UNIVERSIDAD NACIONAL

MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, Decana de América)

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

EAP. MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

PRÁCTICA #2:
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
Staphylococcus y Micrococcus
PROFESORA:
Blga. Jeanne Alba Luna
ALUMNAS:

Grupo 1 Mesa 1

2019
1) INTRODUCCIÓN
1.1 Staphylococcus sp

Staphylococcus aureus se destaca como un importante patógeno humano,

produce infecciones tanto en la comunidad como a nivel hospitalario. En la
comunidad, las infecciones por S. aureus son a menudo agudas, piogénicas y
superficiales, aunque también puede producir, con menor frecuencia, infecciones
profundas como osteomielitis, neumonía y endocarditis aguda. A nivel
nosocomial S. aureus es un importante agente de infecciones de herida
quirúrgica, de prótesis y otras. También S. aureus es causa de una serie de
infecciones producidas por toxinas como el síndrome del shock tóxico, la
intoxicación alimentaria y el síndrome de piel escaldada. Staphylococcus
epidermidis es integrante de la flora normal de piel pero produce infecciones
crecientes de piel y anexos, colonizando cuerpos extraños y también es causa
de infecciones profundas en huéspedes inmunocomprometidos. Staphylococcus
saprophyticus es causa de infección urinaria baja en la mujer joven.

Fig.1 Tinción de Gram coco positivo

No son exigentes con sus requerimientos nutricionales, son aerobios

facultativos y crecen favorablemente a temperaturas de 30-37°C, son capaces
de crecer en medios altamente salinos(7.5-10% NaCl).

 S. aureus, Flora normal de las narinas(fosas nasales), nasofaringe,

región perineal(en mujer en hombre) y piel. Puede colonizar diversas
superficies epiteliales y mucosas.
 S. saprophyticus, flora normal de la mucosa del aparato
genitourinario(en hombre y mujer).
 S. epidermidis, Flora normal de piel y mucosas humanas,
ampliamente distribuido sobre toda la superficie corporal.

S. aureus es la especie más virulenta del género que se conoce ya que

esta bacteria tiene un amplio espectro de factores que contribuyen para
producir infecciones y enfermedad.
 Algunas cepas de S. aureus pueden producir un pigmento carotenoide
que les da un color amarillo, el color es mas evidente en agares
nutritivos como agar sangre, agar chocolate, Agar infusión cerebro
corazón, agar nutritivo,entre otros.

Las cepas de S. aureus son productoras de coagulasa y beta -

hemolisinas (algunas cepas carecen de hemolisina).

Presenta factores de virulencia:

 Coagulasa: Coagula el plasma de la sangre.

 Hialuronidasa: Degrada el tejido conectivo.
 Staphylocinasa: Degrada coagulos de la san gre.
 Lipasa: Degrada grasas lo cual le ayuda a colonizar la piel.
 Penicilinasa: Inactiva la penicilina.
 Hemolisinas Alfa beta: lisa eritrocitos.
 Leucocidina: Lisa neutrofilos y macrofagos
 Enterotoxinas: Induce nausea vomito y dearrea , para inactivarlas se
necesita 100 gardos celcius 30min
 Toxina exfoliativa A y B: Causan descamacion de la piel.
 Toxina del síndrome del shok tóxico(TSST por sus siglas en ingles):
Induce fiebre, vómito, rash en la piel, daño en organos.
 Proteina A: Funciona como anticomplemento, antifagocitica, y lesiona
a las plaquetas.

1.2 Micrococcus sp
Micrococcus luteus es una bacteria que pertenece al grupo de las grampositivas.
Se encuentra formando parte de la microbiota de las superficies corporales de
los mamíferos, así como también de algunas áreas internas del organismo.
Generalmente el Micrococcus luteus es una bacteria no patógena. Sin embargo,
cuando se dan ciertas condiciones como inmunosupresión del individuo o el paso
de la bacteria al torrente sanguíneo, se pueden generar ciertas patologías.
La Micrococcus luteus es una bacteria que tiene forma esférica, con un diámetro
aproximado de 0,5 – 3,5 micras. Vistas al microscopio, generalmente se observa
que las bacterias se agrupan en tétradas . En su superficie no presentan ni cilios
ni flagelos.

