PASITO 5

1. SEGÚN LA COLUMNA DE WINOGRADSKY, QUE

ELEMENTOS SE COLOCARON, CON QUE
PROPOSITO.
2. COMO OBSERVAN LOS TUBOS (+ Y -) DE LAS
BIOQUIMICAS DE:
• UREASA
• CITOCROMO OXIDASA
• VP
• ROJO DE METILO
• CATALASA
Complete el siguiente cuadro
acerca de NMP:
Ej 10mL 1mL 0.1mL 0.01 mL 0.001mL TRIADA IndexNMP
/100mL

A 5 5 1 0 0

B 4 5 1 0 0

C 5 2 5 2 1

D 4 5 4 5 1

E 5 4 4 0 1

F 4 3 0 1 1
BIOQUÍMICA
DIFERENCIAL
HENRY PAICO M.
CARRERA: INGENIERIA AMBIENTAL
CICLO : 2018 - II
BIOQUIMICAS
• La identificación primaria de las bacterias consiste en la determinación de su
morfología microscópica (GRAM y forma) y la morfología macroscópica o colonial.
• Conjunto de pruebas que ponen de manifiestos las características bioquímicas de
las bacterias permitiendo identificar géneros y especies.
• La selección de las pruebas bioquímicas a utilizar dependerá del tipo de bacterias
aislada.

• GRAM positivos : 3 algunas cepas de estafilococos.

• GRAM negativos MAS pruebas para identificar una
enterobacteria al nivel de especie.
PRUEBAS CON
LECTURA INMEDIATA
1. Prueba de la catalasa
2. Prueba de la coagulasa
3. Prueba de PYR
4. Prueba de oxidasa
 Catalasa y peroxidasa

*Son consideradas
*El H2O2 (peróxido de hidrogeno) si
toxico para las bacterias y produce
La catalasa puede descomponer el
hidrogeno u oxidar sustratos
tiene acción contra otros peróxidos.
*El centro activo de la catalasa son un
tipo de proteínas hemo denominadas
citocromos.

La descomposición del H2O2 solo puede darse

por la presencia de dos enzimas la catalasa y la
peroxidasa.
La catalasa puede funcionar de dos modos distintos: En el catabolismo del
peróxido de oxigeno o en la oxidación peroxidativa de pequeños sustratos
como el alcohol etilico, el alcohol metilico, o el mercurio elemental.

Para la descomposición
catalítica esta involucrada la
reducción del Fe+3  Fe2+,
y la re-oxidación a O2.
1)La prueba de la catalasa para diferenciar principalmente entre los
géneros:

* Streptococcus (-) los Micrococcus (+) /Staphylococcus (V+)

*Bacillus (+) Clostridium (V-)
* Listeria monocytogenes (+), especies de Kurthia (+), Corynebacterium (+) Microorganismos que pueden
ser similares desde el punto de vista morfológico : Lactobacillus sp (V-), Enterococcus sp (V-) y Streptococcus
del grupo B (-).

2)La diferenciación de especies:

• Gram Positivos:
Aerococcus urinae (+)  Aerococcus viridans (-)

*Gram Negativos:
Moraxella bovis (variable) y especies de Kingella (-)  otras especies de Moraxella (+)
 PRUEBA DE LA COAGULASA
Fundamento: Detecta un factor de agregación “clumping factor”
en la superficie de la bacteriana.
Procedimiento: se coloca una colonia sospechosa de pertenecer a
una especie de Staphylococcus y se emulsifica en una gota de
plasma de conejo.
Interpretación: “arracimamiento” bacteriano en 1 minuto =
prueba (+).Si el resultado es negativo ensayar la producción de
coagulasa en tubo.

