82
6.00
0.67
1.50
0.50
1.05
0.80
6.50
0.645
1.40
0.75
1.025
0.78
7.25
0.615
1.30
1.00
0.995
0.76
8.00
0.59
1.25
1.25
0.975
0.74
8.75
0.565
1.20
1.50
0.95
0.72
9.50
0.54
1.15
2.00
0.91
0.70
10.75
0.51
1.10
2.50
0.87
0.68
12.00
0.48
1.05
3.00
0.835
0.66
13.50
0.45
1.00
3.50
0.80
0.65
14.50
0.43
0.96
3.75
0.785
0.64
15.25
0.415
0.92
4.25
0.755
0.62
17.5
0.38
0.88
5.00
0.715
0.60
20.00
0.35
0.86
5.25
0.705
0.49
100.0
3.3.
Otras
metodologías
de
cuantificación
basadas
en
la
absorbancia
natural
de
las
proteínas:
También
es
posible
cuantificar
proteínas
a
través
de
la
determinación
de
absorbancia
a
entre
220
y
240
nm,
donde
presentan
un
máximo
de
absorbancia
los
enlaces
peptídicos
y
los
grupos
carboxílicos.
Sin
embargo,
esto
es
útil
solo
para
muestras
puras
de
proteínas,
ya
que
muchas
sustancias
presentan
absorbancia
en
este
intervalo
de
longitud
de
onda.
Actividad
N°
1,
Determinación
de
la
concentración
de
proteínas
en
muestra
problema
mediante
el
método
de
Bradford
a)
Reactivos:
Reactivo
de
Bradford,
solución
patrón
de
BSA,
muestra
problema.
b)
Procedimiento:
1.
Preparación
de
las
soluciones
patrón:
El
método
mide
adecuadamente
concentraciones
de
proteína
entre
1
y
10
µg/ml.
En
consecuencia,
genere
una
tabla
para
preparar
5
soluciones
dentro
de
ese
intervalo
de
concentraciones.
Considere
que
cada
solución
de
proteína
debe
contener
200
µl
del
reactivo
Bradford
y
el
volumen
de
la
alícuota
de
la
solución
patrón.
El
volumen
final
de
cada
solución
debe
ser
de
1
ml.
Utilice
la
siguiente
tabla
como
referencia
para
realizar
la
curva
de
calibración.
2.
Medición
de
absorbancia
de
las
soluciones
patrón.
Una
vez
preparadas
las
soluciones
patón
proceda
a
medir
la
absorbancia
a
595
nm.
Consideraciones:
-‐
Recuerde
realizar
el
blanco
correspondiente.
-‐
El
reactivo
de
Bradford
debe
ser
el
último
componente
en
ser
agregado,
¿Por
qué?
-‐
El
reactivo
de
Bradford
es
bastante
viscoso
por
lo
que
es
imprescindible
agitar
vigorosamente
las
soluciones
una
vez
agregado
el
reactivo.
-‐
Mezcle
bien,
espere
5
min
antes
de
realizar
la
medición
de
absorbancia.
-‐
Para
obtener
el
error
del
método
realice
las
mediciones
en
triplicado.
Registre
sus
datos
en
la
siguiente
tabla.
3.
Medición
de
la
absorbancia
de
las
muestras
problema.
Prepare
las
muestras
problema
según
lo
que
se
indica
en
la
siguiente
tabla
y
realice
la
medición
de
absorbancia
como
lo
hizo
anteriormente.
Mida
la
absorbancia
de
la
muestra
problema
más
de
una
vez,
con
ello
podrá
obtener
la
concentración
de
la
muestra
con
el
error
de
la
determinación.
Actividad
N°
2,
Determinación
de
la
concentración
de
proteínas
en
muestras
problema
mediante
el
método
de
Biuret
a)
Reactivos:
Reactivo
de
Biuret,
solución
patrón
de
BSA,
muestra
problema.
b)
Procedimiento:
1.
