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notizie dal CINECA

NF-kB: la Proteina che


controlla l’espressione dei geni
di Ivano Eberini*, Andrew Emerson, Roberto Gambari**, Silvia Giuliani, Laura Piccagli**,
Elda Rossi
*Gruppo di Studio per la Proteomica e la Struttura delle Proteine, Dipartimento di Scienze
Farmacologiche, Università degli Studi di Milano
**Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, Università di Ferrara
The Rel/NF-kB proteins belong to one of the most studied transcription factor families. NF-kB: the protein
In fact, these proteins are involved in the control of a large number of normal cellular that controls gene
and organism processes, such as immune and inflammatory responses, development, expression
cellular growth and apoptosis. It is known that the activity of NF-kB is regulated primari-
ly by interaction with inhibitory IkB proteins through the formation of a stable IkB/NF-kB
complex. One of the best-characterized and most prevalent members of the NF-kB fami-
ly is a heterodimer composed of p50 and p65 subunits and the most studied NF-kB-IkB
interaction is that with IkBα. The protein complex simulated consists of the NF-kB
p50/p65 heterodimer in the open conformation and the IkBα inhibitor. The three dimen-
sional structures of the complexes suggest that the presence of IkBα allows a marked
conformational change of the DNA-bound ‘open’ conformation of the p50-p65 het-
erodimer with the adoption in the resting state of a IkBα -bound ‘closed’ conformation.
The aim of this work was to investigate the dynamic properties and the conformational
behaviour of the NF-kB p50-p65/IkBα system by molecular dynamic simulation.
Il patrimonio genetico di ciascuno di noi si condizioni normali non tutti i geni all’interno
esprime in tutto ciò che siamo, determinando del nucleo cellulare si esprimono con la stessa
non soltanto i nostri tratti somatici, ma anche intensità; alcuni geni addirittura alcuni non si
caratteristiche biologiche non evidenti, come esprimono proprio e rimangono “silenti”.
il gruppo sanguigno e caratteristiche compor- L’espressione genica va considerata pertanto Figura 1, a sinistra – Il fattore
tamentali altamente complesse e multifattoria- un fenomeno molto complesso; inoltre, esso è di trascrizione NF-kB (blu) con
il DNA (arancione)
li. L’espressione di un gene avviene attraverso altamente modulabile e condizionato anche da
un processo biologico piuttosto articolato che fattori esterni. In condizioni particolari di Figura 2, a destra – Il fattore di
si conclude con la produzione di proteine da stress cellulare o in presenza di malattie gene- trascrizione NF-kB (blu) con
parte delle cellule del nostro organismo. In tiche, la normale espressione di un gene può l’inibitore IkBα (bianco)

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essere alterata e dunque i normali processi che sce a migrare nel nucleo, dove può assolvere
esso controlla possono degenerare, dando alla sua funzione regolatrice.
luogo ad importanti patologie. Le ricerche pubblicate su questa proteina evi-
Un aspetto cruciale di questo fenomeno biolo- denziano che essa può assumere una diversa
gico così sfaccettato è costituito dai meccani- conformazione a seconda che si trovi nel cito-
smi di controllo che le cellule mettono in atto plasma, legata all’inibitore (forma non attiva),
per modulare l’attività di espressione genica a oppure nel nucleo, insieme al DNA (forma
livello trascrizionale, ovvero nella produzione attiva). A subire tale variazione di forma è la
degli RNA messaggeri (mRNA), dalla cui tra- porzione della proteina che ospita il DNA: “le
duzione saranno prodotte le proteine. Uno dei ali” superiori sono aperte quando vi è inserita
livelli di regolazione dell’espressione genica la doppia elica (Fig. 1), mentre sono chiuse
coinvolge i cosiddetti fattori di trascrizione, quando le “ali” inferiori interagiscono con l’i-
proteine in grado di legarsi a specifiche por- nibitore (Fig. 2).
zioni del DNA, così da attivare o disattivare, Gli studi scientifici fin qui svolti non sono
all’occorrenza, la trascrizione. Indagare in stati in grado di fare ancora chiarezza sulle
modo approfondito il loro comportamento cause di un simile riarrangiamento strutturale
significa dunque comprendere sempre meglio né sui meccanismi molecolari con cui esso si
le cause ed i meccanismi alla base di molte verifica. È la presenza dell’inibitore a deter-
malattie. minare la chiusura di NF-kB nel citoplasma o
In questo lavoro abbiamo esplorato un parti- è semplicemente l’assenza del DNA in questo
colare fattore di trascrizione, NF-kB (Nuclear compartimento cellulare? Se le tre entità, NF-
Factor Kappa B), in grado di legare nel nucleo kB, DNA ed inibitore potessero coesistere
Figura 3, a sinistra – Speedup cellulare specifiche sequenze di DNA presen- nello stesso spazio cellulare cosa succedereb-
di NAMD e GROMACS nella ti in geni da esso regolati. Si tratta di una pro- be? Nell’interazione con NF-kB prevarrebbe
simulazione di un complesso teina con caratteristiche di funzionamento l’inibitore o il DNA? Eventualmente potrebbe
proteico con solvente di circa molto interessanti, ma ancora poco definite, e formarsi un complesso a tre molecole?
30.000 atomi. Si osserva che che offre dunque vari spunti di studio sotto Abbiamo tentato di rispondere a tali interroga-
all’aumentare del numero dei molteplici punti di vista. Cerchiamo innanzi- tivi, o almeno di approfondire la problematica,
processori le performance di tutto di descrivere la sua vita ordinaria all’in- attraverso un’attività di ricerca computaziona-
NAMD, misurate in ps di simu- terno del nostro organismo. Normalmente la le, che ha richiesto adeguate competenze
lazione al giorno (ps/day) sono proteina NF-kB si trova nel citoplasma di sva- scientifiche e risorse di calcolo.
migliori riati tipi di cellule legata ad un’ulteriore pro-
Figura 4, a destra - RMSD teina (un inibitore), che la rende inattiva, cioè Attività di dinamica molecolare
calcolata su 13 ns di incapace di formare interazioni con il DNA. Al fine di rispondere a tali interrogativi abbia-
traiettoria per i Cα della sola Sotto stimoli esterni di varia natura, come mo iniziato a simulare il comportamento in
proteina NF-kB agenti batterici e virali, NF-kB si libera e rie- soluzione di svariate strutture biomolecolari.