Consideraciones:
Utilizar plasma con EDTA y no citratado, ya que organismos capaces
de metabolizar el citrato (Enterococcus spp.) pueden dar resultados
falsos (+).
Las pruebas (-) luego de 4 hs de incubación a 35ºC, dejar a
temperatura ambiente y leer luego de 18-24 hs a fin de evitar la
fibrinólisis que producen algunas cepas al ser incubadas en forma
prolongada a 35ºC.
Coagulasa: Coágulos formados por la reacción de la coagulasa
en un tubo de ensayo. Estudia la producción del
enzima coagulasa, capaz de coagular el plasma.
Diferencia Staphylococcus aureus de otras especies.
 Prueba del PYR:
• Fundamento: Se utiliza como sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-
naftilamida (PYR), para la identificación rápida de enterococos. Se detecta
la enzima PIRROLIDONIL ARILAMIDASA.
• Procedimiento: Realizar un alto inóculo (2 MacFarland) e introducir un disco de PYR.
Tiempo y Tº de incubación: 30 minutos a 35º C.
Tiempo de lectura: 5 minutos.

Interpretación:
• Disco rosado o rojo (+)
• Disco y/o solución AMARILLO a incoloro (-).
• Consideraciones: Algunas especies de Staphylococcus y los estreptococos
del grupo A dan, también, una prueba positiva.
Prueba de PYR
 CITOCROMOOXIDASA O
PRUEBA DE LA OXIDASA
• Fundamento: El sistema citocromooxidasa, se halla en
microorganismo aerobios, microaerófilos y anaerobios
facultativos.

• Procedimiento: Hacer una suspensión del

microorganismo con solución fisiológica (inóculo) en un
tubo de vidrio, agregar un disco (disco comercial de
papel impregnado de TETRAMETIL-PARA-
DIFENILAMINA) se agita y antes de los 2 minutos se
debe leer.

• Interpretación: Un cambio de color del disco a rosado o

violeta = prueba (+). Si no hay cambio de color el
microorganismo es oxidasa negativo.
 Oxidasa. Busca la presencia de la
enzima Citocromo C oxidasa que
oxida el citocromo C de la cadena
transportadora de e-.

NEG POS Consideraciones Esta prueba no puede

realizarse con colonias que provengan de
medios de cultivo que contenga hidratos de
carbono ni indicadores, por lo que si se la va a
Esta prueba da como realizar se debe incubar los microorganismos
resultado la presencia en un placa de AS o bien un TSA (tripteina-
soya-agar)
de E. coli (-) y P.
aeruginosa(+).
PRUEBAS LENTAS
CON LECTURA DE 18
A 48 HRS
 PRUEBA DE OXIDACIÓN
FERMENTACIÓN (O-F)
• Fundamento: Determinan el metabolismo oxidativo o
fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de
utilización. Se usa el MEDIO O-F DE HUGH Y LEIFSON que
contiene peptonas e hidratos de carbono en una relación
1:5. Al ser menor la concentración de peptonas, hay menor
producción de productos de oxidación a partir de los AA que
tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los ácidos
débiles producidos por los microorganismos no
fermentadores.
• Procedimiento: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace
la siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos
tubos. Uno de los tubos queda expuesto al aire, y el otro se
cubre con vaselina estéril.
Interpretación:
Microorganismos oxidativo: producen ácido solo en el tubo abierto, expuesto al
O2 atmosférico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosférico cambia
su color original a AMARILLO.
Microorganismos fermentadores: producen ácido en los 2 tubos. O sea que los
dos tubos viran del verde al amarillo.
Bacterias sacarolíticas: son inertes a este medio que conserva su pH alcalino
después de la incubación, conservando SU COLOR ORIGINAL.
 Óxido-fermentación: Mediante esta prueba se
va a determinar si la utilización de los hidratos
Prueba OF de Carbono por parte de un microorganismo
se realiza vía oxidativa o por vía fermentativa.
 P. aeruginosa
Rugosas: en aislamientos naturales de suelo y agua Lisas:
Huevo frito: grandes, lisas con
orillas planas y elevada
apariencia.
Mucoide: obtenidas de
secreciones respiratoria y
urinaria (“slime” por producción
de alginato)
 ROJO DE METILO – VOGES PROSKAUER:
Fundamento: El ACIDO PIRÚVICO, un compuesto fundamental formado en la
fermentación de la glucosa, es metabolizado aún mas a través de cierto numero de
vías metabólicas. Una de ellas da como resultado la producción de ACETOÍNA (acetil-
metil-carbinol) un producto final de reacción neutra. En presencia de oxigeno e KOH
al 40%, la acetoína es convertida en DIACETILO y el α naftol sirve como catalizador
para producir un complejo de color rojo.