Las colonias que se observan en los cultivos son circulares, lisas y convexas.
Pueden tener una superficie reluciente u opaca. Así mismo, manifiestan una
coloración amarilla o amarillenta verdosa.
 Fig.2 Tinción de Gram coco positivo,formación de tétradas .

La pared celular de estas bacterias tiene peptidoglicano, así como también

un polisacáridode cadena larga, conocido como ácido teichurónico (TUA). Este
compuesto tiene un rol importante en la protección de la bacteria, así como
también en la interacción de ésta con las células a las que infecta. Ese
polisacárido se encuentra unido a través de enlaces covalentes con el
peptidoglicano.La temperatura óptima de crecimiento aproximada de
la Micrococcus luteus es de 30°C, por lo que se consideran microorganismos
mesófilo

La Micrococcus luteus necesita obligatoriamente del oxígeno para poder llevar a

cabo sus procesos metabólicos. Debido a esto, necesariamente debe
encontrarse en ambientes en los que haya una gran disponibilidad de este
elemento químico. Esta bacteria ha sido aislada de un gran número de hábitats,
como el suelo, el agua, el aire y el polvo. Se ha demostrado que forma parte de
la flora bacteriana normal de la superficie corporal de los mamíferos.

Fig.3 (a) Micrococcus roseus , (b) Micrococcus luteus.

2) OBJETIVOS

 Aislar y diferenciar Micrococcus de Sthaphylococcus

 Comparar el comportamiento metabólico (fermentación,oxidación) de

Micrococcus y Staphylococcus mediante las pruebas bioquímicas ,asi
como la presencia de enzimas (catalasa, coagulasa).
3) PROCEDIMIENTO
3.1 Protocolo de aislamiento e identificación de Staphylococcus.
Materiales:
 Queso (de preferencia que esté al aire libre)
 Espátula de drigalsky
 Láminas y laminillas
 Mechero de bunsen
 Pipeta y propipeta
 Balanza

 Medios empleados

Agar manitol Agar Baird-Parker

salado

Agar sangre Agar nutritivo

Medio Hugh y
Agar DNAsa
leifson
 OBTENCIÓN Y AISLAMIENTO DE MUESTRA

1) Se pesó 1 Se agitó en el
gr de queso vortex

2) El gr de queso se 3) Se hicieron diluciones de

colocó en un tubo con 10−1, 10−2 y 10−3
10 ml de SS AL 85%

10−1 10−2 10−3

SELECCIÓN DE COLONIAS: pasadas

las 48 horas, se revisaron las placas en clase y se seleccionaron las mejores

4) Se colocó 1ml de muestra de la dilución 10−3 y se hechó en el agar

nutritivo, el mismo procedimiento se realizó para el agar manitol salado, agar
Bair-parker y agar sangre
5) se desaminó con la espátula de drigalsky adecuadamente en todas las
placas y se incubó por 48 hrs a 37 °C
 colonias de cada medio para hacerles tinción gram. En A. manitol salado se
escogieron colonias rosadas bien aisladas.

En A. sangre y A. nutritivo se escogieron las colonias blancas que estaban más

separadas

PRUEBAS DFIERENCIALES:

COAGULASA

a) La colonia seleccionada fue de Baird-parker. Esta colonia fue cultivada en

un tuvo con BHI.

