Evaluación de Las Condiciones para Cuantificar Pesticidas en Agua Por La Técnica de HPLC Con Detector de Uv-Visible

REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
UNIVERSIDAD NACIONAL POLITÉCNICA

“ANTONIO JOSÉ DE SUCRE”
VICERRECTORADO “LUIS CABALLERO MEJÍAS”
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
EVALUACIÓN DE LAS CONDICIONES PARA

CUANTIFICAR PESTICIDAS EN AGUA POR LA
TÉCNICA DE
HPLC CON DETECTOR DE UV-VISIBLE
TRABAJO DE ASCENSO PRESENTADO ANTE EL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS

BÁSICAS COMO REQUISITO PARA OPTAR A LA CATEGORÍA DE PROFESOR
ASISTENTE
AUTOR: ESP. LEAL CARRASCO, BERNARDO ALFONSO

TUTOR: M. Sc. NOHENKIS PEÑA
CARACAS, 25 DE JULIO DE 2017

III
DEDICADO A:
Katya, Benrardo IV y Gael mi más grande inspiración
IV
AGRADECIMIENTO:
Al Laboratorio de Geoquímica Orgánica del Instituto de Ciencias de la Tierra (ICT)
de la Facultad de Ciencias de la UCV por el suministro de reactivos y equipos y al
proyecto 03-8738-2013 del Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico
(CDCH) por su financiamiento.
V
ÍNDICE GENERAL
Pag
LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................................VI
LISTA DE TABLAS.....................................................................................................................VII
RESUMEN..................................................................................................................................VIII
CAPITULO I....................................................................................................................................1
INTRODUCCIÓN.......................................................................................................................1
EL PROBLEMA..........................................................................................................................1
INTERROGANTES DE LA INVESTIGACIÓN........................................................................2
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN....................................................................................2
JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN............................................................................2
CAPITULO II...................................................................................................................................4
MARCO TEÓRICO.....................................................................................................................4
Uso de Aldrín, Dieldrín, DDT y Lindano en Venezuela.........................................................6
Presencia de Aldrín, Dieldrín, DDT y Lindano en Venezuela.................................................7
Extracción de plaguicidas........................................................................................................8
Métodos de análisis de los pesticidas....................................................................................12
Cuantificación de los plaguicidas..........................................................................................15
Desempeño de la cuantificación............................................................................................16
Antecedente de la investigación............................................................................................18
CAPITULO III...............................................................................................................................21
METODOLOGÍA......................................................................................................................21
Condiciones para el HPLC....................................................................................................21
Curva de calibración..............................................................................................................22
Extracción líquido-líquido.....................................................................................................23
Límite de detección y límite de cuantificación.....................................................................23
CAPITULO IV...............................................................................................................................25
RESULTADOS..........................................................................................................................25
Condiciones para el HPLC....................................................................................................25
Curva de calibración..............................................................................................................26
CAPITULO V.................................................................................................................................35
DISCUSIÓN DE RESULTADOS..............................................................................................35
HPLC-UV-visible para cuantificar Lindano, Dieldrín, 4,4'-DDT y Aldrín...........................35
Uso de la metodología para muestras naturales....................................................................37
CAPITULO VI...............................................................................................................................39
CONCLUSIONES.....................................................................................................................39
CAPITULO VII..............................................................................................................................40
RECOMENDACIONES............................................................................................................40
REFERENCIAS.............................................................................................................................41
VI
LISTA DE FIGURAS
Figura
1. Estructuras químicas de los pesticidas..........................................................................................6
2. Diagrama de solubilidad de solventes........................................................................................10
3. Esquema de HPLC......................................................................................................................13
4. Esquema de celda de absorción de radiación UV-visible...........................................................16
5. Curva de calibración...................................................................................................................17
6. Nivel de ruido pico a pico como base para el límite de detección.............................................18
7. Intervalo dinámico de un método analítico................................................................................19
8. Cromatograma de todos los pesticidas para longitud de onda 220 nm.......................................26
9. Espectro 3D de la absorbancia de los pesticidas en la región UV-visible..................................27
10. Curva de calibración del Lindano.............................................................................................29
11. Curva de calibración del Dieldrín.............................................................................................30
12. Curva de calibración del 4,4´-DDT..........................................................................................30
13. Curva de calibración del Aldrín................................................................................................31
VII
LISTA DE TABLAS
Tabla
1. Clase y propiedades de los pesticidas...........................................................................................6
2. Serie mixotrópica y algunas propiedades fisicoquímicas de solventes......................................12
3. Patrones concentrados de los pesticidas.....................................................................................25
4. Patrones diluidos de los pesticidas.............................................................................................25
5. Tiempos de retención y longitud de onda mayor absorbancia para cada pesticida....................27
6. Parámetros de mayor sensibilidad para cada longitud de onda..................................................27
7. Soluciones usadas para realizar la curva de calibración del Lindano.........................................28
8. Soluciones usadas para realizar la curva de calibración del Dieldrín.........................................28
9. Soluciones usadas para realizar la curva de calibración del 4,4´-DDT......................................28
10. Soluciones usadas para realizar la curva de calibración del Aldrín..........................................29
11. Ecuación de la recta y R2 para las curvas de calibración..........................................................31
12. Extracción a solución de 20 ppm de pesticidas (diluida).........................................................33
13. Extracción a solución de 20 ppm de pesticidas (sin diluir)......................................................33
14. Extracción a solución de 2 ppm de pesticidas..........................................................................33
15. Límites de detección y cuantificación para cada pesticida.......................................................34
VIII
REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD NACIONAL POLITÉCNICA
“ANTONIO JOSÉ DE SUCRE”
VICERRECTORADO “LUIS CABALLERO MEJÍAS”
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
EVALUACIÓN DE LAS CONDICIONES PARA CUANTIFICAR