Procedimiento: Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos pruebas

(2ml), se hace la inoculación del microorganismo, y se lleva a incubar a 35ºC durante
como mínimo 24-72hs.Luego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y
otra para la de VP.

Rojo de metilo: se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la superficie del

medio aparece un color rojo intenso es RM (+) = microorganismos que utilizan la
glucosa fermentándola hasta llegar a un pH menor a 4,4.

VP: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial

que los reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacude suavemente y luego
se deja quieto de 10 a 15 min. La aparición de color rojo = prueba (+) (presencia de
acetil-metil-carbinol).
Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP) Tests
Glucose

Acidic pathway Or Neutral pathway

Acety methyl carbinol

Mixed acids (ACETOIN)
 pH less than
4.4
Methyl Red solution A
indicator solution B

Red color
MR positive VP positive Pink color
E. coli Klebsiella
 Prueba de RM y VP

agitar para exponer

el medio al O2.
VP POSITIVO: Color
rojo-rojizo en
menos de 1h.
VP NEGATIVO:
Amarillo en
superficie.

reactivo de metilo alfa-naftol + KOH al 40%.

Estudia la fermentación butanodiólica con
Estudia la fermentación ácido mixta con
formación de un metabolito intermediario
producción de ácidos estables en el tiempo.
neutro.
• Reducción de nitratos: Sirve para determinar la
capacidad de un organismo de reducir nitratos en
nitritos. Se utiliza para asignar bacterias a la familia
Enterobacteriaceae.
• Agar de Hierro Kligler: Mediante esta prueba se
puede determinar la capacidad de un
microorganismo de metabolizar un hidrato de
carbono específico incorporado en un medio de
crecimiento básico; la producción o no de gases
CO2 e H2 como productos finales del
metabolismo de los hidratos de carbono. Y la
producción de ácido sulfhídrico.
 Kligler Iron Agar (KIA)

glucose
lactose
Ferrous sulfate
pH indicator: phenol red

• Proteins

27
28
Red/Red Alkaline /Alkaline K/K Lactose -/Glucose –
Yellow/Yellow Acid/Acid A/A Lactose +/Glucose +
Red/Yellow Alkaline/Acid K/A Lactose -/Glucose +
Gas - H2S -
Red/Yellow Alkaline/Acid K/A Lactose -/Glucose +
Gas + H2S -
Red/Yellow Alkaline/Acid K/A Lactose -/Glucose +
Gas - H2S +
Red/Black Alkaline/Acid K/A Lactose -/Glucose +
Gas + H2S +

29
 Result
Reaction on KIA Example
Butt Result
Slant color H2S
color
Non fermenter e.g.
Alk/Alk/-
Red Red Negative Pseudomonas
(No action on sugars)

Negative A/Alk/- LNF

Yellow Red (Glucose fermented e.g. Shigella
without H2S)
Positive LNF
black in A/Alk/+ e.g. Salmonella &
Yellow Red butt (Glucose fermented with Proteus
H2S)

LF
A/A/-
Negative e.g. E. coli,
Yellow Yellow (three sugars are
Klebsiella,
fermented)
Enterobacter
30
PRINCIPALES PRUEBAS DE
RUTINA
• IMVIC: El IMVIC se compone de cuatro pruebas:
Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato. Su
finalidad es identificar un organismo del grupo de
los coliformes. La presencia de estos indica
contaminacion fecal.
 IMViC
Se compone de cuatro pruebas Indol (I), Rojo de metilo (M), Voges-Proskauer (Vi) y Citrato (C).

