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1. Las enzimas son proteínas, estas macromoléculas han sido seleccionadas para tal fin
debido a su complejidad estructural, permitiendo se pueda cumplir eficientemente con
la especificidad que se requiere para catalizar las miles de reacciones distintas que
suceden en los organismos vivos. Actualmente se sabe que algunas moléculas de RNA
tienen también función catalítica, principalmente autocatalítica; estas moléculas son
conocidas ahora como Ribozimas.
Las ribozimas mejor conocidas son los intrones, cuya función es el autoprocesamiento
del RNA transcrito (mRNA) y la subunidad de RNA de la ribonucleasa P de
Escherichia coli, enzima cuya acción catalítica reside en la subunidad compuesta por
RNA; la función de esta enzima es procesar el extremo 5’ de los tRNAs. Estas enzimas
tan particulares, comparten muchas características con las enzimas convencionales:
especificidad de sustrato, especificidad de acción, cinética de saturación hiperbólica,
estructura tridimensional, requieren de iones metálicos (Mg 2+), no forman
subproductos, pueden ser inhibidas y catalizan un amplio repertorio de reacciones
químicas; pero a diferencia de las proteínas, no son moléculas con la suficiente
diversidad estructural que les permita encargarse de todas o casi todas las reacciones
metabólicas.
2. Son moléculas altamente específicas es decir, para cada reacción que se realice en una
célula, debe existir allí una enzima determinada que la catalice, si esta última no está
presente, entonces no se llevará a cabo la reacción; esto nos indica que las enzimas
también cumplen un rol muy importante en la regulación del metabolismo.
el que aumente “k1” por acción de la enzima, implica que la misma enzima debe
aumentar también k2 para que no varíe la constante de equilibrio.
4. Las enzimas son altamente eficientes, podemos decir que aumentan la velocidad de las
reacciones entre 108 a 1012 veces. Si comparamos el tiempo en el que ocurre la
transformación siguiente:
6. Las enzimas, a pesar que durante un proceso catalítico pasan por una serie de formas de
transición intermediarias, salen de las reacciones tal como ingresaron, es decir, no
forman subproductos, esto permite que sean útiles varias veces; asimismo, en un
proceso industrial (por ejemplo al utilizar un reactor enzimático tipo batch), esto facilita
la purificación del producto, ya que hay menos contaminantes y los residuos
enzimáticos por ser de naturaleza macromolecular, pueden ser eliminados por métodos
sencillos.
Para una reacción de un solo reactante y un solo producto, es de suponer que la catálisis
ocurra a través del paso por varios estados transicionales que serían como mínimo los
siguientes:
TERMINOLOGÍA:
Nota: Cleland también propone su nomenclatura para designar a los diferentes estados que
puede tomar la enzima durante la catálisis, esta utiliza las letras mayúsculas E, F, G, H, etc.
SITIO DE UNIÓN DEL SUSTRATO: Es el lugar de la enzima donde tiene lugar la unión
del sustrato o sustratos es decir, el lugar de reconocimiento del sustrato; si tomamos en
cuenta que la mayoría de enzimas tienen un tamaño entre 30 y 50 kD y que la masa
molecular media de la mayoría de sustratos oscila entre 0,2 y 0,4 kD, por la diferencia de
tamaños, la unión se da en un punto privilegiado de la proteína. Existen reacciones en
donde el sustrato es de mayor tamaño que la enzima por ejemplo las reacciones de
hidrólisis de proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos.
Para explicar la selección que hace la enzima para interactuar con su sustrato, el químico
Emil FISCHER en 1890 propuso el famoso modelo de “llave - cerradura” donde la llave
es el sustrato y la cerradura la enzima, esto implicaba la existencia de una
complementariedad de forma entre estos dos; esta propuesta era muy estática y no
explicaba apropiadamente la catálisis, tal como se la concibe en la actualidad. Muchos años
después, en 1958 Daniel KOSHLAND propone el modelo de encaje – inducido, el cual
supone que durante el proceso de unión, tanto la enzima como el sustrato sufren cambios
conformacionales los cuales en definitiva, explican la catálisis enzimática, ver figura 1.3.
Este también se conoce como modelo de guante – mano.
Iones con función de cofactor: Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mg2+, Mn2+ y Co3+.