PESTICIDAS EN AGUA POR LA TÉCNICA DE
HPLC CON DETECTOR DE UV-VISIBLE
AUTOR: ESP. LEAL CARRASCO, BERNARDO ALFONSO

TUTOR: M. Sc. NOHENKIS PEÑA
AÑO: 2017
RESUMEN
Se optimizó la técnica de cuantificación de los pesticidas organoclorados Dieldrín, 4,4'-

DDT y Aldrín por HPLC-UV-visible para muestras de agua obteniendo un LOD de 28, 39 y 28
ng/Kg respectivamente y un LOQ de 93, 131 y 95 ng/Kg respectivamente. Sin embargo, se
encontró alta variabilidad en las réplicas para concentraciones menores a 2000 ng/Kg. Las curvas
de calibración mostraron un R2 por encima de 0,995. El Lindano no pudo ser cuantificado en
estas condiciones. Los pesticidas fueron extraídos de una solución acuosa por medio de
extracción líquido-líquido con cloroformo, encontrándose porcentajes de extracción que fluctúan
entre 86 a 106%.
1
CAPITULO I
INTRODUCCIÓN
A partir de la década de los cuarenta del siglo pasado se comenzaron a usar extensamente
los pesticidas Lindano, 4,4’-DDT, Aldrín y Dieldrín, estos compuestos organoclorados son
resistentes a la degradación y se han convertido en contaminantes universales de aguas, suelos y
alimentos. Además, son lipofílicos, por lo que se acumulan en tejidos biológicos y como
consecuencia se magnifica su concentración en individuos que están arriba en la cadena
alimenticia (Moreno et al., 2006a; Chen et al., 2007).
Estos pesticidas organoclorados poseen alto potencial para causar daño a los seres
humanos y a otros organismos y son considerados entre altamente a moderadamente peligrosos
por la organización mundial de la salud (Ballesteros, 2007). En Venezuela se han identificado
estos pesticidas en muestras de: leche materna, calostro, agua de consumo humano, sangre
materna, sangre de neonato, hortalizas, plantas de arroz, pastos, suelos, peces, margarinas,
mantequillas, yogures y aceites vegetales vendidos comercialmente (Urdaneta et al., 1994;
Alvarado y Pérez, 1998; Gil, 2006; Gonzáles et al., 2007; Medina, 2008).
Para poder realizar estudios de estos compuestos, es importante cuantificarlos
eficientemente y con una adecuada sensibilidad, para ello es importante diseñar métodos de
cuantificación de probada efectividad. Sumado a esto, es recomendable que los resultados
analíticos sean confirmados por técnicas adicionales para disminuir la posibilidad de falsos
positivos (Barceló, 1993; Marrero et al., 2014).
EL PROBLEMA
No existe un método único para extraer de soluciones acuosas y cuantificar

