Sei sulla pagina 1di 12

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE ZACATECAS

CARRERA: Ingeniería en Biotecnología

MATERIA: Biología Molecular

DOCENTE: Dra. Mayra Judith García Robles

INFORME DE INVESTIGACIÓN:
“PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES Y
MONOCLONALES”

ALUMNAS:
Andrea Isabel Díaz Arroyo
Ana Isabel Serrano Páez
Emili Cuevas Ramírez
MATRÍCULAS:
1170667
1770598
1170536
GRUPO: 5.3
LUGAR Y FECHA: Fresnillo, Zac. 09/04/19
INTRODUCCIÓN

Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas modificadas, diseñadas específicamente para


actuar frente a dianas concretas, con el objetivo de interrumpir un proceso patológico concreto,
estimular una acción celular determinada o desviar un mecanismo celular hacia una vía de interés.

Su historia comienza en 1975, fecha en la que se produjo un hito importante en el descubrimiento de


estos fármacos, la puesta a punto de la tecnología del hibridoma, por Khöler y Milstein, hecho por el
cual recibieron el premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1984.

Esta tecnología supuso un importante avance, ya que permitió obtener anticuerpos específicos
capaces de reconocer a un único epítopo o determinante antigénico y producirlos de forma ilimitada.
El procedimiento comienza con la inmunización de un ratón con el antígeno de interés, tras la cual,
se extraen los linfocitos B a partir del bazo del animal y se fusionan con células neoplásicas de
mieloma. De esta manera se obtiene una célula de fusión, un hibridoma, que combina ciertas ventajas
de sus progenitores, la capacidad de producir grandes cantidades de un único anticuerpo, propia de
los linfocitos B y la capacidad de multiplicarse indefinidamente, característica de las células
neoplásicas, en continuación, se seleccionan los hibridomas capaces de producir los anticuerpos
deseados y se produce la expansión del clon de mayor interés. Finalmente se procede a la purificación
de los anticuerpos obtenidos. De esta manera se obtiene una fuente casi inagotable de anticuerpos
producidos por un clon celular, que derivan de un único linfocito B, y que son por tanto idénticos y
específicos de epítopos individuales.

Anticuerpos monoclonales y policlonales


El primer anticuerpo monoclonal terapéutico producido mediante esta tecnología fue muromonab, de
origen murino, dirigido frente al antígeno CD3 que se expresa en la superficie de los linfocitos T. Fue
aprobado por la FDA (Food and Drugs Administration) en 1986 para el tratamiento del rechazo en
pacientes trasplantados. Sin embargo, el empleo de anticuerpos monoclonales murinos obtenidos
mediante esta tecnología presentaba importantes limitaciones derivadas de su origen no humano,
como su corta semivida plasmática o unas funciones efectoras ineficientes, pero sobre todo, la
producción de anticuerpos humanos frente a las cadenas murinas, que provocaba importantes efectos
adversos que limitaban su uso clínico (Foltz IN, 2013)

Con el fin de evitar estos problemas, graves, y gracias a las técnicas de ingeniería genética, se
desarrollaron nuevas técnicas moleculares que dieron lugar a la obtención de los anticuerpos
monoclonales de segunda generación, los anticuerpos monoclonales recombinantes (Sanz L, 2009),
en los cuales se reemplazaron porciones del anticuerpo murino por proteínas humanas. En primer
lugar se obtuvieron los anticuerpos monoclonales quiméricos, en los que la región Fab es de origen
murino mientras que la fracción cristalizable Fc es de origen humano, y posteriormente los
anticuerpos monoclonales humanizados, en los que la región Fc sigue siendo de origen humano y la
región Fab es parcialmente humana y parcialmente murina. Los anticuerpos monoclonales quiméricos
contienen aproximadamente un 65-90% de cadena humana mientras que los humanizados contienen
aproximadamente un 90-95%. En 1997 se aprobó el primer anticuerpo monoclonal quimérico,
rituximab, y en 1999 el primero humanizado (Sanz L, 2009).

Actualmente, se han desarrollado procedimientos que permiten obtener anticuerpos monoclonales


completamente humanos, reduciéndose considerablemente el potencial inmunogénico. El primero de
ellos, adalimumab,10 fue autorizado en 2003.

Un método para obtener anticuerpos monoclonales completamente humanos consiste en la utilización


de ratones transgénicos, en los cuales se introducen los genes de las inmunoglobulinas humanas
utilizando distintos vectores. Los ratones transgénicos portadores de los genes de las
inmunoglobulinas humanas se cruzan con ratones en los cuales se han eliminado los genes de las
inmunoglobulinas endógenas murinas, con el fin de conseguir un ratón capaz de producir
exclusivamente inmunoglobulinas humanas.