Iones con función activadora o estabilizadora: normalmente son iones que pertenecen al
grupo de los elementos alcalino o alcalino térreos como el Na+, el K+, el Mg2+, el Ca2+, etc.
Los derivados de vitaminas hidrosolubles mas importantes que participan como cofactores
los podemos ver en la Tabla 1.1.
Pi NAD+
Gliceraldehido 3P Lactato
Deshidrogensa Deshidrogenasa
NADH + H+
Los zimógenos presentan un trozo de cadena peptídica adicional que cubre el centro activo
de la enzima, este pequeño péptido generalmente es retirado por otra enzima, en el
momento que debe actuar el catalizador. También las enzimas de la coagulación (factores
de coagulación) presentan zimógeno.
ISOENZIMAS: Son isómeros de una misma enzima, catalizan la misma reacción (la que
debe ser reversible), pero con distinta afinidad por la dirección de la misma. Las enzimas
que tienen isoenzimas son proteínas oligoméricas de cuya síntesis son responsables dos o
más genes, determinando muchos isómeros posibles cuyo número depende del número de
cadenas peptídicas que tenga la enzima. Lactato deshidrogenasa enzima de la glicólisis,
tiene cinco isoenzimas diferentes; cataliza la siguiente reacción:
Esta enzima tiene cuatro cadenas peptídicas y de su síntesis son responsables dos genes los
cuales son nominados como “M” y “H”, de tal suerte que pueden existir cinco isómeros
posibles: MMMM, MMMH, MMHH, MHHH y HHHH; el primero se distribuye en
músculo esquelético (M de “muscle”) y es activo para la reacción de derecha a izquierda, es
decir para la formación de lactato, en tanto que la última isoenzima se localiza en el
músculo cardiaco (H de “heart”) y tiene afinidad por la reacción de izquierda a derecha es
decir, para formar piruvato; los isómeros híbridos, se distribuyen de una manera muy
propia en los otros tejidos, dependiendo de la función de los mismos.
Asimismo, los patrones isoenzimáticos dentro de un mismo tejido pueden variar con el
desarrollo, así, durante la oogénesis de Telmatobius arequipensis, en los primeros estadíos
del oocito abunda la isoenzima H4 mientras que en los últimos la M4. Otro dato interesante
de este anfibio es que la actividad específica para LDH de los oocitos de los primeros
estadíos es mucho más alta que la de los últimos, indicando que al inicio hay una alta tasa
de glicólisis.
Otro ejemplo interesante es la enzima Creatinoquinasa (CK), la cual tiene dos cadenas
peptídicas y dos genes responsables de su síntesis: “M” de “muscle” y “B” de “brain”; las
isoenzimas que forman son tres: MM, BB y MB, la última se localiza específicamente en
corazón, razón por la cual la medida de su actividad en sangre es utilizada actualmente para
monitorear cualquier problema cardiaco.
NOMENCLATURA ENZIMÁTICA
CLASES DE ENZIMAS:
1. Oxidoreductasas
Son enzimas que catalizan reacciones de óxidoreducción, transfieren átomos de
hidrógeno o de oxígeno o electrones, de una molécula a otra; a este grupo pertenecen las
deshidrogenasas, enzimas que transfieren átomos de hidrógeno, las oxigenasas que
transfieren átomos de oxígeno, las oxidasas que transfieren electrones al oxígeno formando
agua o peróxido de hidrógeno, las peroxidasas que utilizan el peróxido de hidrógeno en
lugar del oxígeno como oxidante, la catalasa única enzima que usa el H2O2 a la vez como
oxidante y reductor, y los citocromos, los cuales transfieren electrones.
NAD+ NADH + H+
CH3 CH3
H – C – OH C=O
COO- COO-
2. Transferasas
Son enzimas que transfieren grupos funcionales de una molécula a otra; los grupos
transferidos más comunes son el amino, el acilo, el fosfato, el glucosilo y los grupos
monocarbonados. A este grupo pertenecen las transaminasas, transcetilasas, transacilasas,
quinasas, transglucosidasas, etc.; un ejemplo representativo es la transaminación de alanina:
Es importante aclarar que en las transferasas cada subclase tiene sus propias sub subclases.