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Il nostro primo sforzo si è concentrato sulla


scelta del software di dinamica molecolare più
adeguato alla tipologia del complesso proteico
da simulare e dell’ambiente computazione da
impiegare, un cluster linux IBM installato al
CINECA. La scelta è ricaduta su due dei più
diffusi software di dinamica molecolare,
GROMACS e NAMD.
Una precedente esperienza di simulazione di
un complesso proteico di circa 30.000 atomi
in soluzione aveva già evidenziato per NAMD
un migliore speedup all’aumentare del nume-
ro dei processori (Fig. 3). Di qui la scelta di
utilizzare NAMD per condurre le nostre simu-
lazioni sul cluster del CINECA.
Il primo complesso simulato è composto dalla se il cambiamento conformazionale osservato Figura 5 – Dinamica essenziale
proteina NF-kB in conformazione aperta e sia dovuto alla rimozione del DNA o alla pre- dei primi 7 ns di simulazione.
dall’inibitore IkBa per un totale di circa senza dell’inibitore IkBα. A tal fine sono state Si osserva un movimento di
150.000 atomi. Per 13 nanosecondi di dinami- avviate simulazioni della proteina complessa- rotazione concertato a livello
ca sono state impiegate circa 800 ore CPU per ta con il DNA e non complessata. del dominio superiore N-termi-
ogni ns. utilizzando 16 processori. La traietto- nale della proteina. Posizione
ria così ottenuta è stata analizzata con GRO- Conclusioni e ringraziamenti di partenza verde, posizione di
MACS, disponendo questo pacchetto di una Dai dati di letteratura è noto che il fattore di arrivo rossa
più vasta libreria di programmi per l’analisi. trascrizione NF-kB è inattivo in condizioni
Il plot della RMSD (Root Mean Square fisiologiche ed invece si attiva sotto l'impulso
Deviation) calcolata da 0 a 13 ns per gli atomi di stimoli esterni alla cellula, come batteri,
Cα della sola proteina NF-kB mostra un incre- virus, fattori infiammatori ed alterazioni gene-
mento fino ai 5 ns di simulazione per poi rag- tiche. È stata dimostrata un'attività di questa
giungere una regione di plateau che perdura proteina nei tessuti tumorali, nei quali favori-
fino ai 13 ns (Fig. 4). sce la proliferazione delle cellule danneggiate
Si è dunque proceduto a caratterizzare un e ne sfavorisce il processo di eliminazione.
movimento essenziale di rotazione presente Comprendere le proprietà dinamiche di questo
nei primi 7 ns di simulazione, attraverso un fattore di trascrizione in condizioni fisiologi-
approccio di dinamica essenziale. La Fig. 5 che e patologiche potrebbe contribuire alla
evidenzia un movimento di rotazione concer- scoperta di nuovi farmaci capaci di interferire,
tato a livello del dominio superiore N-termi- rallentando o arrestando, la progressione della
nale della proteina, dall’inizio della simula- malattia neoplastica e il processo di infiamma-
zione (in verde), fino al termine (in rosso). zione. Questa ricerca è stata l’oggetto della tesi
Inoltre l’analisi della RMSF (Root Mean di dotttorato di Silvia Giuliani, svolta in colla-
Square Fluctuation) individua zone della pro- borazione tra CINECA e Università di Ferrara,
teina ad alta fluttuazione, probabilmente coin- e coordinata dal prof. Roberto Gambari
volte nel movimento di rotazione. Ulteriori
conferme della rotazione provengono dall’a-
nalisi degli aminoacidi in struttura secondaria, Per ulteriori informazioni:
arricchendosi questa di circa 10 aminoacidi info.bio@cineca.it
nell’intervallo di tempo che va dai 2.5 ai 6 ns.
Dai risultati ottenuti da questa prima simula- NAMD:
zione abbiamo dunque potuto constatare che http://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/
la conformazione aperta del dominio N-termi- GROMACS:
nale della proteina NF-kB in presenza di ini- http://www.gromacs.org/
bitore ed in assenza di DNA ruota verso una
conformazione chiusa. Stiamo ora indagando doi:10.1388/notizie-61-01