DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y PARÁMETROS DE LA ECUACIÓN DE

MICHAELIS-MENTEN (Vmax y Km).

Betancourt Núñez Luisa; Canchila Navarro Yaseth; Garcés Pérez Angie; García Argumedo José;
Vergara Cárcamo Álvaro; Universidad de Córdoba. Facultad de Ingenierías. Departamento de
Ingeniería de Alimentos. Programa de Ingeniería de Alimentos. Biotecnología. Berástegui-Córdoba-
Colombia. Orientador: ING. Deivis E. Lujan Renalhs
*Correspondencia de autores:yaseth94@gmail.com;luisita0220@hotmail.es;

RESUMEN
Este practica se realizo en el municipio de Berasategui en la sede de la universidad de córdoba
ubicad en el km 12 vía ciénaga de oro específicamente en el laboratorio de microbiología, practica
en la cual se realizo el montaje de un birreactor del cual se tomo cada 10 minutos muestras y se les
midió la absorbancia con el fin de determinar la concentración de maltosa, se evaluó el mejor
modelo para determinar los parámetros cinéticos de reacción con el fin de estudiar la actividad
enzimática de la amiloglucosidasa en la hidrólisis de la maltosa.
Palabras Claves: Enzima; Maltosa, DNS, amiloglucosidasa.

ABSTRACT
This practice was conducted in the municipality of Berasategui at the headquarters of the University
of Cordoba Conveniently situated at 12 km via slew of gold specifically in the microbiology laboratory
practice in which the assembly of a bioreactor which was done I was taken every 10 samples minutes
the absorbance was measured to determine the concentration of maltose, the best model was
evaluated to determine the kinetic reaction parameters in order to study the enzymatic activity of the
amyloglucosidase hydrolysis of maltose.
Keywords: Enzyme; Maltose, DNS, amyloglucosidas
 1. MATERIALES Y MÉTODOS: Determinación de la actividad enzimática y parámetros de la
ecuación de michaelis-menten (vmax y km), según Luján D., 2014.

2. RESULTADOS Y ANALISIS
Curva patrón.
Curva patrón
Concentraciones (ppm) absorbancia (575 nm)
0 0
200 0,
400 0,06
600 0,09
800 0,121
1000 0,144
Tabla #1: Muestra patrón.
La curva patrón se realiza con el fin de poder calcular la ecuación que relaciona la absorbancia
medida y la concentración para los cálculos posteriores, como es el de la concentración real que se
consigue al multiplicar por el factor de dilución 1/50 como se muestra en las (tabla 5).

absorvancia (575 nm)

0.2
y = 0.0002x - 0.0035
0.15
R² = 0.9918
Absrovancia

0.1 absorvancia (575 nm)

0.05
Linear (absorvancia
(575 nm) )
0
0 500 1000 1500
-0.05
Concentracion

Grafica #1: Modelo Curva Patrón.

 CONCENTRACIÓN DE 5 [ ].
Tiempo (min) Concentración (μmol/ml)
0 95,6711893
10 86,00743281
20 76,34367631
30 74,41092501
40 74,41092501
50 73,44454937
60 64,74716852
Tabla 1. # 2 Concentraciones Reales
 120
y = -0,9664x + 95,671
100 R² = 1

80

60

40

20

0
0.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000 70.000

CONCENTRACIÓN Series2 Linear (Series2)

Grafica #3: Concentración de 5%.

En la figura 3 se observa el comportamiento de la maltosa en el transcurrir del tiempo indicando el

desdoblamiento de esta por la acción de la enzima amiloglucosidasa en azucares más simples. De
esta grafica se obtuvo la velocidad inicial de reacción en este caso para la concentración de 5% fue
de 0,9664μmol de maltosa convertida / ml. Min la cual es la pendiente obtenida en la (grafica 3).

 Velocidades para las concentraciones de 5%,10%,15%, y 20%.

Tabla3. Velocidades Máximas de Reacción

Concentración (%) Vm
5 0,96637
10 0,2924
15 0,2120
20 0,19327

De manera gráfica se calcularon las Viniciales de la concentración en las que se trabajaron,

mostrando un comportamiento decreciente a media que aumenta la concentración, esto no
concuerda con lo descrito por Michaelis-Mentenen donde la velocidad de la reacción (representado
como V) aumenta linealmente con el aumento de la concentración sustrato la [S]. Estos resultados
se pudieron ver afectados ya sea por una calibración inadecuada del espectofotometro, o cálculos y
diluciones mal realizadas.
 CalculodeVmax, Km y R2 través de los modelos: Después de realizar el cálculo con los
modelos de LANGMUIR, EADIE- HOFSTEE, y EADIE LINEWEAVER-BURK, encontramos que
el modelo que mejor se ajusta es el de Eadie.Hofstee con un coeficiente de correlación de 0,999
y a partir de este se obtuvieron las constantes cinéticas de reacción que se observan en (la tabla
4).

