FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA DE HIDROLISADO DE

BAGAÇO DE CANA UTILIZANDO Saccharomyces cerevisiae

RECOMBINANTE IMOBILIZADA

PEREZ C1, SANDRI J P1, MESQUITA T J B1, MILESSI T1, GIORDANO R L C1,2
ZANGIROLAMI T C1,2

1Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Universidade Federal de São Carlos ,

2 Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal de São Carlos
E-mail para contato: lopesperezcaroline@gmail.com

RESUMO – O efeito de diferentes concentrações de etanol e da presença de inibidores sobre

a fermentação de xilose e glicose foi avaliado em experimentos conduzidos em meio complexo
(YPDX) e em hidrolisado de bagaço de cana de açúcar (HB). As células de levedura
recombinante foram imobilizadas em alginato de cálcio e o efeito protetor do alginato a
inibidores presentes no meio HB foi constatado. Por outro lado, a exposição a altas
concentrações de etanol por tempo prolongado causou a perda de viabilidade das células,
mesmo imobilizadas, a partir da segunda batelada repetida.

1. INTRODUÇÃO
Questões ambientais e sócio-econômicas aumentam a necessidade de substituição de
combustíveis fósseis por alternativas sustentáveis de geração de energia, como os biocombustíveis.
Nesse sentido, a produção sustentável de etanol a partir de resíduos linocelulósicos tem sido foco em
diversos estudos (SHARMA et al., 2017).
A conversão de compostos lignocelulósicos em açúcares, no entanto, apresenta alguns
obstáculos que ainda não foram contornados, como a estrutura complexa dos compostos, inibidores
produzidos durante a etapa de pré-tratamento da biomassa, utilização de pentoses na etapa de
fermentação e baixa resistência das leveduras às concentrações de etanol no caldo fermentado
(JONSSON e MARTÍN, 2016).
A habilidade para fermentação das pentoses presentes no hidrolisado ainda não é difundida
entre os organismos, ao passo que a fermentação de todos os açúcares liberados na hidrólise é
determinante para aumentar o rendimento do processo (CHAMNIPA et al., 2017). Graças aos
avanços em engenharia genética linhagens de S. cerevisiae capazes de assimilar pentoses e hexoses
vêm sendo desenvolvidas. Porém, as leveduras recombinantes apresentam baixa tolerância a etanol e
inibidores e baixa produtividade em etanol (MUSSATO et al., 2012).
A imobilização de células é uma técnica que oferece inúmeras vantagens, incluindo o reciclo
das células, recuperação mais econômica de produtos, operação em elevada densidade celular, alta
produtividade, resistência a inibidores e baixo risco de contaminação (TIAN, WANG e ZHAO,
2016).
 Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da imobilização sobre as
fermentações conduzidas em hidrolisado de bagaço de cana contendo inibidores e em meios de
cultivo suplementados ou não com etanol na concentração de 25g/L.