I M Vi C
Salmonella y Citrobacter : - + - +
E. coli :+ + - -
Klebsiella y Enterobacter :- - + +
 Medios SLU TSI
CIT
IND
LIA RA MR VP
Ac. Ac. OL
Germen Al. Ac. Gas M Gas H2S TO
Sup Fond

Escherichia coli - V + V + + + - + - + + -
Klebsiella
pneumoniae
+ + + - + + + - + + - - +
Proteus + - - + - + V V - V V V V
Salmanella - - - + - + + + + + - + -
Shigella - - - - - + - - - - V + -
Yersinia - + - - + + - - - - V + -

Citrobacter - - - + - + + + - + - + -
• Indol: La prueba del indol estudia la capacidad de
degradar el triptófano con producción de Indol y
metabolitos indólicos.
PRUEBA DE INDOL
• Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo
bacteriano. Dicha liberación se debe a la DEGRADACIÓN de TRIPTÓFANO
mediante la enzima triptofanasa.
• Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas
en un caldo de triptona( Triptófano) + NaCl al 0,5%.
Para detectar el Indol se usa el REACTIVO DE KOVACS. Para el control de
calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las más
convenientes son E. coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-).

REACTIVO DE KOVACS:
Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por
alc.butílico)..........................................................................150ml
p-dimetilamino-benzaldehído.............................................10g
HCl (concentrado)................................................................50ml

Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega

lentamente a esta mezcla el ácido.
Prueba de indol ~positiva

Klebsiella E. coli
 SIM (SULFHÍDRICO – INDOL – MOVILIDAD)
• Fundamento: Es un medio semi-sólido transparente que pone en evidencia la
movilidad, la producción de TRIPTOFANASA y de SH2.
Contiene: Triptofano, la enzima triptofanasa, lo desdobla, produce indol, que se pone
de manifiesto con el reactivo de Erlich o Kovac. Citrato de hierro y amonio: los
microorganismos productores de SH2 ennegrecen el medio de cultivo.
• Si los microorganismos son móviles, al ser éste un medio semi-sólido se produce
enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en la punción.
• Procedimiento: se inocula el microorganismo por punción con ansa de punta. Se
deja incubar a 35ºC durante 24hs. y luego de este tiempo se agregan unas gotas del
reactivo de Erlich o Kovac dejándolo resbalar por las paredes del tubo.
• Interpretación:
• Triptófano (+): observar la interfase, la aparición de un color rojo fucsia brillante por
la formación de un complejo entre el indol y el p-dimetilaminobenzaldehido.
• M (+) / SH2 (-) enturbiamiento del medio
• M (+) / SH2 (+), se ennegrece todo el medio
• M (-) / SH2 (-) se observa crecimiento solamente en la estría
• M (-) / SH2 (+), se observa precipitado negro alrededor de la estría (pero no
ennegreciendo de todo el medio).
SIM
SH2+ Ind+ SH2+ Ind- SH2- Ind+ SH2- Ind-
Mot+ Mot- Mot+ Mot-
SIM
 Ureasa: : Estudia si el microorganismo posee el enzima
ureasa que cataliza la hidrólisis de la urea.

Positivo Negativo
UREA:

• Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos

microorganismo que poseen la enzima ureasa.

• Procedimiento: El medio fraccionado en pico de flauta

contiene urea y rojo de fenol como indicador, el color
original del medio es amarillo (o sea ácido) La siembra se
realiza con ansa de punta tanto en profundidad como en la
superficie. Se deja incubar 24 hs a 35º C.

• Interpretación: Si el microorganismo es productor de

ureasa, desdobla la urea produciendo amoníaco,
consecuentemente produce alcalinidad que se manifiesta
porque el medio toma un color fucsia.
 Urease Test
Principle
• Urea agar contains urea and phenol red
• Urease is an enzyme that catalyzes the conversion of urea to CO2 and NH3
• Ammonia combines with water to produce ammonium hydroxide, a
strong base which ↑ pH of the medium.
• ↑ in the pH causes phenol red r to turn a deep pink. This is indicative of a
positive reaction for urease

Urease H2O
Urea CO2 + NH3 NH4 OH ↑ in pH

Phenol Red

Method Pink
Positive test
 Streak a urea agar tube with the organism
 incubate at 37°C for 24 h
43
 CITRATO
• Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos
microorganismos que utilizan el citrato como única fuente de
carbono, el indicador es AZUL DE BROMO TIMOL.