Se echó en otro
tubo 0,1 ml +
0.3 de plasma

Se observó a la 4ta
BHI + muestra del hora y a la 6ta hora
agar Baird.parker para verificar si se
formaba o no un
coágulo

DNAsa

Con un asa de siembra

en aro se sembró en el
agar DNAsa

Se cogió una colonia

del medio Baird- Se incubó 48hrs a
parker 37 C°
O/F DE MANITOL y O/F DE GLUCOSA

Se seleccionaron las colonias rosaditas de manitol salado para staphylococcus

y del agar nutritivo para micrococcus

a) En un tubo con medio de Hugh y leifson más glucosa, se sembró

staphylococcus y se le agregó glycerina a cada tubo.

b) En un tubo con medio Hugh y leifson mas manitol, se sembró se sembró

staphylococcus sin glycerina.
Extra:

Prueba catalasa

a) Con un asa de siembra en aro se cogió un poco de las colonias

seleccionada de los medios (agar nutritivo, Bair.parker, agar sangre y agar
manito salado).

b) Se colocó en diferentes laminillas una gota de peróxido de sodio, más un

poco de las colonias escogidas.
3.2 Protocolo de aislamiento e identificación de Micrococcus.
Materiales:
 Muestra de hisopado faríngeo
 Tubo con solución isotónica (0.85%NaCl)
 Mango y asa de siembra de aro y punta.
 Láminas y laminillas
 Mechero de bunsen

 Medios empleados

Agar manitol Agar sangre

salado

Agar nutritivo Medio Hugh y

leifson
 OBTENCIÓN Y AISLAMIENTO DE MUESTRA

1) Se realizó hisopado 2) Se colocó el hisopo en un 3) Quitando el hisopo se

faríngeo de un alumno con tubo tapa rosca con 1mL de procedió a sacar un inóculo con
un hiposo estéril. solución isotónica (0.85%NaCl). el asa de siembra de aro.

Agar sangre Agar manitol Agar nutritivo

salado

3) Por último se estrió en tres diferentes medios de cultivo, por la cual se

incubo a 37°C por 48h.
 SELECCIÓN DE COLONIAS: Terminado la incubación se procedió a escoger las
mejores colonias aisladas, según resultados de la tabla 2 se tuvo que escoger tan
solo la colonia a del medio agar nutritivo para poder realizar la tinción Gram,
prueba catalasa y prueba Ox-Fer.

Colonia a

TINCION GRAM

1) Se sacó un inóculo del 2) el inoculó se expandió y diluyo 3) se dejó secar.

medio de la colonia a. homogéneamente en una gota de
solución salina en una lámina.

5) se enjuago y se colocó lugol por 1 minuto después

se decoloró con alcohol acetona y finalmente se
4) se colocó cristal violeta por 1
realizó la tinción de contraste con la safranina por 1
minuto en la muestra
minuto.
 Agar nutritivo

6) se observo en microscopio a
1000x con aceite de inmersión.

PRUEBAS DFIERENCIALES:

O/F DE MANITOL y O/F DE GLUCOSA

De la colonia a del medio agar nutritivo se realizó la inoculación del medio Hugh-
leifson mediante puntura
 2) Se inoculó en un tubo con 1) Se inoculó en un tubo con
medio de Hugh-leifson más medio de Hugh-leifson más
glucosa con glicerol. manitol sin glicerol.

Extra:

Prueba catalasa

Con el asa de siembra de aro se procedió a sacar un inóculo de la colonia a del

agar nutritivo y se colocó en la lamina con una gota de peróxido de hidrogeno.

4) RESULTADOS

Tabla 1. Resultados de los medios de cultivos para Sthaphylococcus

Medios de cultivo Observaciones

Agar manitol salado Se vieron colonias rosadas y otras de
color amarillo.

Hay especies de sthaphylococcus

que crecen en este medio, pero no
fermentan el manitol como es el caso
de S. epidermidis

El viraje de color de rosado a amarillo

ocurre debido a que algunas
bacterias si fermentan el manitol
haciendo que el indicador rojo de
fenol viré a amarillo

Ejmp: Staphylococcus aureus

 Agar sangre Se observaron colonias de color
blancas y otras de color cremas
pequeñas de 1 a 3 mm y planas.

Las colonias cremas pueden ser de

ese color debido a la producción de
carotenoides, también presentan un
halo transparente alrededor,
posiblemente sean de S.aureus ya
que presenta hemolisinas.