2. MATERIAIS E MÉTODOS
Os ensaios fermentativos foram realizados em micro-reatores de 5 mL dotados de saída para
CO2, contendo 1 mL do meio de cultivo desejado e 1mL de células de levedura geneticamente
modificada GSE16-T18 HAA1 (MEIJNEN et al., 2016), imobilizadas em gel de alginato, conforme
metodologia descrita por Milessi (2017). Os ensaios foram realizados utilizando hidrolisado de
bagaço de cana de açúcar concentrado obtido por hidrólise ácida, gentilmente cedido pelos
pesquisadores da Escola de Engenharia de Lorena/USP (ANTUNES et al., 2015). O hidrolisado foi
utilizado em sua forma bruta (HB), sendo submetido apenas a ajuste do pH até 5,6 e suplementação
com peptona (20 g/L), extrato de levedura (10 g/L) e CaCl2.(2 g/L). Um experimento de referência,
para comparação, foi realizado com meio YPDX contendo as mesmas concentrações de extrato de
levedura, peptona e CaCL2 adicionados ao hidrolisado, suplementado com glicose (9,5 g/L) e xilose
(63 g/L) na mesma concentração do hidrolisado. Para avaliar o efeito do etanol, foram utilizados os
meios HB e YPDX nas mesmas condições, porém suplementados com etanol na concentração de
25g/L. Desta forma, os resultados das fermentações em meios suplementados com etanol puderam
ser comparados aos resultados obtidos em meios não suplementados. Os ensaios foram realizados em
bateladas repetidas e interrompidos quando não houvesse mais mudança no perfil de da massa de CO2
produzido.
Ao final de cada fermentação, as células imobilizadas eram retidas no micro-reator,
enquanto o meio fermentado era removido e o novo meio de fermentação era adicionado, iniciando
um novo ciclo (batelada repetida). A quantificação de viabilidade celular foi realizada pela retirada
de uma alíquota de microcápsula a cada troca de meio, seguida por dissolução da mesma em acetato
de sódio, coloração com azul de metileno e contagem em câmara de Neubauer (MILESSI,
2017). As concentrações de glicose, xilose e etanol no sobrenadante recolhido foram
determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), utilizando o cromatógrafo
Waters e2695 com detectores de índice de refração e UV (MILESSI, 2017).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados após o primeiro e o terceiro ciclos fermentativos são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1: Concentrações finais de etanol, glicose e xilose (g/L) e viabilidades celulares (%) ao final
da primeira e da terceira batelada repetida.
Final primeiro ciclo Final último ciclo
YPDX YPDX+etOH HB HB+etOH YPDX YPDX+etOH HB HB+etOH
Etanol (g/L) 27,1 38,96 27,02 37,52 28,32 44,73 26,97 45,36
Glicose (g/L) 0 0 0,21 0,18 0 0 0,19 0,23
Xilose (g/L) 0 0 0,22 0,17 0 0 0,34 0,6
Viabilidade
98 95 99 98 17 11 15 13
(%)

Nota-se que em todos os meios, suplementados ou não com etanol, contendo ou não
hidrolisado, a totalidade dos açúcares foi consumida. As concentrações de etanol ao final das bateladas
foi semelhante para ambos os meios nas condições com e sem suplementação inicial de etanol,
indicando que os inibidores presentes no HB não interferiram no metabolismo fermentativo das
leveduras, possivelmente devido à ação protetora do gel de alginato.
Na Figura 1 estão representados os resultados da massa de CO2 liberado ao longo do tempo,
obtidos em cada batelada nos diferentes meios suplementados ou não com etanol (EtOH) na
concentração de 25 g/L. Nota-se que no primeiro ciclo o efeito do etanol não é observado, uma vez
que os resultados obtidos nos meios sem suplementação de etanol foram muito semelhantes aos
resultados obtidos nas fermentações com suplementação. A partir do segundo ciclo, no entanto, já é
possível notar o efeito da concentração de etanol no meio, uma vez que as perdas de massa nas
fermentações em meios contendo etanol foram bastante reduzidas. Já no terceiro ciclo, não se nota
mais mudança na inclinação do perfil de produção de CO2 dos meios com etanol, de maneira que se
encerrou o experimento e o efeito inibidor do etanol sobre as células foi visível.

Figura 1: Perdas de massa por fermentação em bateladas repetidas em meios suplementados ou não
com etanol
0,25
0,2
0,15 YPDX imobilizada
0,1 YPDX imob + etOH
∆m

0,05 HB imobilizada

0 HB imob + etOH
0 10 20 30 40 50 60
Tempo (h)

Outros autores já haviam notado os efeitos nocivos do etanol no meio fermentativo. Swinnen
et al. (2015), por exemplo, estudaram a tolerância da levedura S. cerevisiae ao etanol, e observaram
que a sensibilidade ao mesmo é influenciada pela disponibilidade de nutrientes, de forma que
limitações de determinados componentes no meio reacional podem diminuir a resistência das
leveduras ao etanol. Milessi (2017) identificou que a exposição prolongada das células de levedura a
determinadas concentrações de etanol pode causar queda irreversível de viabilidade celular, o que
possivelmente aconteceu na terceira batelada repetida nos meios suplementados com etanol, cuja
concentração atingiu cerca de 45 g/L nos meios testados e a viabilidade caiu para valores abaixo de
15%.
A produção de altas concentrações de etanol utilizando células da levedura GSE-T18 HAA1
imobilizada em gel de alginato de cálcio ainda precisa ser estudada, e aumentar a resistência da mesma
a altas concentrações de etanol é necessário para viabilizar industrialmente o processo. Por outro lado,
a levedura apresenta ótima resistência aos inibidores presentes no hidrolisado bruto, como fenóis e
furfural, uma característica interessante do ponto de vista de produção de bioetanol a partir de
hidrolisado ácido de bagaço de cana de açúcar.