simultáneamente los pesticidas Lindano, 4,4’-DDT, Aldrín y Dieldrín por medio de cromatografía
líquida de alta resolución con detector de UV-visible (HPLC-UV-visible). Es por ello que surgen
las siguientes interrogantes.
2
INTERROGANTES DE LA INVESTIGACIÓN
¿Es posible extraer eficientemente los pesticidas Lindano, 4,4’-DDT, Aldrín y Dieldrín de
soluciones acuosas usando cloroformo y la técnica de extracción líquido-líquido?
¿Cuáles son las mejores condiciones para separar y cuantificar los pesticidas Lindano,
4,4’-DDT, Aldrín y Dieldrín mediante la técnica de HPLC con detector de UV-visible con un
adecuado límite de detección y límite de cuantificación?
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
OBJETIVO GENERAL
Evaluar las condiciones para cuantificar los pesticidas organoclorados Lindano, 4,4’-
DDT, Aldrín y Dieldrín en agua, mediante la técnica de HPLC con detector de UV-visible.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Optimizar las condiciones de separación en HPLC con detector de UV-visible para una
cuantificación eficiente de los pesticidas Lindano, 4,4’-DDT, Aldrín y Dieldrín en agua.
2. Determinar la eficiencia de la extracción de los pesticidas Lindano, 4,4’-DDT, Aldrín y
Dieldrín en agua por la técnica de extracción líquido-líquido.
3. Determinar límites de detección y límites de cuantificación de los pesticidas Lindano,
4,4’-DDT, Aldrín y Dieldrín mediante HPLC con detector de UV-visible.
JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
Estos compuestos altamente tóxicos y nocivos para la salud están presentes en gran parte
del territorio venezolano, lo cual hace menester el optimizar la metodología de extracción y por
lo tanto nos motivo a determinar un método eficiente de extracción de estos compuestos en fases
3
acuosas para su posterior cuantificación por medio de la técnica de HPLC con detector de UV-
visible. No es suficiente con poseer los equipos analíticos necesarios para cuantificar, ya que se
debe diseñar un método que demuestre su eficiencia en la cuantificación de los pesticidas con la
adecuada sensibilidad (Marrero et al., 2014). Aunque las condiciones de análisis están reportadas
en varios artículos científicos estas deben ser optimizadas en cada equipo analítico ya que las
variables que lo afectan son únicas. Esta optimización se aplica al equipo de HPLC-UV-visibles
presente en el ICT-UCV.
4
CAPITULO II
MARCO TEÓRICO
Los pesticidas organoclorados son resistentes a la degradación, por lo que se han

convertido en contaminantes universales de aguas, suelos y alimentos (Chen et al., 2007), la
naturaleza lipofílica, el carácter hidrofóbico y la baja tasa de degradación biológica y química de
los pesticidas organoclorados han permitido que se acumulen en los tejidos biológicos y como
consecuencia se magnifica su concentración en individuos que están arriba en la cadena
alimenticia (Moreno et al., 2006a).
Este comportamiento de los pesticidas organoclorados ha ocasionado que el termino
“contaminantes orgánicos persistente” o “COP” se use para definir a estas y otras sustancias que
presentan las siguientes cuatro características:
1. Son persistentes: los COP son contaminantes químicos que resisten la degradación física,
química y biológica. Por lo tanto, una vez que un COP ingresa al medio ambiente
permanece allí durante un largo tiempo.
2. Son bioacumulativos: los COP son contaminantes químicos que se disuelven fácilmente
en las grasas (lipofílicos). Se acumulan en los tejidos corporales de los organismos
vivientes a concentraciones mucho más altas que las del medio ambiente circundante.
3. Pueden ser transportados a larga distancia: los COP son contaminantes químicos que
pueden viajar grandes distancias en el medio ambiente y causar una contaminación
peligrosa en lugares muy lejanos de aquellos en donde la sustancia química entró
originalmente al medio ambiente. Los COP son transportados a larga distancia por las
corrientes de aire principalmente, pero también pueden ser transportados por las
corrientes de agua o por las especies migratorias.
4. Tienen el potencial para causar efectos negativos: los COP son contaminantes químicos
con el potencial para causar daños a la salud humana y/o a los ecosistemas (Weinberg,
2009).
Los COP tienen el potencial para causar daño a los seres humanos y a otros organismos.
Se ha encontrado evidencia médica que vincula a las siguientes enfermedades y discapacidades
5
humanas con uno o más COP: cánceres y tumores, alteraciones neurológicas, supresión
inmunológica, alteraciones reproductivas, diabetes tipo II, endometriosis, hepatitis y cirrosis. Los
COP son especialmente dañinos para los lactantes, los niños, las mujeres y las personas
desnutridas. En los seres humanos y otros mamíferos los COP entran y contaminan al feto a
través de la matriz. Dado que la leche materna también contiene COP, los lactantes siguen
expuestos a estos compuestos durante el amamantamiento. En las especies no mamíferas, los
COP pasan de la madre a las crías a través de los huevos (Weinberg, 2009).
Con el fin de controlar y eliminar los COP en el 2001 se firma el Convenio de Estocolmo,
donde se incluyen 12 compuestos, en el 2009 se adicionan otros 9 compuestos al Convenio. El
Convenio de Estocolmo divide a los COP en tres listas (Anexos A, B y C), los compuestos
incluidos en la primera lista o Anexo A deben ser eliminados, los del Anexo B se debe restringir
su uso y a los del Anexo C se les debe aplicar medidas para reducir o eliminar la liberación
derivada de producción no intencionada. El Aldrín y el Dieldrín son dos plaguicidas incluidos en
el Anexo A a partir del 2001, el Lindano (γ-HCH) también se encuentra en el Anexo A y fue
incluido a partir del 2009; el DDT se encuentra en el Anexo B, ya que se restringe su uso para
controlar vectores de enfermedades (CECOP, 2009).
La Organización Mundial de la Salud (WHO, por sus siglas en inglés) recomienda
clasificar los pesticidas en función de su peligrosidad en cinco clases en base a los valores de
LD50 (LD50 es la cantidad de pesticida necesaria para causar la muerte de 50% de animales de
laboratorio, usualmente ratas, en una tanda de análisis), los cuales son: (Ia) extremadamente
peligroso (<5 mg/kg); (Ib) altamente peligroso (5 a 50 mg/kg); (II) moderadamente peligroso (50
a 500 mg/kg); (III) ligeramente peligroso (>500 mg/kg); y (III+) improbable de presentar
peligrosidad en uso normal (>2000 mg/kg), en la tabla 1 se puede observar los valores de LD 50 de
los pesticidas a utilizar y el tipo de peligrosidad al cual pertenecen (Ballesteros, 2007).
Aunque la solubilidad de los pesticidas Aldrín, Dieldrín, DDT y Lindano en agua es
bastante baja, tal y como se puede observar en la tabla 1, las diferentes matrices presentes en la
naturaleza permiten aumentar la solubilidad de estos pesticidas organoclorados. Muchos
compuestos orgánicos, entre los cuales están los pesticidas organoclorados son fuertemente
sorbidos a coloides como sedimentos suspendidos, minerales arcillosos y partículas orgánicas,
entre las cuales están: ácidos húmicos, fúlvicos y polisacáridos (Barceló y Hennion, 1997). En la
figura 1 se puede observar la estructura química del Aldrín, Dieldrín, 4,4´-DDT y Lindano.
6
Tabla 1. Clase y propiedades de los pesticidas. Tomado y modificado de Ballesteros, 2007.