Por otra parte, la tecnología Phage Display (presentación de proteínas en la superficie de fagos
filamentosos) permite obtener anticuerpos monoclonales sin utilizar ratones. Los fagos son partículas
víricas que infectan bacterias, sin producir enfermedades en los seres humanos. Mediante técnicas de
ADN recombinante es posible introducir genes de cualquier organismo, sin importar la complejidad,
en el genoma de los fagos. Estos fagos modificados genéticamente pueden expresar en su superficie
diferentes proteínas terapéuticas. En líneas generales, lo que se pretende con esta tecnología es
obtener una molécula que posea la máxima afinidad por una determinada diana terapéutica. Y para
ello, el primer paso es obtener todas las posibles combinaciones genéticas que produzcan la molécula
que se está buscando y cada una de estas secuencias se fusiona con el gen que codifica las proteínas
de la cápside del fago, para lograr que sean expresadas en su superficie. De esta forma se obtienen
clones de fagos, cada uno de los cuales produce una variante diferente de la secuencia de la proteína
que se desea obtener. Posteriormente, se eligen aquellos fagos que expresen en su superficie la
molécula con las mejores propiedades de unión a la molécula diana.

Los anticuerpos policlonales son aquellos producidos por más de una clona delinfocitos B. Cada uno
reconoce un antígeno distinto o diferentes epítopes de un mismo antígeno.
Los antígenos que pueden provocar una respuesta inmune de forma natural son complejos e incluyen
varios epítopes por lo que las respuestas de anticuerpos que inducen siempre son policlonales.

Los anticuerpos policlonales para uso en investigación y medicina pueden obtenerse inmunizando un
animal con el antígeno de interés (incluyendo una proteína transportadora y un adyuvante de ser
necesarios) y purificando los anticuerpos que produce.
Se puede utilizar muchos tipos de animales pero los más comunes son ratón, conejo y cabra.
Los anticuerpos policlonales obtenidos serán una mezcla de los producidos por todas las clonas de
linfocitos B activadas por la inmunización por lo cual su especificidad y afinidad son heterogéneas
Cuando se administran a humanos pueden ser reconocidos como proteínas extrañas y producir
respuestas inmunes que los inactivan o generan enfermedades por inmunocomplejos
(hipersensibilidad tipo III) en nuevas administraciones.
También se producen preparaciones de anticuerpos policlonales a partir de suero de humanos o por
producción de proteínas recombinantes (Murphy, K, 2012).

Identificación de los anticuerpos mono y policlonales a partir de las diferentes técnicas


cromatográficas utilizadas durante su detección
Para la identificación de los anticuerpos mono y policlonales a partir de las diferentes técnicas
cromatografías utilizadas durante su detección, se han encontrado varias técnicas y métodos como los
que se muestran a continuación:

La inmunocitoquímica, que es una técnica para la localización de moléculas en los tejidos mediante
el empleo de anticuerpos. Es una técnica que gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la
estandarización de su protocolo se ha convertido en un método sencillo, rápido y muy potente.

Se basa en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos para reconocer a moléculas
y unirse a ellas. Además, la conjugación o combinación de los anticuerpos con enzimas o con
sustancias fluorescentes permite detectar cantidades ínfimas de moléculas presentes en el tejido.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las técnicas inmunocitoquímicas son del tipo G,
producidas por unas células del sistema inmunitario denominados linfocitos B durante la respuesta
inmune. La producción masiva de anticuerpos se produce en un animal cuando le inyectamos una
molécula que reconoce como extraña. Estos anticuerpos pasan al suero sanguíneo, el cual se extrae
del animal inmunizado, y del que posteriormente se purifican. Dichos anticuerpos purificados se
usarán posteriormente en la técnica inmunocitoquímica.
Las moléculas complejas como las proteínas pueden tener en su estructura varios determinantes
antigénicos, es decir, lugares que son capaces de desencadenar una respuesta inmune. Cuando se
emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoquímica se dice que se están empleando
anticuerpos policlonales. Por otra parte, existe una técnica que permite aislar y cultivar en el
laboratorio (in vitro) de forma invidualizada a cada uno de los clones de linfocitos B activados
durante la respuesta inmune. Cada uno de esos cultivos producirá un solo tipo de inmunoglobulina
G que reconocerá sólo a uno de los determinantes antigénicos de la molécula inyectada. A los
anticuerpos obtenidos de cada uno de esos cultivos se les denomina monoclonales ya que proceden
de linfocitos que producen inmunoglobulinas idénticas (Atlas, 2019)

