UNIVERSIDAD ARTURO MICHELENA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE PATOLOGÍA MEDICA
CARRERA DE CITOTECNOLOGIA

HIBRIDACION
IN SITU

INFORME I

PROFESOR BACHILLER
LCDO. MANUEL SANCHEZ AMANYOR CAMPEROS
INMUNOCITOQUIMICA I C.I: V-26675871
SECCIÓN 1M

SAN DIEGO, ENERO 2019

 HIBRIDACION
IN SITU (ISH)
La Hibridación In Situ es una técnica de
laboratorio utilizada para localizar objetivos
específicos de los ácidos nucleicos dentro de
tejidos y células fijadas, el cual permite obtener
una información temporal y espacial sobre la
expresión genética y su locus genético (lugar
especifico de un cromosoma donde se encuentra
localizado un gen u otra secuencia de ADN). Si
bien el fluido básico de la Hibridacion In Situ es
similar al de las Hibridaciones de Transferencia
(Hibridacion Blot) - Las sondas de ácido nucleico
es sintetizada, se etiqueta, se purifica y se marca
con el objetivo especifico. La diferencia es la
mayor cantidad de información obtenida al
visualizar los resultados dentro del tejido.
Hoy en día hay dos formas básicas para visualizar
los objetivos IN SITU del ADN Y ARN mediante la
detección de Hibridacion In Situ Fluorescente
(FISH) e Hibridacion In Situ Cromogenica (CISH).
Las características inherentes en cada método de
detección han hecho que la Hibridacion In Situ
fluorescente y la Hibridacion In Situ
Cromogenica sean útiles en aplicaciones muy
distintas. Mientras que ambos utilizan una sonda
etiquetada con el objetivo especifico que se
hibrida con la muestra, la
instrumentación utilizada para la visualización de
la muestra es diferente para cada método es
entonces cuando se destacan las diferencias y las
ventajas de cada método
La técnica fue desarrollada en 1969 por Gall y
Pardue e independientemente por Jonh et al.,
en el mismo año. Gall y colaboradores
describieron una técnica que formaba
híbridos moleculares entre RNA y DNA. La
técnica se llevó a cabo en ovocitos de
Xenopus laevis, hibridando rRNA con rDNA
extracromosomal. Detectaron la localización
diferencial en las células, de los híbridos de
ácidos nucléicos ha distintos estadíos. En ese
momento la única forma de marcaje eran los
radioisótopos, por lo que se usó tritio para el
experimento y la forma de detección fue por
autoradiografía. Evaluaron variables de la
técnica que afectan el rendimiento de la
hibridación, haciéndo hincapié en un paso
fundamental que se debe llevar a cabo para
realizar la técnica: la desnaturalización.
La alta sensibilidad que provee la prueba (de
20 a 50 copias de secuencias blanco/célula),
así como el rango tan grande de aplicaciones
dio pie a que muchos laboratorios adoptaran
la técnica; aunque uno de los principales 3
problemas que enfrentaba la hibridación in
situ era el tipo de marcaje (radioactivo) y el
tiempo requerido para la detección
(autorradiografía). La estrategia actual es
utilizar un sistema de detección con
anticuerpos aumentando la accesibilidad de la
prueba.
 Hibridacion
1 PREPARACION DEL TEJIDO
Cuando se hace sobre tejidos, órganos o
embriones, hay que pretratar el tejido antes de
añadir la sonda. Como siempre, los tejidos han
de estar fijados, siendo el formaldehído el fijador
más frecuente. Además, es preferible congelar y
obtener secciones por congelación, en vez de
incluir en parafina, cuando hay que trabajar
sobre secciones, puesto que el ARN se preserva
mejor. Es más tras un fijación, crioprotección y
congelación, el material se puede mantener
congelado durante mucho tiempo.

2 SONDA
En la hibridación in situ se usa una secuencia de
nucleótidos, denominada sonda, que es
complementaria a la secuencia del ARN que
queremos detectar, y que está conjugada con
una molécula que luego pondremos de
manifiesto y que nos sirve de marcador. El
tamaño apropiado de una sonda es de entre 50 a
300 bases. Las sondas se pueden marcar de
manera radiactiva (isotópica) o no radiactiva (no
isotópica). Esta última es la más frecuente. Las
no isotópicas se pueden marcar con biotina,
sustancias fluorescentes, digoxigenina,
bromodoxiuridina, y otras sustancias.
Para obtener una sonda hay primero que clonar
la secuencia de bases del gen (ARN mensajero)
que queremos detectar. 1) Una vez purificado el
ARN de nuestro tejido, los ARN mensajeros se
retrotranscriben (transcripción inversa) Se
obtienen hebras de ADN denominadas cDNA
(ADN clonado). 2) Mediante la técnica
de PCR ("polymerase chain reaction") se
consiguen multitud de copias de manera
específica de la secuencia que queremos
estudiar. 3) Dichas copias se integran en
un plásmido y posteriormente se introduce
en bacterias. 4) Se cultivan las bacterias para
que proliferen y así también conseguir gran
número de copias de los plásmidos, que se
duplican en cada división bacteriana. 5) Los
plásmidos se extraen y purifican. 6) Mediante un
proceso de transcripciónsimilar al que ocurre en
el núcleo de las células, a partir de estos
plásmidos se consiguen numerosas réplicas de
ARN complementarias a nuestra secuencia
inserta, que será también complementaria a la
secuencia del ARN mensajero que queremos
detectar. El resultado de la transcripción
realizada repetidas veces es un gran número de
cadenas de ARN denominadas sondas.
Durante su síntesis es cuando se añaden los
nucleótidos conjugados con las moléculas
marcadoras que nos servirán para detectarla
una vez la hibridación se haya producido.
Normalmente son moléculas pequeñas como
la digoxigenina y la biotina, aunque también se
pueden utilizar moléculas fluorescentes, que se
unen a los nucleótidos que formarán parte de la
sonda.
3 PROCESO DE HIBRIDACION
Una vez sintetizada la sonda marcada, se pone
en contacto con el tejido e hibridará con
aquellos ARN mensajeros que sean
complementarios. El lugar de hibridación se
pondrá de manifiesto cuando detectemos
nuestro marcador unido a la sonda (por ejemplo,
digoxigenina) con un anticuerpo conjugado con
un ezima (por ejemplo, la fosfatasa alcalina).
 HIBRIDACION
IN SITU
CROMOGENICA
La hibridación in situ
cromogénica (CISH, por sus
siglas en inglés) le permite
obtener información
genética en el contexto de la
morfología del tejido
utilizando métodos que ya
existen en los laboratorios
de histología.

HIBRIDACION
IN SITU
FLUORESCENTE
La hibridación de fluorescencia in
situ multiplexada (FISH) permite
analizar múltiples objetivos
simultáneamente y visualizar la
co-localización dentro de una sola
muestra. Usando etiquetas de
fluorocromo espectralmente
distintas para cada sonda de
hibridación diferente, este
enfoque le brinda el poder de
resolver varios elementos
genéticos o múltiples patrones de
expresión de genes en una sola
muestra, con visualización
multicolor.
El método de hibridación in situ
se ha convertido en una técnica
importante en diversos campos,
incluyendo diagnóstico de
rearreglos cromosomales,
detección de infecciones virales y
análisis de la función génica
durante el desarrollo
embrionario.
24