Preparación
de
las
soluciones
patrón:
Siguiendo
la
misma
lógica
que
en
caso
del
método
de
Bradford,
prepare
5
soluciones
entre
0,5
a
5
mg/ml
de
proteína.
Considere
que
debe
agregar
500
µL
de
reactivo
de
Biuret
a
cada
solución,
y
obtener
un
volumen
final
de
1ml.
Utilice
la
siguiente
tabla
como
referencia
para
realizar
la
curva
de
calibración.
2.
Medición
de
absorbancia
de
las
soluciones
patrón:
Agregue
finalmente
el
reactivo
de
Biuret,
mezclar
y
luego
de
20
minutos
medir
la
absorbancia
a
540
nm.
Para
obtener
el
error
del
método
realice
las
mediciones
en
triplicado.
Recuerde
realizar
el
blanco
correspondiente.
Registre
sus
mediciones
en
la
siguiente
Tabla.
3.
Medición
de
la
absorbancia
de
las
muestras
problema.
Prepare
las
muestras
problema
según
lo
que
se
indica
en
la
siguiente
tabla
y
realice
la
medición
de
absorbancia
como
lo
hizo
anteriormente.
Realice
3
veces
la
medición
de
la
muestra
para
obtener
el
error
de
la
determinación.
Preguntas:
-‐
¿Qué
información
se
debe
conocer
antes
de
medir
la
concentración
de
proteínas
de
una
muestra?
-‐
¿Por
qué
cree
Ud.
que
es
conveniente
determinar
la
concentración
de
proteínas
utilizando
más
de
un
método?
-‐
Tratamiento
estadístico.
¿Cómo
expresará
el
error
en
las
mediciones?,
¿Cómo
determinará
el
número
de
cifras
significativas
y
el
error
asociado
al
reportar
la
concentración
de
la
muestra
problema?
-‐
Observe
la
ecuación
que
define
la
ley
de
Lamber
y
Beer
y
explique
por
qué
algunos
métodos
para
medir
proteínas
son
más
sensibles
que
otros?
Referencias:
-‐
Aitken,
A.,
Learmonth,
M.
(1996).
P rotein
D etermination
b y
U V
A bsorption.
The
Protein
Protocols
Handbook.
3-‐6.
-‐
Bradford,
M.
M.
(1976).
A
rapid
and
sensitive
method
for
the
quantitation
of
microgram
quantities
of
protein
utilizing
the
principle
of
protein-‐dye
binding.
Analytical
biochemistry
72,
248-‐254.
-‐
Lowry,
O.
H.,
Rosebrough,
N.
J.,
Farr,
A.
L.,
and
Randall,
R.
J.
(1951).
Protein
measurement
with
the
Folin
phenol
reagent.
The
Journal
of
Biological
Chemistry
193,
265-‐275.
-‐
Riegler,
E.,
A
(1914).
Colorimetric
Method
for
the
Determination
of
Plasma
Albumin,
Z.
Analytical
biochemistry
53,
242.
-‐
Smith,
P.
K.,
Krohn,
R.
I.,
Hermanson,
G.
T.,
Mallia,
A.
K.,
Gartner,
F.
H.,
Provenzano,
M.
D.,
Fujimoto,
E.
K.,
Goeke,
N.
M.,
Olson,
B.
J.,
and
Klenk,
D.
C.
(1985).
Measurement
of
protein
using
bicinchoninic
acid.
Analytical
biochemistry
150,
76-‐
85.
Anexo.
-‐
Thermo
Scientific
Pierce
Protein
Assay
Technical
Handbook.
Versión
2.
15-‐30.
-‐
Warburg,
O.
and
Christian,
W
(1941).
Biochemistry.
Z.
310,
384-‐421.
Trabajo
Práctico
N°
2
Cuantificación
de
la
concentración
de
proteínas