Nombre LD50 (mg/Kg) en ratas Solubilidad en Agua (mg/L a 25 ºC) Clase
Aldrín 67 0,01-0,2 II
Dieldrín 40-87 0,186 (20 ºC) I-II
DDT 113-118 0,0077 (20 ºC) II
Lindano 88-270 7,3 II
B
A
C D
Figura 1. Estructuras químicas de los pesticidas: A Aldrín, B Dieldrín, C 4,4´-DDT y D Lindano.
Uso de Aldrín, Dieldrín, DDT y Lindano en Venezuela:

En Venezuela el Aldrín y Dieldrín se comenzaron a usar a mediados de los años 50 del
siglo pasado y se usaron hasta los años 80 cuando ya no se otorgaron más permisos de uso. El
DDT comenzó a ser usado en el tercer trimestre del año 1945 como insecticidas para mosquitos
en una campaña para combatir la malaria (Travieso, 2008) y se usó prácticamente en todo el país,
rociando las paredes de barro de las casas en un promedio de 1 g/m 2 cada seis meses (Berti et al.,
1953). Este insecticida continuó con uso legal bajo control del Ministerio de Salud y Desarrollo
Social y su uso está restringido a situaciones de epidemia con malaria. Después de descontinuar
su uso, el Aldrín, Dieldrín, DDT y otros plaguicidas estuvieron en depósitos sin vigilancia
durante muchos años en 4 poblados: Camatagua en el estado Aragua, Tocuyito en el estado
7
Carabobo y en el estado Trujillo primero en Valera y posteriormente en el Cenizo. No se ha

realizado ningún estudio de impacto ambiental en ninguno de los pueblos previamente
mencionados, ni en sus pobladores (Gil, 2006). El Dieldrín ha sido utilizado como insecticida
contra los triatomídeos, insectos transmisores de la enfermedad de Chagas, en 27 municipios de
los estados Aragua, Carabobo, Guárico y Miranda, se empleó desde 1950 hasta agotar las últimas
reservas en 1998 para el control de la enfermedad de Chagas (Aché et al., 2008).
El Lindano también fue usado como insecticida para controlar la enfermedad de Chagas,
entre los años 1958 a 1968. Por su bajo poder residual el uso de este insecticida se limitó a
ambientes peridomiciliarios, mientras que el Dieldrín se roció en el interior de domicilios, ya que
mostró resultados exitosos. Entre los años 1952 a 1998 se rociaron 1.113.945 Kg de una mezcla
de Dieldrín sólido dispersado en agua al 50%, mientras que en el periodo entre los años 1958 a
1968 se usaron 5.324 Kg de una mezcla de Lindano sólido dispersado en agua al 25% (Aché y
Matos, 2001; Feliciangeli, 2009).
Es de hacer notar que el uso de plaguicidas en la agricultura en Venezuela fue realizado
con muy pocas restricciones, una mala manipulación de los mismos y con un mínimo cuidado
ambiental. En Calabozo, estado Guárico se usaron una gran cantidad de biocidas para el cultivo
de arroz, entre los cuales tenemos el Aldrín, Dieldrín y DDT. En relación al manejo y uso de las
sustancias se observo: un uso indiscriminado de estos insecticidas, las sustancias eran preparadas
usando vestiduras corrientes y sin recurrir a ningún tipo de protección, acumulación de una gran
cantidad de envases vacíos esparcidos a los lados de la pista, la obstrucción de los canales de
riego por los envases vacíos, los cuales, incluso, eran utilizados por los obreros para lavarse las
manos, el consumo de alimentos en el lugar de preparación de mezclas, la disposición inadecuada
de los residuos, los cuales eran arrojados por los pilotos en cualquier parte de la zona
sobrevolada, incluyendo el área sudoeste de la ciudad de Calabozo (Alvarado y Pérez, 1998).
Presencia de Aldrín, Dieldrín, DDT y Lindano en Venezuela:

Investigaciones realizadas por la Universidad Central de Venezuela en la Facultad de
Agronomía han determinado presencia de Aldrín, Dieldrín, DDT y Lindano en: leche materna,
margarinas, mantequillas, agua de consumo humano, sangre y hortalizas en Quibor, estado Lara.
A su vez, también determinaron Aldrín, Dieldrín y DDT en el sistema de riego del estado Guárico
(Gil, 2006). En Calabozo se consiguió Dieldrín y DDT en muestras de: plantas de arroz, pastos,
8
suelos, calostro, leche materna, sangre materna y sangre de neonato (Alvarado y Pérez, 1998). En
poblaciones rurales de los estados Yaracuy y Cojedes se determinaron residuos de DDT en leche
materna en rango de 5,1 a 68,3 μg/L (Brunetto et al., 1996).
Por otro lado, Medina (2008) consiguió residuos de Aldrín, Dieldrín, DDT y Lindano en
yogures comerciales de diferentes marcas en el estado Zulia. También en el estado Zulia fueron
encontrados residuos de plaguicidas en 4 tipos de aceites vegetales vendidos comercialmente en
la ciudad de Maracaibo, los tipos de aceites analizados fueron de maíz, de soya, de girasol y
mezclas obteniendo concentraciones de hasta 0,008 μg/g de Aldrín, 0,0054 μg/g de Lindano,
0,0035 μg/g de DDT y 0,0002 μg/g de Dieldrín (Gonzáles et al., 2007). Uscátegui et al., (2011)
detectaron valores de 0,04 a 0,99 mg/Kg de DDT, 0,005 a 0,009 de Aldrín y 0,01 a 0,03 de
Dieldrín en suelos agrícolas del municipio Puebla Llano del estado Mérida.
Urdaneta (1989) realizó estudios a las aguas y a los sedimentos en lagunas utilizadas para
la piscicultura en el municipio Páez del estado Zulia, ya que se encontraron tumores neoplásticos
y benignos, así como necrosis hepática y renal en algunas especies de peces cultivados, y detectó
valores de 0,003 a 0,0027 mg/L de DDT, 0,0009 a 0,0098 de Aldrín, 0,0019 a 0,0215 de Dieldrín
y 0,0097 a 0,073 de Lindano en las aguas de las lagunas y valores de 0,0008 a 0,01 mg/Kg de
DDT, 0,0046 a 0,0327 de Aldrín, 0,0002 a 0,0225 de Dieldrín y 0,0150 a 0,1783 de Lindano en
los sedimentos de las lagunas, estos niveles de pesticidas son debido a que en la zona se realizan
intensas actividades agrícolas y pecuarias. Para complementar la investigación se analizó la
musculatura parietal de 14 especies de peces cultivados en esta zona detectándose valores de
DDTtotal (DDT + TDE + DDE) de hasta 1,3146 μg/g, de HCHtotal (α-HCH + β-HCH + γ-HCH
(Lindano)) de hasta 0,8973 μg/g y de Aldrín de hasta 0,1976 μg/g, la mayor concentración de los
pesticida se encontró en las especies de peces carnívoros (Urdaneta et al., 1994).
Extracción de plaguicidas:
Existen una gran cantidad de métodos con los cuales se extraen los pesticidas, sin
embargo, uno de los más usados en muestras de agua es la extracción líquido-líquido (LLE). Por
su simplicidad la extracción en fase sólida (SPE) y la microextracción en fase sólida (SPME) son
dos métodos de extracción que están ganando un gran auge. Otros métodos de extracción de
pesticidas en agua son: la microextracción en fase líquida (LPME), la extracción en fluidos
supercríticos, la extracción asistida por microonda (MAE), la extracción asistida por ultrasonido
9
(UAE) y extracción por líquido presurizado (PLE), la cual también es conocida como extracción
acelerada con solvente (ASE) o extracción con solvente presurizado (PSE) (Ballesteros, 2007;
Lehotay y Mastovska, 2005).
Sin embargo, la mayoría de estos métodos requieren de un equipo costoso, el cual no se
tiene disponible y en algunos de los métodos se requiere altas temperaturas y presión, por lo que
el DDT puede ser degradado (Manirakiza, et al., 2001). La aplicación de la extracción líquido-
líquido en agua, sangre y leche ha sido ampliamente aceptada como método estándar de análisis
de COP, ya que es simple, provee un alto grado de limpieza en la muestra y se obtiene una
extracción selectiva fácilmente si se elige el solvente adecuado (Cobzac y Gocan, 2011; Xu, et
al., 2013).
En la extracción líquido-líquido (LLE, por sus siglas en inglés) se tienen dos fases
líquidas, las cuales deben ser inmiscibles, usualmente una fase es acuosa mientras que la otra fase
es un solvente orgánico. Esta es una técnica ampliamente utilizada para la extracción de
pesticidas en muestras de agua, la selectividad de la LLE depende de la particularidad del
solvente utilizado y la naturaleza de la matriz en la muestra de agua. Sin embargo, hay otras
variables que se deben tomar en cuenta: pH, fuerza iónica, solubilidad, densidad, razón
agua:solvente, número de extracciones, tipo y concentración del analito. Los solventes más
comúnmente utilizados en LLE para pesticidas son: diclorometano, n-hexano y acetato de etilo;
en la figura 2 se puede apreciar un diagrama de solubilidad de solventes. Entre las desventajas de
LLE tenemos la posible formación de emulsiones, uso de solventes tóxicos e inflamables y la
gran cantidad de trabajo y tiempo que se debe emplear (Ballesteros, 2007; Wells, 2003).
La extracción de un componente X de una fase líquida A es llevada a cabo al poner en
contacto la solución de X con una segunda fase líquida B, la cual es inmiscible. Esto genera una
distribución del componente entre las dos fases inmiscibles, luego de que el analito se distribuya
entre las dos fases, el analito extraído es recuperado de la fase B por una extracción subsecuente
o por un proceso instrumental de análisis.
Por equilibrio químico se puede describir la distribución reversible de la siguiente manera,
XA XB
y la expresión para la constante de equilibrio, referida a la ley de distribución de Nernst es,
[ X ]B
KD=
[ X ]A
10
donde los corchetes denotan concentración de X en cada fase a temperatura constante (o