No se observa ningún tipo de

hemólisis en las colonias blancas
debido a que la bacteria aislada no
presenta hemolisinas que causen la
lisis de los hematíes

Ejmp: Staphylococcus epidermidis

Agar nutritivo Se observan colonias pequeñas de

color blanco, al ser un medio de
cultivo usado normalmente como
rutina para todo tipo de bacteria, es
difícil predecir el tipo de bacteria que
formó esas colonias

Agar Baird-parker Se observaron colonias negras

debido a que la bacteria aislada
reduce el telurito de potasio a telurio
de potasio; esto es característico del
genero Staphylococcus.

No se observó halo, debido a que

esta especie aislada no posse
lecitinasas.

Ejemplo: S.epidermidis
 Tabla 2. Resultados de los medios de cultivos para Micrococcus.
Medios de cultivo Lo que se debe observar
Agar manitol salado
Crecimiento de bacterias 0,5-
2,0um de diámetro.
Grandes, de color blanco a
anaranjado.
Agar sangre
Crecimiento de colonias de
color blanquecino.
No presenta hemolisis ya que
es una bacteria saprofítica
Lo que se observo
No se observó crecimiento
ni colonias aisladas en el
medio, puede deberse a
una mala práctica de
estriado.
Se observó un crecimiento
desigual en la placa además
pocas colonias aisladas con
hemolisis beta,
observándose halo
transparente.
Agar nutritivo

Crecimiento de colonias rojas, Se observó dos colonias

amarilla o incolora. amarillas también indicando
que hubo una mala práctica
de estriamiento.

Tabla 3. Resultados de las pruebas diferenciales para

Sthaphylococcus

Pruebas diferenciales Observaciones

DNAsa Se ven colonias pequeñas, en cuyo
alrededor hay halos tenues.
S,aureus presentan DNAsa
termoestables las cuales
despolimerizarán el ADN,
evidenciándose así un halo
transparente alrededor de las
colonias.
También podrían ser S. epidermidis
ya que esta también presentan
DNAsa no termoestables las cuales
se evidencian con un halo tenue en el
medio.
 coagulasa
No se observó ningún tipo de coágulo
con lo cual se descarta la posibilidad
que sea S.aureus; ya que este
presenta endonucleasas y
exonucleasas que provocan la
formación del coágulo porque
degradan el fibrinógeno.

O/F manitol y glucosa Staphylococcus:

*Glucosa + Glycerina: viró
ligeramente el medio de verde a
amarillo -> fermenta la glucosa en
presencia o en ausencia de oxígeno
*Manitol sin glycerina: en la parte
superior viro a color amarillo ->
fermenta el manitol

extra: catalasa Todas las colonias seleccionadas de

los 4 medios: a. manitol salado, a.
Baird-parker, a. sangre y a. nutritivo;
dieron positivo para catalasa porque
se observaron burbujas.
Esto se debe a que hay bacterias que
descompone el peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno. El
desprendimiento de burbujas
procedentes del oxígeno indica que
la prueba es positiva.
Tabla 4. Resultados de las pruebas diferenciales para Micrococcus

Prueba Según teoría Observaciones

diferencial
O/F manitol y
glucosa  En el tubo A sin variar el
medio ya que utilizan
azucares oxidativamente o
no lo hacen en absoluto,
son aerobios, no fermentan
la glucosa
anaeróbicamente.
 En el tubo B, oxidación en
la superficie y sin variar el
medio en la parte inferior.
A B
 Se observa en el tubo A
fermentación de la
glucosa en la parte
inferior y en la superficie
del medio.
 Se observa en el tubo B
oxidación en la superficie
y en la parte inferior del
medio no varió.

 Tubo A con
glicerol
 Tubo B sin
glicerol

EXTRA: Según teoría Observaciones

Catalasa

Es catalasa positiva. Se observa formación de

pequeñas burbujas por la
descomposición del
peróxido de hidrogeno
formando H2O y O2
 Tinción Gram en Sthafhylococcus

Para los 4 medios nos salió que eran cocos gram +

Se presentan en forma de cadenas cortas, pero la mayoría se asemeja aún
racimo de uvas

Agar nutritivo Agar Baird-parker

Agar sangre Agar manitol

salado
 Tinción Gram en Micrococcus
En la colonia a del agar nutritiva dio como resultado Gram +

Se observó colonias de cocos y tetradas.