Asimismo, para las fosfotransferasas, el tercer dígito corresponde al aceptor, debido a que
no puede precisarse más el grupo; así por ejemplo:
E.C.2.7.1 Fosfotransferasas con un grupo alcohólico como aceptor
E.C.2.7.2 Fosfotransferesas con un grupo carboxílico como aceptor
E.C.2.7.3 Fosfotransferasas con un grupo nitrogenado como aceptor
3. Hidrolasas
Son enzimas que rompen enlaces simples (C-O, C-N, P-O, P-N, C-P, C-C y C-S) utilizando
como segundo sustrato al agua, los átomos del solvente terminan formando parte de los
productos. Estas enzimas son generalmente exoenzimas es decir, enzimas que trabajan
fuera de la célula que las sintetiza y si no lo son, están encerradas en estructuras
subcelulares como los lisosomas, para evitar su acción contra la propia célula. Se las
nombra comúnmente colocando al nombre del sustrato sobre el que actúan la terminación
“asa”. Un ejemplo de hidrolasa son las proteasas cuya acción seria:
H2 O
R1-NH-CH-CO-NH-CH-CO-R2 R1-NH-CH-COOH + NH2-CH-CO-R2
R3 R4 R3 R4
El segundo dígito de estas enzimas corresponde al tipo de enlace hidrolizado, mientras que
el tercer dígito lo describe con mayor especificidad:
4. Liasas
Son enzimas que forman o rompen enlaces pero durante el proceso ocurre
necesariamente la formación o ruptura de un doble enlace; estas añaden o eliminan
unidades de agua, amoniaco o dióxido de carbono. A este grupo pertenecen las “sintasas”.
Como ejemplo tenemos a la enzima fumarato liasa, mal llamada “fumarasa”, que cataliza la
siguiente reacción del ciclo de Krebs:
COO- COO-
CH + H2 O HO-C-H
HC H-C-H
COO- COO-
Fumarato Malato
El segundo dígito en la clasificación de estas enzimas indica el tipo de enlace que se rompe,
así tenemos:
El tercer dígito indica el grupo que se elimina; por ejemplo, para las liasas de la subclase 1
tendremos:
5. Isomerasas
Este es un grupo muy heterogéneo de enzimas que catalizan reacciones de
isomerización de diversos tipos, dentro de las cuales encontramos interconversiones de cis
a trans, ceto a enol, aldosa a cetosa y la transferencia de cualquier grupo funcional dentro
de la misma molécula. Este tipo de reacciones son las únicas monosustrato y monoproducto
y lo característico de las mismas es que el sustrato y el producto tienen la misma fórmula
química global, es decir no hay ni pérdida ni ganancia de átomos al final de la reacción.
A este grupo pertenecen las epimerasas, racemasas y las mutasas. Una enzima
representativa de esta clase es la fosfoglicerato mutasa, enzima glicolítica que cataliza la
siguiente reacción:
COO- O- COO-
HC – O – P – O- ======= HC – OH O-
H2COH O CH2 – O – P – O-
O
2-fosfoglicerato 3-fosfoglicerato
El segundo dígito de esta clase indica el tipo de reacción y el tercero describe el tipo de
molécula que sufre la isomerización:
6. Ligasas
A este grupo pertenecen las enzimas que forman enlaces simples tipo C-C, C-S, C-O,
C-N, etc. Es decir, la unión covalente de dos moléculas; la característica de estas reacciones
es que requieren de la participación de una molécula de alta energía durante el proceso para
permitir la formación del enlace; lo que ocurre en realidad es que esta molécula energética
se une primero a uno de los sustratos activándolo, luego ocurre la ruptura de esta primera
unión, la cual libera suficiente energía que es utilizada para unir al segundo sustrato.