actividad de X en un sistema de soluciones no ideales). La constante de equilibrio K D viene
siendo un coeficiente de distribución.
Figura 2. Diagrama de solubilidad de solventes. Tomado y modificado de Ballesteros, 2007.
El factor de recuperación, Rx, es la fracción del analito extraído dividido por la

concentración total del analito, multiplicado por 100 para obtener un porcentaje de recuperación:
moles de analito extraído en el solvente orgánico
%R x = ×100
moles del analito en la muestra original
o si queremos expresarla en función del coeficiente de distribución queda:
100 K D
%R x =
K D +(V O /V E )
donde VO es el volumen original de la muestra y VE es el volumen del solvente extractor.
Diversas investigaciones han demostrado que:
• La cantidad total de analito extraído depende del valor del coeficiente de distribución.
11
• La cantidad total de analito extraído depende de la razón de volumen de las dos fases
utilizadas.
• Más analito es extraído con múltiples porciones del solvente extractor en comparación
con una porción de volumen equivalente de la fase extractora.
• El porcentaje de recuperación es independiente de la concentración de la muestra acuosa
original (Wells, 2003).
Para elegir adecuadamente el solvente a utilizar en LLE se debe tener en cuenta las
propiedades fisicoquímicas de la matriz, ya que dependiendo de esta servirá uno u otro solvente.
Entre los requerimientos que se deben tomar en cuenta para elegir el solvente están: alto factor de
separación, alta selectividad, no tendencia a formación de emulsiones, ausencia de reacciones
irreversibles entre el soluto y solvente, facilidad de recuperar las sustancias y rápida separación
de las fases (este último requerimiento necesita baja viscosidad, gran diferencia en densidades y
suficiente tensión superficial).
Como parámetro de comparación entre solventes se estableció la serie “mixotrópica”, de
la cual se obtiene información de miscibilidad y su uso en métodos de partición, mientras más
alejados estén ubicados un solvente de otro menor será su miscibilidad. En la tabla 2 se puede
observar un fragmento de la serie “mixotrópica” y algunas propiedades fisicoquímicas relevantes
de los solventes (Reichardt, 2003).
Un ejemplo donde usan LLE en pesticidas en agua es el de Al-Rimawi (2014), el cual
extrajo 100 ml de agua con n-hexano para Imidacloprid y β-Ciflutrin y diclorometano para
Abamectin, para todos realizó 3 extracciones sucesivas con 60 mL de solvente, concentró con el
rotavapor para luego añadir 1 mL de acetonitrilo e inyectar en HPLC-UV. Obtuvo recuperación
entre 97,6 a 101,5 % para los tres pesticidas y límites de detección entre 0,1 y 0,3 ppb. En el
método EPA 553 también usan LLE para pesticidas nitrogenados, extraen con cloruro de metileno
para a continuación concentrar en metanol e inyectar en el HPLC-MS, obteniendo una
recuperación entre 96 a 104 % y un límite de detección entre 4 a 30 μg/L.
También se realizan LLE con pequeños volumen de muestra y solvente, en el método EPA
501.2, se extraen trihalometanos de agua de consumo usando 10 mL de muestra y 2 mL de
solvente, como solventes se pueden usar: n-pentano, n-hexano, metilciclohexano o 2,2,4-
trimetilpentano. El método es útil en un rango de concentración entre 0,5 a 200 μg/L de
trihalometanos.
12
Tabla 2. Serie mixotrópica y algunas propiedades fisicoquímicas de solventes. Tomado y