Fig.1 Esquema
resumido de las
diferencias en la
obtención de
anticuerpos
policlonales
(izquierda) y
monoclonales
(centro y
derecha).
ELISA es una de las técnicas más utilizadas para identificar o confirmar la especificidad de los
anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes con enfermedades autoinmunes. Además, por
su fácil estandarización, manejo y variedad de antígenos disponibles, ha desplazado notablemente a
otras técnicas como el radioinmunoensayo para la detección de anticuerpos anti-DNAcd (conocido
también como prueba de Farr), ya que no utiliza radionúclidos, lo que hace que sea una técnica
accesible y de bajo riesgo. Si bien existen diferentes tipos de ELISA, el más utilizado en el laboratorio
de diagnóstico de autoinmunidad es el ELISA indirecto, el cual se fundamenta en el reconocimiento
de los anticuerpos específicos presentes en las muestras de los pacientes, mediante un anticuerpo
dirigido contra la región Fc humana de cualquier isotipo (IgG, IgA o IgM) e inclusive de cualquier
subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2) (M.J. Fritzler,2006).

En los últimos años el ensayo luminométrico múltiple (ELM) se ha vuelto popular, debido a que
permite la detección de hasta 100 diferentes auto anticuerpos que reconocen el mismo número de
antígenos en una sola determinación y con un volumen pequeño de muestra (aproximadamente 50μL).
Estas son las ventajas más importantes del ensayo comparado con el ELISA, ya que para realizar el
mismo número de determinaciones específicas por ELISA se requerirían 100 placas y 5mL de
muestra. La técnica es una variante del ELISA indirecto, pero la detección es distinta: en el ELISA
se utiliza un compuesto cromogénico, en tanto que en el ELM la detección se realiza por
fluorescencia, con lo que la sensibilidad del ensayo es mayor) (M.J. Fritzler,2006).

Hibridomas

Ya que los anticuerpos monoclonales, son un conjunto de moléculas de anticuerpos idénticas, todas
con la misma especificidad, producidas por un único clon de linfocitos B. Se obtienen mediante la
técnica de los hibridomas, que consiste en fusionar in vitro linfocitos B, provenientes de un ratón
sensibilizado con el antígeno, con células tumorales procedentes de un mieloma (tumor linfocitario),
capaces de proliferar de forma indefinida. Se obtiene una célula llamada hibridoma, que hereda del
linfocito B la capacidad de producir un determinado anticuerpo, y de la célula tumoral la capacidad
de reproducirse indefinidamente. Posteriormente el hibridoma se clona, consiguiendo gran cantidad
de células que producirán el mismo anticuerpo en grandes cantidades (M.J. Fritzler,2006).

Algunas de sus aplicaciones son:

 Detectar la presencia de moléculas de interés médico en fluidos corporales, como drogas,


hormonas, proteínas asociadas a cánceres o indicadoras de infecciones víricas. En los análisis
de estos fluidos se puede reconocer rápidamente la presencia de una determinada sustancia o
de un virus, usando soluciones de anticuerpos monoclonales específicos contra ellos, siempre
y cuando dichos anticuerpos vayan unidos a moléculas marcadoras que generen una
determinada coloración.
 Determinar los grupos sanguíneos humanos.
 Transportar fármacos o agentes citotóxicos hasta el antígeno (mediante la unión del
anticuerpo monoclonal a los mismos), que será una célula o un tejido dañado. Esto es útil en
terapias contra el cáncer.

Hibridoma

Es una línea celular híbrida obtenida mediante la fusión de un linfocito B productor del anticuerpo
específico de interés, con una línea celular de mieloma (linfocito B canceroso) que no produce
una inmunoglobulina propia. Se obtiene así una línea celular inmortal capaz de producir el anticuerpo
monoclonal de interés, que puede recuperarse del medio (Clinica universidad de Navarra, 2018).

Relación de los hibridomas con la producción y aplicaciones de los anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas modificadas, diseñadas específicamente para


actuar frente a dianas concretas, con el objetivo de interrumpir un proceso patológico concreto,
estimular una acción celular determinada o desviar un mecanismo celular hacia una vía de interés.

Para producirlos se necesita aislar la clona de linfocitos B en el laboratorio. Esto se puede lograr por
varios métodos pero el principal es la fusión de los linfocitos B de un animal inmunizado para el
antígeno de interés con células de un mieloma múltiple (tumor de células plasmáticas, que provienen
de los linfocitos B) para producir una célula híbrida llamada hibridoma que puede vivir
indefinidamente y puede ser aislada y caracterizada (Barriento, s.f.)