4. CONCLUSÃO
O meio de cultivo composto por hidrolisado bruto, apesar de conter compostos inibitórios
para leveduras, apresentou resultados em produção de etanol muito semelhantes aos obtidos em meio
sem inibidores, ressaltando o efeito protetor do alginato de cálcio utilizado para a imobilização das
células a fenóis e furfurais, substâncias presentes no HB. Fermentações realizadas na presença de 25
g/L de etanol, primeira batelada, mostraram que o mesmo não afetou a viabilidade das células ou o
processo fermentativo em si, uma vez que as perdas de massa por liberação de CO2 em sistemas com
e sem adição de etanol foram muito semelhantes. Na segunda batelada repetida, no entanto, a
concentração de etanol passou a prejudicar a perda de massa do sistema e na terceira batelada a maior
parte das células já havia perdido sua viabilidade, bem como a curva de perda de massa atingiu o
platô, indicativo do efeito tóxico do etanol para as leveduras. É preciso encontrar alternativas para
produção de elevadas concentrações de etanol sem que a mesma afete a viabilidade das células de
levedura.

5. REFERÊNCIAS
ANTUNES FAF, SANTOS JC, CHANDEL AK, MILESSI TSS, PEREZ GF, da SILVA SS.
Hemicellulosic Ethanol Production by Immobilized Wild Brazilian Yeast Scheffersomyces shehatae
UFMG-HM 52.2: Effects of Cell Concentration and Stirring Rate. Curr. Microbiol., v. 72, n. 2, p.
133– 138, 2016
CHAMNIPA, N.; THANONKEO, S.; KLANRIT, P.; THANONKEO, P. The potential of the newly
isolated thermotolerant yeast Pichia kudriavzevii RZ8-1 for high-temperature ethanol production.
Biotechnol. Ind. Microbiol., 14p., 2017
JÖNSSON LJ; MARTÍN C. Pretreatment of lignocellulose: formation of inhibitory by-products and
strategies for minimizing their effects, Bioresour. Technol., 199, 103-112, 2016.
MEIJNEN J, RANDAZZO P, FOULQUIÉ-MORENO MR. Polygenic analysis and targeted
improvement of the complex trait of high acetic acid tolerance in the yeast Saccharomyces
cerevisiae. Biotechnol. Biofuels, v.9, p.5, 2016.
MILESSI TSS. Produção de etanol 2G a partir de hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar
utilizando Saccharomyces cerevisiae selvagem e geneticamente modificada imobilizadas. Tese
doutorado. PPG-EQ/UFSCar, 2017.
MUSSATO SI, MACHADO EMS, CARNEIRO LM, TEIXEIRA JA. Sugar metabolism and
ethanol production by different yeast strains from coffee industry wastes hydrolysates, Appl.
Energy, 92, 763–768, 2012.
SANTOS JC, MARTON J M, FELIPE MGA. Continuous System of Combined Columns of Ion
Exchange Resins and Activated Charcoal as a New Approach for the Removal of Toxics from Sugar
Cane Bagasse Hemicellulosic Hydrolysate. Ind. Eng. Chem. Res., v. 53, n. 42, p. 16494–16501, 2014.
SHARMA, N.K.; BEHERA, S.; ARORA, R.; KUMAR, S.; SANI, R.K. Xylose transport in yeast for
lignocellulosic ethanol production: Current status. J Biosci Bioeng, 2017.
SWINNEN S, GOOVAERTS A, SCHAERLAEKENS K, DUMORTIER F, VERDYCK P,
SOUVEREYNS K, ZEEBROECK GV, FOULQUIÉ-MORENO MR; THEVELEIN, J.M.
Auxotrophic Mutations reduce tolerance of Saccharomyces cerevisiae to very high levels of ethanol
stress. Eukaryot. Cell, v.14, 2015.
TIAN, S.Q.; WANG, X.W.; ZHAO, R.Y. Effect of doping pretreated corn stover conditions on
yield of bioethanol in immobilized cell systems. Renew Energy, v. 86, p.858–865, 2016.

6. AGRADECIMENTOS
Ao PPG-EQ/ UFSCar e às agências financiadoras CAPES, FAPESP (Processo FAPESP
2016/10.636-8) e CNPq (#409366/2016-1).