Usualmente es el ATP la molécula activadora, pero pueden participar también (con mucha
especificidad) otros compuestos como el GTP, CTP, UTP, NADH, etc. A estas enzimas se
les llama “sintetasas” o “sinteasas”; una representante de esta clase es la piruvato
carboxilasa:
ATP ADP + Pi
COO- COO-
C=O + HCO3- C=O
CH3 CH2
COO-
El tercer número del código en este caso indica el enlace que se ha formado, así:
E.C.6.3.1 ligasas ácido-amoniaco (amida sintetasas)
E.C.6.3.2 ligasas ácido-aminoácido (peptido sintetasas)
La cinética enzimática es la rama de la Enzimología que estudia los factores que afectan la
velocidad de las reacciones enzimáticas; los factores más importantes son: la concentración
de la enzima, la concentración de los ligandos (sustrato, producto, cofactor, coenzima,
activadores, inhibidores), el pH, la fuerza iónica y la temperatura. Conociendo bien estos
factores se puede deducir el mecanismo cinético de la reacción y brindar información sobre
la arquitectura del centro activo. Algunas constantes cinéticas nos permiten deducir sobre la
concentración intracelular de sustratos y productos y la dirección fisiológica de la reacción;
del mismo modo, sobre el mecanismo de regulación “in vivo” de la enzima, en otras
palabras, la Cinética nos dice como interactúan todos estos factores en un sistema para
afectar la velocidad de reacción.
VELOCIDAD INICIAL
Toda reacción que se inicie solo con los sustratos y se mida la aparición de producto a
través del tiempo, muestra la figura 3.1.
vo = P2 – P1
t2 –t1
Figura 3.1: Gráfica de la concentración de producto en función del tiempo en una reacción
química y determinación de la velocidad inicial (vo).
V0 V0 V0
Expresar la actividad de una muestra enzimática tiene por objeto averiguar cuanto de
enzima activa hay en esa muestra, debido a la inestabilidad que muestran estos
catalizadores, sobre todo cuando están en solución.En este sentido se han establecido varias
formas de expresar la velocidad inicial de la muestra que en este caso sería la velocidad
cuando toda las enzimas activas de la muestra, están trabajando (Velocidad máxima de
trabajo):
Katales: Es un múltiplo de “U” y vienen a ser los moles de sustrato transformados por una
muestra enzimática en un segundo, también en condiciones óptimas de pH y temperatura.
Actividad específica: Son las Unidades de actividad enzimática por miligramo de proteína
de una muestra; esto se aplica en procesos de purificación.
Nota: Es importante decir aquí que se puede obtener valores de velocidad inicial menores a
los de Velocidad máxima, esto se consigue utilizando concentraciones de sustrato bajas;
esto se hace cuando se desea determinar la KM por ejemplo.
CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS
a So
vo
So b
donde a y b son constantes; la constante “a” representa el valor máximo de v o (denominada
Vmx) y “b” es el valor de [So] donde vo = ½ Vmx.
Es importante señalar que aún cuando algunas enzimas no cumplen con esta relación
hiperbólica, la obtención de una velocidad inicial máxima con el aumento de la
concentración del sustrato, es una característica de todas las enzimas. Esto se explica
debido a que la enzima y el sustrato se combinan primero para formar un complejo enzima-
sustrato (esto fue demostrado experimentalmente por primera vez en 1936 mediante
estudios espectroscópicos), que luego se descompone para dar los productos y la enzima:
K K
E S
1 ES
2 E P
La velocidad global de la reacción está limitada por la cantidad de enzima disponible y por
la velocidad de descomposición del complejo ES, y será igual a k2 [ES].
ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN:
El comportamiento hiperbólico de las enzimas fue explicado a través de modelos cinéticos
primero por Victor Henri en 1903 y luego por los investigadores Leonor Michaelis y Maud
Menten en 1913; estos modelos eran esencialmente similares, pero Michaelis y Menten
desarrollaron mucho trabajo experimental que le dio mas solidez a su hipótesis y a
diferencia de Henri, reconocieron la importancia de utilizar velocidad inicial v0 en vez de
cualquier velocidad.
k1 k2
E + S ES E + P
k-1 k-2
k1 k2
E + S ===== ES E + P
k-1
Pero [E] en la fórmula se refiere a la enzima libre, la enzima disponible para unirse a S; por
lo tanto tenemos que hacer la especificación correspondiente:
v = k2 [ES]
v = [Eo] k2 [S]
kM + [S]
v0 = Vmx [S]
kM + [S]
Una vez que este complejo ha sido producido se mantiene en estado estacionario, es decir,
se disocia tan rápido como es formado, manteniéndose la [ES] constante (figura 3.4). El
estado estacionario se establece frecuentemente en algunos milisegundos después de
comenzada la reacción y se mantiene durante algunos minutos hasta que la concentración
de producto no se hace significativa como para invertir la reacción.
