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El percebe Pollicipes elegans (Lesson, 1830): caracterización de secuencias

mitocondriales y nucleares

Conference Paper · October 2009

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Javier Quinteiro Manuel Rey-Méndez

University of Santiago de Compostela University of Santiago de Compostela
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 ISBN 84-608-1061-5

12
9 788460 810612

XII FORO dos RECURSOS MARIÑOS e da ACUICULTURA das RÍAS GALEGAS

ORGANIZADO POR:
• Dpto. de Bioquímica e Bioloxía Molecular da Universidade de Santiago de Compostela
• Padroado de Turismo do Concello de O Grove • Insuiña, S.L. Pescanova • Universidad de Oriente
PATROCINADO POR:
• Skretting • Deputación de Pontevedra Editores: Manuel Rey Méndez
• Consellería de Pesca e Asuntos Marítimos • mispeces.com • WAS •FOESA • SEA • Praxair • Cortiplas Jacobo Fernández Casal
• Okana-21, S.L.• Acquavisión/Galicia • Acuarium Finisterrae • Ipac • misPeces
• Colexio Oficial de Biólogos de Galicia • Hotel Louxo A Toxa César Lodeiros Seijo
Alejandro Guerra Díaz
 XII Foro dos Recursos Mariños e da Acuicultura das Rías Galegas

XII FORO DOS RECURSOS MARIÑOS E DA

ACUICULTURA DAS RÍAS GALEGAS

XXI CICLO CULTIVANDO O MAR:

“Cambio Climático e Acuicultura:
Problemas e Solucións"

Illa de A Toxa (O Grove), 9 e 10 de outubro do 2009

1
Esta obra citarase como sigue:
Todo o libro:
Rey-Méndez M., Fernández Casal J., Lodeiros C., Guerra A. 2010. Foro Rec. Mar. Ac. Rías
Gal. 12, 880 pp. Edit. Asoc. Foro dos Recursos Mariños e da Acuicultura das Rías Galegas.
Santiago de Compostela, A Coruña, España.

E para un traballo concreto (exemplo):

Domínguez R. y González-Henríquez N. 2010. Experiencia de tratamiento de efluentes
vertidos por una empresa acuícola en Gran Canaria. En: Foro Rec. Mar. Ac. Rías Gal.
Rey-Méndez M., Fernández Casal J., Lodeiros C., Guerra A. (eds.) 12: 503-510.

Composición: Rosa Mª Martín García, Meyling Tang y Jorge Rodríguez Castro.

Dep. Legal: C 1726-2010.
ISBN: 978-84-608-1061-2.

2
 Foro Rec. Mar. Ac. Rías Gal. (2010) 12: 413-419

El percebe Pollicipes elegans (Lesson, 1830):

caracterización de secuencias mitocondriales y
nucleares

Quinteiro J., Rodríguez-Castro J. y Rey-Méndez M.

Laboratorio de Sistemática Molecular (Unidad Asociada CSIC-IIM). CIBUS. Universidade
de Santiago de Compostela. 15782-Santiago de Compostela (A Coruña).
manuel.rey.mendez@usc.es

Introducción

El percebe, Pollicipes elegans Lesson 1830, se presenta en áreas de costas rocosas

fuertemente agitadas del Pacífico Este Central. Constituye un interesante recurso marino
sometido actualmente a explotación en Perú. Una adecuada gestión del recurso debe
sustentarse en un conocimiento de la estructura genética de las poblaciones, indicativa de los
niveles de flujo génico entre diversas áreas. Además, el estudio del grado de apertura de las
poblaciones es fundamental para conocer el nivel de independencia entre la reproductividad
y el reclutamiento en una misma área. Un estudio genético similar de las poblaciones, a lo
largo del área de distibución del percebe del Atlántico Pollicipes pollicipes (Gmelin, 1789) ha
evaluado el nivel de flujo génico entre los diversos sitios de muestreo, siendo de aplicación a
la gestión sostenible del recurso (Quinteiro et al. 2007). Con el fin de permitir tales estudios,
se ha llevado a cabo en P. elegans la caracterización de secuencias nucleares y mitocondriales
de probada eficiencia y resolución. Se han caracterizado las secuencias correspondientes al
operón nuclear ribosomal, incluyendo los interespaciadores ribosomales 1 y 2 (ITS1 e ITS2)
,y el gen 5.8S rDNA. En cuanto a las secuencias mitocondriales, se han caracterizado los
genes COI, codificante, y la secuencia no codificante rica en AT, posiblemente homóloga de
la región control mitocondrial.