Esta tecnología puede hacerse con varios tipos de animales e incluso células humanas, pero las
células más usadas son de ratón y conejo.
Ilustración 1 Representación esquemática de la obtención de anticuerpos monoclonales mediante la
técnica de hibridomas.

Las células de mieloma múltiple son una línea celular para uso en investigación. Pueden crecer en
cultivo indefinidamente. Para la producción de hibridomas, se induce pormutaciones en estas células
las siguientes características:

 Que no produzcan anticuerpos.


 Que no tengan una enzima necesaria para crecer en un medio de cultivo especial.
 Por su parte, los linfocitos B del animal inmunizado solo pueden vivir en cultivo unos días.
 La fusión de las células se hace por medio del compuesto polietilenglicol que inducefusión
de las membranas, para formar los hibridomas.
 Después de la fusión se cultiva las células en el medio especial de selección,diluyéndolas
muchísimo, hasta tener una sola célula en cada pozo de cultivo:
1. Los linfocitos B que no se hayan fusionado muerena los pocos días porque noson
inmortales.
2. Las células del mielomaque no se hayan fusionado mueren por falta de laenzima.
3. Los hibridomas viven: el mieloma les confiere la inmortalidad y el linfocito Bla
enzima necesaria para vivir en el medio de cultivo.
 Los anticuerpos producidos por cada hibridoma sonmonoclonales y pueden estudiarse su
especificidad y afinidad, así como sus acciones biológicas (Barriento, s.f.)

La capacidad en un hibridoma establecido de producir los anticuerpos permanece indefinidamente y


siempre es posible reconstituir la línea a partir de los clones congelados, con lo que la disponibilidad
del anticuerpo producido así como la reproductibilidad del ensayo realizado con el mismo es
permanente.

El desarrollo de esta técnica ha permitido ir introduciendo diferentes variedades metodológicas tales


como el uso de linfocitos esplénicos estimulados por inmunización in vitro; la obtención de
anticuerpos monoclonales humanos (via fusión de linfocitos humanos con mieloma murino);
producción, a partir de monoclonales, de anticuerpos bifuncionales sintetizados químicament o por
medio de la fusión, bien entre un hibridoma y un linfocito procedente de una inmunización, bien entre
dos hibridomas; y aplicación de tecnologías de DNA recombinante sobre hibridomas (Torrús, s.f.).

Los anticuerpos monoclonales han sustituido a los sueros policlonales para las investigaciones
llevadas a cabo en las que se requiere ensayos de alta afinidad, sensibilidad, y precisión, o bien donde
se necesita trabajar en condiciones que permitan aumentar la detectabilidad de una táctica.

Así, se emplean en la actualidad en técnicas tales como la detección de antígenos celulares de


superficie, identificación de líneas hematopoyéticas de células humanas, diagnóstico con aplicaciones
forenses sobre muestras de alimentos, bebidas y drogas ingeridas, aplicaciones de diagnosis y
terapéuticas sobre infecciones víricas o bacterianas, aplicaciones en inmunoterapia y diagnosis de
tumores in vivo, aplicaciones en cromatografía de inmunoafinidad para purificar determinadas
moléculas a partir de preparaciones mixtas, inmunológicas para identificar aquellas moléculas que
mejor puedan confeccionarse como vacunas; En definitiva, un gran número de posibilidades que
convierten a este técnica en una herramienta de gran utilidad en el campo científico y con un amplio
horizonte aún por descubrir (Torrús, s.f.).

Metodología

Purificación de anticuerpos por precipitación con sulfato amónico

Es uno de los métodos de purificación de anticuerpos más frecuentes. Al incrementar la


concentración salina, determinadas proteínas se vuelven menos solubles, hasta que acaban
precipitando. Los anticuerpos precipitan a menores concentraciones de sulfato amónico que
otras proteínas, debido a la alta hidrofobicidad propia de las inmunoglobulinas.

El producto resultante será la fracción Ig de la muestra (todos los anticuerpos presentes en


la misma), que puede ser suficiente para determinados ensayos, o utilizarse como fase
previa a una purificación por afinidad (Abyntek, 2016).
Comparación de la la especificidad de la prueba utilizada con respecto a otras existentes

Cromatografía de intercambio iónico (IEC)

Se utilizan resinas cargadas positiva o negativamente para unir proteínas en función de sus cargas
netas en un determinado buffer (a un determinado pH) (Abyntek, 2016).

Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

Permite separar anticuerpos (˃140kDa) de componentes con un menor pero molecular (MW)
presentes en la muestra, como pequeñas proteínas y péptidos (Abyntek, 2016).