[ ] [ ]
P
S
E
ES
P
E
ESTADO ESTACIONARIO
ES
t' t'
Figura 3.4: Representación gráfica del curso de una reacción monosustrato donde la
concentración del sustrato es mucho mayor que la de la enzima.
Vo
Vmx
Vmx/2
KM [So]
Figura 3.5: Representación gráfica de v0 en función de [So], a [Eo] constante para una
reacción monosustrato, a partir de la ecuación de Michaelis-Menten. Vmx = Velocidad
máxima y KM = constante de Michaelis-Menten.
La Velocidad máxima tiene las mismas unidades que v0 y representa a la máxima eficiencia
catalítica de una muestra enzimática frente a un sustrato específico a pH y temperatura
adecuados.
Vmx
Kcat
Eo
IMPORTANCIA DE LA KM
Al hacer una determinación enzimática, hay enzimas que requieren cantidades pequeñas de
sustrato para alcanzar la Velocidad máxima mientras que otras por el contrario necesitan
grandes cantidades del mismo, esto quiere decir que no se utiliza una concentración de
sustrato arbitraria, está esta relacionada con la KM de la enzima ya que mientras mayor sea
este parámetro, se necesitará también de mas reactante. En este sentido, se ha establecido
en la práctica el usar concentraciones de sustrato iguales o mayores a 10KMs (a pesar que
de acuerdo a la ecuación de Michaelis-Menten cuando se tiene una concentración inicial de
sustrato de 100 KM, se alcanza el 99% de la velocidad máxima).
Nota: Otro criterio que se toma en cuenta también en una determinación enzimática es que
la cantidad de sustrato a utilizar debe ser lo suficientemente alta que durante el periodo de
incubación, no se consuma mas del 5% del mismo.
1 = [So] + KM
vo Vmx [So]
ordenando: 1 = [So] + KM
vo Vmx [So] Vmx [So]
1 = KM 1 + 1
vo Vmx [So] Vmx
esta ecuación es de la forma y = mx + a y representa una línea recta con pendiente positiva
que no pasa por el origen, figura 3.6.
1/vo
1 KM
m
Vmx Vmx
1
KM
1/[S]
Como puede verse, la recta corta al eje “y” (cuando 1/[S]= 0) en el punto 1/Vmx, un punto
que existe realmente, por lo tanto, el cálculo de Vmx se obtiene sacando la inversa del valor
de ese punto en la gráfica. Asimismo, la recta corta al eje “x” (cuando 1/vo = 0) en el punto
– 1/ KM con lo cual se puede calcular también este parámetro.
Estos modelos no serán explicados en este texto, pero pueden ser consultados
bibliográficamente por los alumnos interesados.
Por ser dentro de las multisustrato las más frecuentes y más sencillas se desarrollarán
a continuación. La mayoría de las reacciones de dos sustratos pueden incluirse en una de las
dos clases siguientes: reacciones de desplazamiento simple o secuenciales y reacciones de
doble desplazamiento o no secuenciales, las cuales pueden distinguirse por análisis
cinético.
4.2.1.1. Al Azar o random: En ellas, cualquiera de los dos sustratos puede ingresar
primero al centro activo de la enzima, lo cual se representa de la siguiente manera:
EA EQ
EB EP
E e EAB EPQ E
B A Q P
4.2.1.2. Ordenada: En ellas existe una secuencia obligatoria para el ingreso de los
sustratos, de modo que uno de los dos es el conductor y el otro es el acompañante:
A A B P Q Q
E EA EAB EPQ EQ E
Muchas deshidrogenasas que usan al NAD+ como coenzima se comportan de acuerdo a este
modelo, así por ejemplo la malato deshidrogenasa en donde el NAD+ debe unirse primero y
luego el malato. De acuerdo a la nomenclatura de Cleland este esquema es de tipo Bi bi
ordenado, pues también los productos salen en orden.
E EA FP F FB EQ E
Es importante hacer notar que en el esquema, se observa la letra “F”, esta corresponde a
una segunda forma enzimática, en este caso, la enzima aminada. Recordemos que de
acuerdo a la nomenclatura de Cleland, cuando existen varias formas enzimáticas durante la
catálisis, éstas se nominan como E, F, G, H, etc.; cada una de estas formas se supone que
son modificaciones covalentes de la enzima inicial.