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El percebe Pollicipes elegans (Lesson, 1830): caracterización de secuencias mitocondriales y nucleares

Materiales y métodos

Los individuos adultos de Pollicipes elegans (N=11) fueron colectados en la Isla de

Lobos Afuera (Perú) (6º57’04’’N/80º41’20’’W, 05/08/2008) por César Martín Quevedo Vera
(Instituto Tecnológico Pesquero del Perú) y Eduardo Uribe (Universidad Católica del Norte,
Coquimbo, Chile). A partir de 30 mg de tejido muscular del pedúnculo se aisló el ADN total
mediante el kit DNeasy Tissue kit (Qiagen).

La secuencia de la región control mitocondrial completa fue obtenida con los

cebadores CIRR12S y CRUS-Met-B (Quinteiro et al., enviado). Las secuencias parciales,
correspondientes a un fragmento del gen mitocondrial de la citocromo oxidasa subunidad
I (COI), se obtuvieron con los cebadores LCO1490 y HCO2198 (Folmer et al. 1994). Las
secuencias multicopia correspondientes al operón ribosomal nuclear, incluyendo ITS1, 5.8S
rDNA e ITS2 ,fueron amplificadas con los cebadores POL18S1F y POL18S2R (Quinteiro
et al., enviado).

Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en 15 μL de volumen, utilizando

un termociclador GeneAmp 9700 (Applied Biosystems). Cada reacción incluyó 1x Green
GoTaq Buffer (Promega), 1.5 mM MgCl2, 200 μM de cada dNTP, 0,3 unidades de GoTaq
(Promega), 0,1 μM de cada cebador y 0,5 μL de la solución de ADN. El perfil térmico de la
PCR para la region control mitocondrial fue el siguiente: 95ºC, 2 min, seguido de 35 ciclos
de 95ºC durante 40 seg, 50ºC, 40 seg y 72ºC, 1 min.

Las amplificaciónes de las secuencias ribosomales nucleares, fueron purificadas del

gel con Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) y clonadas con el sistema
pGEM-T Easy Vector (Promega). Los plásmidos fueron aislados con el kit EZNA Plasmid
Miniprep kit (Omega Bio-Tek). La secuenciación de ADN se llevó a cabo usando el kit
BigDye 3.1 sequencing (Applied Biosystems). Los productos de extension se purificaron con
las columnas DyeEx 2.0 Spin (Qiagen), siendo detectados en un secuenciador automático
ABI PRISM 377XL (Applied Bisystems). Los electroferogramas fueron revisados y las
secuencias editadas y alineadas con BioEdit 7.0.1 (Hall 1999).

El análisis de los valores de diversidad genética fueron estimados con el software

DnaSP (Rozas et al. 2003). El análisis filogenético fue llevado a cabo con el programa MEGA,
mediante el método de Neighbor-Joining (Saitou & Nei 1987) y estimando las distancias de
Tamura-Nei (Tamura & Nei 1993). La fiabilidad de los nodos fue calculada por el método de
remuestreo con 2000 réplicas (Felsenstein 1985).

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 XII Foro dos Recursos Mariños e da Acuicultura das Rías Galegas

Resultados y discusión

El alineamiento obtenido para el gen mitocondrial COI de P. elegans (N=10) contiene

584 bases de las cuales 13 son sitios nucleotídicos variables, detectándose 7 haplotipos
diferentes. La diversidad nucleotídica (π) es de 0,00705 y la diversidad haplotípica (h) es de
0,911. El test de Tajima para la neutralidad de las secuencias muestra un valor negativo no
significativo.

El alineamiento generado para la secuencia mitocondrial de la región control

(N=11) presenta una longitud de 509 pares de bases, incluyendo 34 huecos. El número de
sitios variables es de 52, detectándose 11 haplotipos. La diversidad nucleotídica (π) se sitúa
en 0,0312, siendo la diversidad haplotípica (h) de 1. El test de Tajima muestra un valor no
significativo.