Agar nutritivo
5) CONCLUSIONES

Prueba de la coagulasa:

Se utilizó para esta prueba la colonia aislada proveniente del medio Baird Parker
donde se había realizado el método de Gram y la prueba de la catalasa en donde
se obtuvo la certeza de estar frente a un Gram positivo.

A las 6 horas de inocular, el medio permanecía liquido (coagulasa negativa) es

decir el microorganismo no cuenta con la enzima coagulasa en donde existe dos
tipos de coagulasa:
Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor" que está unida a la
pared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la
formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana
con plasma citratado (test en lámina).
Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor
(CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el
fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).

Con este resultado se descarta la presencia de Staphylococcus aureus y se abre

la posibilidad de estar ante la presencia de Staphylococcus epidermitis
S.saprophyticus, S.cohnii subsp. cohnii, S.cohnii subsp. urealyticum, S.captitus s
ubsp. captitus, S.warneri, S.hominis, S.caprae.

Prueba de la catalasa:
Se realizó esta prueba con las colonias aislados de todos los medios, en todas las
pruebas salió catalasa positiva, los microorganismos cuentan con la catalasa una
enzima que es capaz de descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua
y oxígeno bajo la fórmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera las bacterias se
protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto final del metabolismo
aerobio de los azúcares.
Salió positivo en todas las pruebas de muestras presuntivas de Sthapylococcus y
Micrococcus.
Prueba de la DNA asa :
El resultado fue DNA asa positivo, formación de un halo transparente alrededor de las
colonias .
La colonia inoculada proviene del medio Baird Parker,donde se presume la presencia de
Staphylococcus aureus.
Los ácidos nucleicos presentes en el medio agar DNA asa son hidrolizados
enzimáticamente por medio de la enzima DNA asa, una endonuclesa que rompe enlaces
internucleotidicos del interior de la cadena.

Los organismos que degradan el ADN producen una zona transparente alrededor
del área de crecimiento.

Prueba de Hugh Leifson

En Staphylococcus sp:
Glucosa + Glycerina: viró ligeramente el medio de verde a amarillo -> fermenta
la glucosa en presencia o en ausencia de oxígeno.

Manitol sin glycerina: en la parte superior viro a color amarillo -> fermenta el
manitol.

En Micrococcus sp:
 Se observa en el tubo A fermentación de la glucosa en la parte inferior y en
la superficie del medio.
 Se observa en el tubo B oxidación en la superficie y en la parte inferior del
medio no varió.

No se puede llegar a una conclusión debido a que hubo una confusión al momento
de inocular,pero de acuerdo a la teoría Staphylococcus es capaz de fermentar el
manitol y Micrococcus oxidar la glucosa.El metabolismo de un glúcido puede
seguir la vía oxidativa o fermentativa. En vía oxidativa el aceptor final de electrones
debe ser el oxígeno y por consiguiente el proceso es aerobio y produce poca
acidez, mientras que en vía fermentativa el aceptor final de electrones es un
compuesto orgánico y el proceso es anaerobio, originando mucha acidez en poco
tiempo.

La fermentación u oxidación del glúcido se puede ver en dos tubos con medio de
cultivo glucosado, uno abierto (aerobio) y otro cerrado con parafina (anaerobio).
Si la vía es la oxidativa, solamente el tubo abierto virará ligeramente en la parte
superior a color amarillo. Si la vía es la fermentativa hay un viraje intenso a amarillo
que comienza en el fondo de los dos tubos.
Estudia la capacidad de los microorganismos para oxidar y/o fermentar la glucosa
produciendo ácido, que se detecta por la presencia de un indicador de pH (azul
de bromotimol), que vira de color verde a amarillo.
Agar sangre

En la muestra presuntiva de Staphylococcus sp:

Las colonias cremas pueden ser de ese color debido a la producción de

carotenoides, también presentan un halo transparente
alrededor,presuntivamente de S.aureus ya que presenta la enzima hemolisina,
beta hemolisis

No se observa ningún tipo de hemólisis en las colonias blancas debido a que la

bacteria aislada no presenta hemolisinas que causen la lisis de los globulos rojos.