• Procedimiento: El color original del medio es VERDE, y se

encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembra se hace
por estría, se incuba 24-72hs a 35ºC.

• Interpretación: Si el microorganismo utiliza citrato, se produce

alcalinización del medio de cultivo pasando éste a COLOR
AZUL intenso, lo cual indica prueba positiva para el citrato.
 Citrate Pyruvate CO2 + Na + H2O Na2CO3

Alkaline,↑pH
Simmone’s Citrate media
Contains Citrate as a sole of C source

Bromothymol blue
Positive test Blue colour
Negative test: E. coli
Positive test: Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter
Citrato
• Reducción Nitratos: Estudia la capacidad de los
microorganismos para reducir los nitratos por la
presencia de un conjunto de enzima denominado
nitrato reductasa
 AMINOÁCIDOS: DESCARBOXILASAS
Fundamento: Las descarboxilasas son enzimas sustrato-específicas (presentes
o no en los microorganismos) capaces de reaccionar con la porción carboxilo
(COOH) de AA formando AMINAS de reacción alcalina. Esta reacción,
conocida como descarboxilación, forma C02 como producto secundario. Cada
descarboxilasa es específica para un aminoácido.
LISINA, ARGININA y ORNITINA son los aminoácidos evaluados de rutina en la
identificación de enterobacterias.
El medio Moeller es la base (semi-sólida) que se emplea con más frecuencia.
El aminoácido se agrega a la base. El color original es LILA.

Procedimiento: Se inoculan por punción 2 tubos y se sellan con aceite

mineral. Uno de los tubos contiene el AA y el otro no.

Interpretación:
Si el aminoácido es descarboxilado, se forman aminas alcalinas y el medio
pasa a VIOLETA MÁS INTENSO.
Si no es descarboxilado pero fermenta la glucosa, vira al AMARILLO por la
formación de ácidos.
Lisina Decarboxilasa
Descarboxilasas: Estudia si el microorganismo produce los enzimas que
descarboxilan los aminoácidos presentes en el medio.
 LIA (Lysine-Iron Agar)
Agar de ensayo para la demostración SIMULTÁNEA de lisina
decarboxilasa (LD) y de la formación de hidrogeno sulfurado (H2S) para la
identificación de enterobacterias.

► Microorganismos LD positivas: Decarboxilan la LISINA 

CADAVERINA (amina). Esto produce un viraje al violeta del indicador de
pH PÚRPURA DE BROMOCRESOL, puesto que la descarboxilación sólo
tiene lugar en medio ácido (pH inferior a 6.0).
Es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio de
cultivo, por fermentación de la glucosa. Este medio de cultivo solo puede utilizarse
para la diferenciación de bacterias que fermentan glucosa.

► Microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa,

producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La
incubación prolongada puede ocasionar alcalinización en la zona de la
superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al
violeta.
La formación de H2S produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido.
Lisina Hierro Agar (LIA)

LIA – SH2 - LIA + SH2 - LIA + SH2 -

• β - D – Galactosidasa: Estudia la capacidad de
producir β - D - galactosidasa, enzima necesario
para metabolizar la lactosa.
• Hidrolisis Gelatina: Estudia la capacidad
proteolítica (la capacidad de degradación de
proteínas) del microorganismo por degradación
de la gelatina.
• Ácidos y gases: Estudia la capacidad de utilizar un
hidrato de carbono con la producción de ácidos y
la formación de gas.
• Agar TSI: El agar TSI estudia la utilización de la
glucosa y lactosa, la producción de gas y ácido
sulfhidrico (como producto metabolico final de los
aminoacidos azufrados).
 TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO AGAR)

• Fundamento: Sirve para detectar la fermentación de

hidratos de carbono. El medio contiene: glucosa al
0.1%, LACTOSA 1%, SACAROSA al 1% y PEPTONAS;
también tiene un INDICADOR ROJO DE FENOL y
sulfato de hierro para evidenciar la formación de SH2
(+SH2).