A partir de la amplificación de las secuencias del operón ribosomal se obtuvieron 8

clones, a partir del mismo individuo, con 2 secuencias diferenciadas en una única base. La
secuencia obtenida, de una longitud de 786 pares de bases, incluye un pequeño fragmento de
los genes 18SrDNA y 28SrDNA, además de los ITS1, 5.8SrDNA e ITS2 completos.

Tabla I.- Valores de diversidad genética básicos para P. elegans y las especies congenéricas
(P. pollicipes, P. polymerus), incluyendo una nueva especie (P. sp. nov.).
Sitios
N N haplotipos π h Tajima D
polimórficos
COI
P.elegans 10 7 13 0,0070 0,911 -0,4790
P. polymerus 10 10 23 0,0113 1 -1,0550
P.pollicipes 10 9 13 0,0059 0,978 -1,3157
P. sp. nov. 10 8 21 0,0110 0,933 -0,6357
Región control
P.elegans 11 11 52 0,0312 1 -0,7817
P. polymerus 7 7 63 0,0538 1 -0,6362
P.pollicipes 10 9 49 0,0358 0,978 -0,6825
P. sp. nov. 10 10 63 0,0502 1 0,0241

La comparación de los valores de diversidad genética de P. elegans y de las otras

especies congenéricas (Tabla I), muestra una similitud de valores entre especies. Por el

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El percebe Pollicipes elegans (Lesson, 1830): caracterización de secuencias mitocondriales y nucleares

contrario, la comparación de los valores de ambas secuencias mitocondriales muestra, como

era esperable (Quinteiro et al., 2007), una importante variabilidad. La secuencia no codificante
de la región control presenta la mayor variabilidad, frente a la secuencia codificante del
COI. Ambas secuencias, con distinto grado de conservación, constituyen unos marcadores
apropiados para la definición de haplotipos en el marco de un estudio genético poblacional.

La conservación entre las copias múltiples por genoma de la secuencia nuclear

posibilitaría su aplicación a un estudio poblacional masivo, debido a la ausencia de la
necesidad de clonar dichas secuencias en cada individuo. Ello conllevaría la presencia de
juegos de datos mitocondriales, con diversa variabilidad, y nucleares, en una situación ideal
de análisis con marcadores alternativos.

La inferencia de las relaciones filogenéticas basada en las secuencia COI, muestra

como la divergencia genética de P. elegans se encuentra en el mismo rango (0,15-0,17)
respecto a las otras especies congenéricas. Debido a la ausencia de un grupo externo
apropiado, los árboles obtenidos incluyen las tres especies clásicamente definidas (P.
pollicipes, P. polymerus y P. elegans) y una nueva especie, actualmente en proceso de
descripción por los mismos autores. Las especies del Pacífico (P. polymerus y P. elegans)
se agrupan monofiléticamente con un 100% de valores de remuestreo, mientras que, aunque
las especies atlánticas se agrupan también monofiléticamente, el clado presenta un valor
de remuestreo inferior al 50% (Fig.1). Esta situación de topología en estrella es típica de
eventos de especiación simultánea o en cortos espacios temporales. Además, la profunda
divergencia, indicativa de remotos eventos de especiación, dificulta la recuperación de una
señal filogenética informativa.

Recomendaciones

El nivel de explotación al que está sometido el recurso pesquero de P. elegans,

recomienda la elaboración de estudios de genética poblacional como una herramienta
para la gestión sostenible del recurso. Para ello se sugiere la utilización de las secuencias
caracterizadas en el presente trabajo.

Conclusiones
Las secuencias nucleares caracterizadas, correspondientes a los interespaciadores
ribosomales 1 y 2 (ITS1 e ITS2) y el gen 5.8S rDNA y mitocondriales del gen COI y la región
control, constituyen marcadores apropiados y alternativos para el estudio a nivel poblacional
en P. elegans.

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Figura 1.- Árbol filogenético no enraizado basado en secuencias del gen mitocondrial COI de
las tres especies de percebe clásicamente descritas (P. pollicipes, P. polymerus y P. elegans) y
una nueva en proceso de descripción (Pollicipes sp. nov.). El análisis de remuestreo se ha basado
en 2000 réplicas. Las distancias genéticas fueron calculadas con el método de Tamura-Nei.

Bibliografía

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El percebe Pollicipes elegans (Lesson, 1830): caracterización de secuencias mitocondriales y nucleares

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