Habitualmente se utiliza como paso previo a una purificación por afinidad, y no como un método de
purificación de anticuerpos definitivo en sí mismo.

Cromatografía de quelatos metálicos (IMAC)

Utiliza quelatos de iones metálicos divalentes inmovilizados para unirse a proteínas o péptidos que
contengas clusters de histidina (por ejemplo, las IgG de mamíferos) o más de tres residuos de
histidina consecutivos. (También es un método de purificación habitual para proteínas
recombinantes con cola de histidina) (Abyntek, 2016).

Diferencias con respecto a la producción de anticuerpos monoclonales

Como se observa en la Ilustración 2 se tienen bastantes diferencias entre los dos tipos de anticuerpos,
de las más relevantes, es el costo que lleva la producción de estos, también el rendimiento hay una
gran diferencia ya que los policlonales tienen un concentración media de 1mg/mL en cambio los
monoclonales 20mg/ml. Y la afinidad es fija en los monoclonales y varia en los policlonales.

Ilustración 2. Diferencias en la producción de Anticuerpos Policlonales y Anticuerpos Monoclonales.

Fundamento
El antisuero de un animal inmunizado o el sobrenadante de un cultivo de hibridomas podrían llegar a
utilizarse directamente como reactivo en determinados casos, aunque habitualmente es necesario
aplicar previamente alguno de los métodos de purificación de anticuerpos para la realización y el
correcto desarrollo de la mayoría de inmunoensayos.

Las inmunoglobulinas suponen aproximadamente el 20% del total de proteínas plasmáticas, por lo
que no aplicar métodos específicos de purificación de anticuerpos podría resultar en reacciones no
deseadas entre otros componentes del plasma/medio y la muestra diana.

Existen diversos métodos de purificación de anticuerpos, dependiendo del material de partida, el


grado de pureza que se desee obtener y la aplicación o el uso que se prevea hacer de ese anticuerpo.
Todos ellos tratan de aislar selectivamente los anticuerpos de interés a partir de suero inmune
(purificación de anticuerpos policlonales) o bien a partir de líquido ascítico o sobrenadante de cultivo
(purificación de anticuerpos monoclonales) (Abyntek, 2016).

CONCLUSIÓN

Un anticuerpo policlonal y monoclonal. Cuando se inocula un antígeno se produce una respuesta


inmunológica con anticuerpos determinantes del antígeno, todos los anticuerpos producen en forma
simultanea pero solo con un determinante en concreto, es lo que produce la respuesta inmune normal,
y a esta mezcla de anticuerpos se le denomina su o anticuerpo policlonal, por que procede de varios
linfocitos B, que se expandieron cada uno con un clon celular. La inoculación es llevada a cabo con
un antígeno que contuviese un único epitopo, solo se activaría un clon celular y se produciría un único
anticuerpo siendo así un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir
de hibridomas.

REFERENCIAS

Abyntek. (19 de Mayo de 2016). MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS. Obtenido de


Anticuerpos, Investigación: http://www.abyntek.com/metodos-de-purificacion-de-
anticuerpos/

Barriento, A. (s.f.). ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES. Obtenido de


academia.edu:
https://www.academia.edu/28869078/ANTICUERPOS_POLICLONALES_Y_MONOCLO
NALES

Castillo, L. V. (s.f.). PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS. Obtenido de botplusweb:


https://.portalfarma.com/documentos/2017/12/13/120423.pdf

Clinica universidad de Navarra. (2018). Obtenido de Hibridoma: https://www.cun.es/diccionario-


medico/terminos/hibridoma

Torrús, G. E. (s.f.). Anticuerpos monoclonales, tecnologías en desarrollo. Obtenido de UNAM:


http://www.encuentros.uma.es/encuentros34/monoclon34.html

Foltz IN, Karow M, Wasserman SM. Evolution and emergence of therapeutic monoclonal
antibodies. What cardiologists need to know. Circulation 2013.
Sanz L, Álvarez-Vallina L. Anticuerpos monoclonales. Biotecnología y Biofármacos. Consejo
General de Colegios Oficiales de Farmacéuticos. 2009
Murphy, K. (2012) Janeway’s Immunobiology New York, NY: Garland Science
Atlas de Histología Vegetal y Animal. (Actualizado 30-01-19). Imnunocitoquimica. 8-4-19, de
Universidad de Vigo España Sitio web: https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/5-inmuno.php

M.J. Fritzler, Advances and applications of multiplexes diagnóstic technologies in autoinmune


diseases. Lupus, 15 (2006), pp. 422-427.