EADIE - HOFTSTEE y = 0,0419x + 0,1581

R² = 0,9995
1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 5 10 15 20 25

Series1 Linear (Series1)

Grafica # 4 Modelo Eadie- Hoftstee

y = -27.517x + 6.4546
velcidad maxima R² = 0.9897
6
1 / V iniciales

velcidad maxima
4

2 Linear (velcidad
maxima)
0 Linear (velcidad
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 maxima)
1/ Concentracion

Grafica # 5. Modelo de Michaelis- Menten

En la figura 5 se muestra el comportamiento de la velocidades iniciales con respecto a las
concentraciones, mostrando un V máxima de 27,51 24-27 μmol de maltosa convertida / ml. Min.
Tabla 4. Constantes de Eadie–HoftsteeTabla 5. Velocidad Máxima(michaelis-M)

1/K 0,041 V max 27,51

Vmax/km 0,158 Km 6, 54
V max 24,3902439 R2 0,989
Km 3,85365854
R2 0,999

Al comparar el comportamientode los datos evaluados en primer lugar con la evaluación grafica de
los parámetros de la ecuación de michaelis-Menten (modelo de Eadie – Hoftstee) y luego con el
cálculo de las V inicial de cada concentración a la cual se trabajó (grafica 5), se observa que las
constantes cinéticas evaluadas son valores muy próximos (ver tablas 4 y 5) comprobando que la
velocidad máxima de la reacción es de 24 μmol de maltosa convertida / ml. Min y un Km que
corresponde a 4 μmol / ml que es la concentración del sustrato para la cual la velocidad de reacción
es la mitad del valor máximo. Los datos tomados son los del modelo de Eadie – Hoftstee debido a
que al compararlo con Michaelis-M el primero es el que mejor modelo el comportamiento de los
datos obtenidos en la práctica.
 Número de recambio de la enzima.

El número de recambio de la enzima (# moléculas de sustrato transformadas por unidad de tiempo por
molécula de enzima).

Datos y cálculos.

Volumen del biorreactor: 200 ml

Tiempo: 60 min
Cantidad de enzima: 0,5/12,5 =0,04 g
PM de Amiloglucosidasa: 76000 g/mol
Nº de moles de la Amiloglucosidasa = 5,26316E-07 moles
Moles de Maltosa transformada por ml Sln = 30,92402 μmol/ml
Moles totales de Maltosa Transformada = 0,006184804 moles
 𝑴𝒐𝒍é𝒄𝒖𝒍𝒂𝒔 𝒅𝒆 𝒔𝒖𝒔𝒕𝒓𝒂𝒕𝒐 𝒕𝒓𝒂𝒏𝒔𝒇𝒐𝒓𝒎𝒂𝒅𝒂𝒔
𝑹𝒆𝒄𝒂𝒎𝒃𝒊𝒐 =
(𝒕𝒊𝒆𝒎𝒑𝒐). (𝒎𝒐𝒍é𝒄𝒖𝒍𝒂 𝒅𝒆 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂)

Recambio = 195,8521316 mol Maltosa Transformada / min * mol enzima

Esto quiere decir que el número de moléculas de maltosa transformadas por unidad de tiempo (min)
por molécula de Amiloglucosidasa para una concentración de 5% de maltosa es 195,8521316 moles
de Maltosa Transformadas /min * mol enzima.

3. CONCLUSIONES
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos
estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la
especifidad de la enzima.
La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad por ende
en la práctica anterior se logro medir la actividad enzimática de una glucoamilasa fúngica (A.
niger)3, y los parámetros de Michaelis-Menten (Vmax y Km) en las diferentes condiciones de
reacción (Concentración de sustrato, Velocidad de agitación y temperatura), donde se obtuvo un
valor de KM de 3,85 que da idea de la afinidad del enzima por el sustrato y una velocidad máxima de
reacción de 24 μmol de maltosa convertida / ml. Min