• Procedimiento: El medio se fracciona en picos de

flauta con una capa basal profunda (2 cm. por lo
menos). Con el ansa en punta se siembra por punción
y estría.
El medio no inoculado es anaranjado-rojizo o rojo
pálido. Incubar 24 hs a 35º C.
 Triple Azúcar Hierro (TSI)
Agar TSI: El agar TSI estudia la utilización de la glucosa y lactosa, la producción de gas
y ácido sulfhídrico (como producto metabólico final de los aminoácidos azufrados).
• Interpretación:
Fermentación de la GLUCOSA (alcalino/ácido) K/A
Primero los microorganismos empiezan a fermentar la GLUCOSA, produciendo
ácidos y virando totalmente el medio a color amarillo. Como solamente utilizan
la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando la glucosa que se
halla en baja concentración se consume (antes de las 24hs) los microorganismos
comienzan a utilizar la PEPTONAS con producción de amoníaco que alcaliniza el
medio dando un color rojo, pero solamente en el pico, quedando el fondo ácido.

• Fermentación de GLUCOSA, LACTOSA Y SACAROSA (ácido/ácido) A/A

Como la lactosa y sacarosa están en una proporción 10 veces mayor que la
glucosa, en un período de 24hs., la lactosa y sacarosa, aún no se consumen
quedando ácido el medio o sea totalmente amarillo.

• 3) NO FERMENTACIÓN de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino) K/K

Un microorganismo incapaz de obtener sus nutrientes de los hidratos de
carbono, lo obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son degradadas
libran amoníaco y alcalinizan el medio. Produciéndose entonces intensificación
del color.
Consideraciones del TSI
• Es importante respetar el tiempo de lectura, porque si el caso 1
se lee antes de las 24hs. se va a interpretar como ac/ac y no lo
es. Si el 2 se lee después de las 24hs, los microorganismo ya se
quedan sin hidratos de carbono, entonces comienzan a utilizar
las peptonas y se alcaliniza el medio.
Con respecto al sulfhídrico pueden presentarse distintas
modalidades:
• Pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro y formación de
gas, esto se puede dar en Salmonella, se lee: alc/ac (SH2)
(gas).También se puede ver totalmente amarillo y el fondo
negro: se lee: ac/ac (SH2).
Sistema de incubación y caracterización API
• API 20NE Sistema de detección a las 24 horas de
incubación.
• El Índice Analítico de Perfil (Analytical Profile Index o
API) son un conjunto de pruebas bioquímicas que se
concentran en muy poco espacio mediante el uso de
pocillos con el reactivo correspondiente ya preparado
para ser usado.
• Se llenan los pocillos siguiendo las instrucciones del
fabricante con la muestra problema. Se sellan los
pocillos que sean obligatorios. Se incuba la estufa a
unos 37 °C normalmente. Posteriormente se
comprueba los resultados pasado el tiempo indicado
en la tira.
• Los resultados se apuntan por cada prueba
bioquímica en el casillero correspondiente, de
manera que al final dará un número de varias
cifras. Con este número se puede buscar en el libro
de referencia de las tiras API, el tipo de bacteria
que se tiene en la muestra.
• Son muy útiles, capaces de identificar en poco
tiempo la bacteria problema (actualmente unas
600 especies). Hay varios modelos dependiendo del
uso. Por ejemplo, si la muestra es un coprocultivo
se debería usar una tira de enterobacterias.
 E. coli
• Resistentes a las condiciones ambientales (índice de
contaminación fecal en aguas y alimentos).
• Contaminación reciente (alimentos) Poco tiempo en el
ambiente.
• Bacilo Gram negativo, no forma esporas, móviles (flagelos
perítricos), mide 0.5x3 μm, Catalasa positivos, Oxidasa negativos,
Reducen nitratos a nitritos. Producen vitamina B y K.
• No exigente, fermenta GLUCOSA y LACTOSA con producción de
gas y es anaerobio facultativo.
• Exiten 5 tipos de E. coli: ETEC, EHEC, EAEC, EPEC, EIEC.
 Dx. E. coli
• Coprocultivos (Medios de cultivo generales o
selectivos).
• Medios MacConkey o EMB.
• Pruebas bioquímicas.
• Tipificación serológica.
• Técnicas de recombinación genética.
• Técnica de PCR.
 ENTEROBACTERIAS
1.- Medios no selectivos:
Agar sangre