modificado de Reichardt, 2003.
Nombre Punto de ebullición (°C) Densidad (g/ml) ETN
Agua 100,0 1,00 1,000
Acetonitrilo 81,6 0,786 0,460
Metanol 64,5 0,792 0,775
Etanol 78,3 0,789 0,654
Acetona 56,1 0,791 0,355
Diclorometano 39,6 1,33 0,309
Cloroformo 61,2 1,49 0,259
Benceno 80,1 0,879 0,111
Tolueno 110,6 0,867 0,099
Ciclohexano 80,8 0,779 0,006
n-hexano 68,7 0,655 0,009
N
ET = parámetro empírico de solubilidad del solvente
Métodos de análisis de los pesticidas:

Las concentraciones máximas permitidas para pesticidas en aguas superficiales,
subterráneas o de consumo son bastante bajas, pueden estar en el orden de 0,1 μg/L, por lo tanto
los métodos de análisis a utilizar deben ser lo bastante potentes para poder cuantificar los
pesticidas en estos ordenes de magnitud. Las técnicas más comúnmente utilizadas son la
cromatografía de gases (GC) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), en análisis de
residuos de pesticidas los procedimientos analíticos son frecuentemente divididos en grupos de
pesticidas que son más efectivamente analizados por GC o por HPLC. Otras técnicas usadas son
la cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) y la cromatografía de capa fina (TLC)
(Ballesteros, 2007; Lehotay y Mastovska, 2005).
La cromatografía de gases (GC) es la técnica de determinación de pesticidas en muestras
ambientales más ampliamente utilizada, la razón es debido a sus alta selectividad y resolución,
buena exactitud y precisión, amplio rango de concentración y una alta sensibilidad, además, en
comparación al HPLC se obtiene una mejor separación, generalmente posee menor límite de
detección y tiene mayor diversidad de detectores. Debido a esto, el HPLC usualmente estaba
focalizado en compuestos individuales o grupos de compuestos que no pueden ser analizados por
13
GC tales como los que poseen baja volatilidad, inestabilidad térmica y muy alta polaridad, sin
embargo, con los resientes desarrollos tecnológicos en detección y material de las columnas se ha
ampliado significativamente el campo de uso del HPLC (Ballesteros, 2007; Lehotay y
Mastovska, 2005).
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica cromatográfica donde la
fase móvil es líquida y es forzada a moverse a altas presiones, por encima de 400 atmósferas, lo
que hace a esta técnica sea mucho más rápida y eficiente que la cromatografía líquida donde la
fase móvil se mueve por gravedad. El movimiento de la fase móvil a alta presión permite que las
partículas con la cual se empaca la fase estacionaria sean mucho más pequeñas, lo que trae como
consecuencia una mayor interacción entre la fase estacionaria y las moléculas que pasan,
permitiendo así una mejor separación de los componentes.
En la figura 3 se puede apreciar un diagrama esquemático de un HPLC, donde podemos
apreciar los principales componentes de estos instrumentos (Skoog, et al., 2008):
Figura 3. Esquema de HPLC. Tomado y modificado de

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:HPLC_apparatus.svg.
1. Reservorios de solventes: envases donde se almacenan los diferentes solventes a utilizar.