En la muestra presuntiva de Micrococcus sp:

Se observó un crecimiento desigual en la placa además pocas colonias aisladas

con hemolisis beta, observándose halo transparente.

Agar nutritivo

Tanto en los medios presuntivos de Staphylococcus y Micrococcus se observan

colonias pequeñas de color blanco, al ser un medio de cultivo usado
normalmente como rutina para todo tipo de bacteria, es difícil predecir el tipo de
bacteria que formó esas colonias.

Agar manitol salado

El agar sal manitol contiene peptonas y extractos de carne bovina, que

suministran los nutrientes esenciales. El cloruro sódico de 7,5% tiene como
resultado una inhibición parcial o completa de los organismos bacterianos
diferentes de los estafilococos. La fermentación de manitol, indicada por el
cambio del indicador de rojo fenol, facilita la diferenciación de la especie de
estafilococos

Se observan dos tipos ,los que fermentan el manitol que es la fuente de

carbohidrato son los Staphylococcus aureus ya que al realizar la fermentación
existe una liberación de ácidos que acidifican el medio bajando el ph y se da el
cambio de viraje por el indicador rojo de fenol a amarillo.

En el caso de las colonias rosadas son aquellas que no fermentaron el manitol

como por ejemplo Staphylococcus epidermitis donde solo existe el crecimiento y
no hay cambio de color en el medio de cultivo.

Muestra presuntiva de Micrococcus sp

No se observó crecimiento ni colonias aisladas en el medio, puede deberse a

una mala práctica de estriado.
 Medio Baird Parker

Contiene las fuentes de carbono y nitrógeno necesarias para el crecimiento. La

glicina, el cloruro de litio y el telurito potásico actúan como agentes selectivos.
La yema de huevo constituye el sustrato para determinar la producción de
lecitinasa y, además, la actividad de lipasa. Las colonias de color de gris oscuro
a negro son debido a la reducción del telurito; los estafilococos que producen
lecitinasa descomponen la yema de huevo y crean zonas transparentes
alrededor de las colonias correspondientes.En este caso no se observo un halo
muy bien definido.

6) RECOMENDACIONES
 Se recomienda realizar de nuevo el método de hugh leifson al igual que
la prueba de la coagulasa para confirmar o eliminar algunas dudas con
respecto a la especie de Staphylococcus.
 Realizar una adecuada toma de muestra de la zona faringe.
 Rotular adecuadamente las colonias de las cuales se harán las pruebas
bioquímicas para evitar confusiones.
 Incrementar la comunicación en el grupo con la finalidad de establecer
orden sobre los procedimientos a realizar en clase.
 Trabajar con demasiado cuidado cuando se inocula para evitar
contaminación por aerosoles y/otros.
7) BIBLIOGRAFÍA
 Krikorian, A. D. (1991). Medios de cultivo: generalidades, composición y
preparación. Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y
aplicaciones. Cali: CIAT, 41-77.
 Cervantes-García, E., García-González, R., & Salazar-Schettino, P. M.
(2014). General
 L'USO, I. P., PIASTRA, T. S., & ALL'USO, P. R. O. N. T. I. BD Mannitol Salt Agar

 Lingyi Lynn Deng, Alice A. Alexander, Sijin Lei, and John S.

Anderson, “The Cell Wall Teichuronic Acid Synthetase (TUAS) Is an
Enzyme Complex Located in the Cytoplasmic Membrane
of Micrococcus luteus,” Biochemistry Research International, vol.
2010, Article ID 395758, 8 pages, 2010.