2.- Medios selectivos-diferenciales:

Agar McConkey, Agar EMB
3.- Medios altamente selectivos:
SS agar, agar XLD, agar Hektoen
Las colonias de E. coli en agar
E.M.B.(eosina y azul de
metileno) tienen 2-4mm de
diámetro, un centro grande de
color oscuro e incluso negro, y En agar Mac Conkey
tienen brillo verde metálico las colonias son rojas
cuando se observan con luz
con halo turbio.
refleja.
 AGAR LEVINE

Es un medio selectivo y diferencial, inhibe el crecimiento de bacterias Gram

positivas y permite la diferenciación de bacterias fermentadoras y no
fermentadoras de lactosa.
No fermentadoras  colonias incoloras, y
Fermentadoras  colonias de color azulado-negro y con cierto brillo
metálico.
Las colonias de E.coli sobre agar Levine miden 2-3mm de diámetro, con
centros oscuros, casi negros, y pueden presentar o no cierto brillo verde
metálico.
IMViC (++--). No forma SH2, oxidasa- y catalasa-.
Fermenta lactosa y glucosa con gran producción de ácido y gas.
GENERO KLEBSIELLA
 Klebsiella pneumoniae:
Se encuentra normalmente en las vías respiratorias superiores
del 5-10% de las personas normales. Se aísla también de
esputos y heces por lo que su hallazgo no es significativo.

Síntomas: la neumonía se caracteriza por la producción de

esputos gelatinosos en donde está abundante el
microorganismo, ocasionando abcesos en los pulmones y
necrosis celular, presenta una mortalidad elevada.

Tratamiento: todas la cepas son resistentes a la ampicilina y la

gran mayoría poseen factores de resistencia a los antibióticos
beta-lactamicos , cefalosporinas y tetraciclinas.
 AGAR MACCONKEY
Contiene sales biliares y cristal violeta Gram + y algunas Gram - exigentes.
La lactosa es la única fuente de C.
Indicador, rojo neutro.
Fermentadoras de lactosa  colonias de diferentes tonos de rojo.
Fermentadores fuertes de lactosa  precipitan las sales biliares por la gran
cantidad de ácidos formados (zonas opacas alrededor de las colonias).
No fermentan la lactosa  colonias incoloras o transparentes.

Klebsiella pneumoniae on XLD Agar

Citrobacter

• Se encuentra normalmente en las heces de

animales y hombre pero también se ha aislado
como oportunista en muestras clínicas causando
infecciones urinarias, respiratorias o meningitis.
Sensible a tetraciclina y cloranfenicol y resistente a
ampicilina
• Citrobacter koseri tiene predilección por causar
meningitis y abscesos cerebrales en neonatos.

• Citrobacter freundii asociado con enfermedades

nosocomiales (UTI, pneumonias, y abseos
intraabdominales). Fermenta lactose e hidrolisa la
urea lentamente. Parecido a Salmonella sp.

Citrato +
Glu + /gas
Lac + SIM + Indol +
MR + Ureasa -
VP-
Genero Salmonella
 Salmonella
S. typhi: Fiebres tifoideas
S. paratyphi: Fiebres paratifoideas mas benignas.

Síntomas: malestar, fiebre, que aumenta gradualmente, dolor de

cabeza, estupefacción, perdida de apetito y una roseola en tórax
y abdomen que puede pasar desapercibida. Estas manchas
rojizas en la piel son semejantes a las del tifus lo que explica la
confusión que existió durante muchos años entre el tifus y las
fiebres tifoideas.
Tratamiento: penicilinas y cefalosporinas

Resto de Salmonella: Salmonelosis:

Síntomas: nauseas, vómitos, dolores abdominales, diarrea y
fiebre que en los casos graves puede ser alta, también puede
aparecer sangre en heces.
 AGAR XLD
ES SELECTIVO PARA SALMONELLA DEBIDO A LAS
SALES BILIARES.
• La fermentación de la Xilosa acidifica el agar activando la
lisina decarboxilasa (*). El agar se alcaliniza debido a las
aminas de la decarboxilación de la lisina provenientes de la
depleción de la Xilosa.
• La fermentación de la xilosa proporciona H+ para la
producción de H2S (*)
• El citrato de amonio ferrico presente en el agar reacciona con
el gas (H2S) y forma un precipitado negro dentro de las
colonias de Salmonella.
• El agar se vuelve Rojo-morado debido al pH alcalino de las
aminas y las colonias negras sobre el agar rojo-morado es
presuntivo de Salmonella.

* Excepto Salmonella serotype Paratyphi A

SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS/DIFERENCIALES

MEDIO XLD
Salmonella sp.
 Fundamento Agar SS:
• La pluripeptona y el extracto de carne: nutrientes.
• SALES BILIARES Y EL VERDE BRILLANTE inhiben Gram +, de la mayoría de los
coliformes y Proteus spp.
• La LACTOSA: azúcar fermentable.
• El tiosulfato de sodio  SH2 (en presencia de sulfuro de hierro).
• El ROJO NEUTRO es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante.
• Los fermentadores de lactosa que crecen, acidifican el medio haciendo virar al rojo el
indicador de pH, obteniéndose colonias ROSADAS O ROJAS sobre un fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen
adecuadamente en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.
• La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro
debido a la formación de sulfuro de hierro.
 AGAR SS:
Fermentadores de lactosa: Colonias rosadas o rojizas
No fermentadores de lactosa: Colonias del color del medio, incoloras
Productores de SH2: Colonias con centro negro .

Salmonella spp: Colonias del color del medio, incoloras con centro
negro.
Shigella spp: Colonias del color del medio, incoloras.

MEDIO SS

Incubación: En aerobiosis, a 35.37

ºC, durante 18-24 horas.
 Hektoen
Lactosa, sacarosa y salicinacolor a
amarillo o anaranjado.
El citrato férrico de amonio y el
tiosulfato sódico del medio permiten
detectar SH2 producido por Salmonella.
Indicador: Fucsina ácida y azul de
bromotimol.
Indol - RM + VP - Citrato +

IMViC (- + - +)

KIA
Género Shigella

• S. flexneri y S. sonnei son las más frecuentes y es la especie

más virulenta.
• Disentería bacilar: causante del 5-10% de las enfermedades
diarreicas en muchas zonas.
• Síntomas: fiebre, dolor abdominal, vómitos, nauseas y diarrea
acuosa muy abundante con sangre y mucosidad.
• Tratamiento: mantener la hidratación y no se suelen emplear
antibióticos, pero si es muy grave se puede emplear ampicilina
y tetraciclina.
Agar XLD
• Las especies de Shigella NOOOO fermentan la
xylosa, lactose ni sucrosa, no decarboxilan la lisina
ni producen H2S. Las colonias son incoloras.
 DETECCIÓN PRESUNTIVA DE SHIGELLA
IMViC (- + - -).
Indol - VP - Citrato -
Movilidad- RM +
KIA

Mc Conkey Hektoen
 RESUMEN -MacConkey

COLONIAS INCOLORAS COLONIAS ROSADAS

No fermentadores Fermentadores
Placa de Lactosa de Lactosa
no inoculada Salmonella, Shigella, E. coli, Citrobacter
Proteus Klebsiella, Enterobacter
 • Rojo de metilo: Es un indicador de pH. Actúa
entre un pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo hasta
amarillo respectivamente. Mediante esta prueba
se comprueba la capacidad de un
microorganismo de producir y mantener
estables los productos terminales ácidos de la
fermentación ácido-mixta. Se utiliza como parte
de la identificación a nivel especie de los bacilos
entéricos Gram negativos.

• Voges-Proskauer: Permite observar si el

microorganismo fermenta la glucosa por la vía
butanodiólica. Se usa en la identificación de
bacilos entéricos Gram negativos.