2. Degasificador de solventes: los solventes no deben poseer presencia de gases.
3. Válvula de gradiente: realiza mezclas de solvente en la proporción deseada para el
análisis.
4. Envase de mezcla: envase donde ocurre la mezcla de solventes.
14
5. Bomba de alta presión: bomba que le proporciona la presión necesaria a los solventes.
6. Válvula de inyección: válvula que controla la inyección de la muestra, puede estar en dos
posiciones; posición de inyección donde la muestra entra en el sistema y posición de carga
donde solo hay paso de la fase móvil a la columna y la muestra de queda en el rizo de
inyección.
7. Rizo de inyección: tubos circulares de diferentes capacidades (generalmente de 1 a 100
μL) para almacenar la muestra hasta su inyección, permite medir la cantidad de muestra
que se inyectará.
8. Precolumna: envase con fase estacionaria similar a la columna con tamaño de partícula de
mayor, que elimina la materia en suspensión, los contaminantes de los solventes y los
componentes de la muestra que se unen de manera irreversible a la fase estacionaria.
9. Columna analítica: La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos miden de
5 a 25 cm de largo. Invariablemente se usan columnas rectas. El diámetro interior de las
columnas analíticas es a menudo de 3 a 5 mm; los tamaños de las partículas de los
rellenos más comunes son 3 o 5 μm. Las columnas que más se utilizan miden de 10 a 15
cm de longitud y 4,6 mm de diámetro interior y están rellenas con partículas de 5 μm.
Este tipo de columnas generan de 40000 a 70000 platos/metro (por lo regular, alrededor
de 10000 platos/columna).
10. Detector: Los detectores para cromatografía de líquidos son de dos tipos básicos. Los
detectores basados en una propiedad de la solución son sensibles a una propiedad de la
fase móvil, como el índice de refracción, la constante dieléctrica o la densidad, la cual es
modulada por la presencia de solutos. En cambio, los detectores basados en una propiedad
del soluto responden a alguna de las propiedades de este último, como la absorbancia en
el UV, fluorescencia o corriente de difusión, que no son inherentes a la fase móvil.
11. Recolección de data: la recolección de datos se realiza a través de computadores, en los
cuales se puede almacenar, visualizar y analizar los datos generados por el detector.
12. Desechos: envase donde se almacenan los residuos.
En cuanto a la detección el detector de UV ha sido el más ampliamente utilizado en la
determinación de pesticidas por HPLC, con un límite de detección de hasta 10 pg con un
intervalo lineal de 3 a 4 ordenes de magnitud. Como fuentes de la emisión en el espectro UV-
visible se tienen las lámparas de mercurio, las fuentes de deuterio o de filamento de tungsteno
15
que con la ayuda de filtros permiten operar en las longitudes de onda: 254, 250, 313, 334 y 365
nm.
Usando un detector con diodos en serie se puede obtener un espectro mediante un barrido
electrónico, por esta razón el detector de arreglo de diodos (DAD) es usualmente preferido, ya
que mejora la selectividad porque puede trabajar en todas las longitudes de ondas en el rango UV-
visible, al hacer un barrido de este sector del espectro en aproximadamente un segundo, por lo
tanto, tiene mayor aplicabilidad. El espectrómetro de masas (MS) es otro detector que se puede
usar para cuantificar y como confirmación de la identificación con un límite de detección
adecuado (Ballesteros, 2007; Lehotay y Mastovska, 2005; Skoog, et al., 2008).
Para realizar la detección de absorción en UV-visible se utiliza una celda de flujo en
forma de Z tal y como se muestra en la figura 4, donde se realiza las mediciones de absorción de
los efluentes en la columna cromatográfica. A fin de minimizar el ensanchamiento de banda
extracolumna, el volumen de dichas celdas tiene que ser el menor posible. Los volúmenes de la
celda representativa son de 1 a 10 μL y las longitudes de trayectoria de la celda son de 2 a 10 mm
(Skoog, et al., 2008).
Cuantificación de los plaguicidas:

Para lograr la cuantificación de los plaguicidas en una muestra es necesario realizar
primero una calibración, la cual nos permita determinar la relación entre la respuesta analítica del
instrumento para el análisis químico (en este caso HPLC-UV-visible) y la concentración del
analito. Existen varios métodos de calibración, sin embargo, uno de los métodos más utilizados es
el método de mínimos cuadrados con estándar externo para generar una curva de calibración.
La curva de calibración consiste en generar una gráfica usando estándares o patrones
externos, los cuales son analitos de concentración conocida que se analizan en condiciones
similares a la de la muestra problema, para luego con los datos obtenidos de la señal respuesta
(área del pico cromatográfico) en función de la concentración conocida del analito realizar una
gráfica que debe generar una ecuación matemática aceptable, como la ecuación de la línea recta
dada por la pendiente y la ordenada al origen que se usa en el método de los mínimos cuadrados
(Skoog, et al., 2008). Una vez obtenido la gráfica de calibración, se puede calcular la
concentración del analito por interpolación.
16
La relación matemática que representa esta suposición se llama modelo de regresión, y se

podría representar con:
y = mx + b
donde b es la ordenada al origen o intersección con el eje y, es decir, el valor de y cuando x es
cero, y m es la pendiente de la recta, la gráfica que se genera es similar al de la figura 5. La curva
de calibración se establece siempre con la respuesta del instrumento en el eje vertical (y) y la
concentración del patrón sobre el eje horizontal (x). Es importante incluir el valor de un blanco en
la curva de calibración, el blanco no contiene ningún analito adicionado deliberadamente, pero
contiene los mismos solventes, reactivos, etc. que los materiales de ensayo, y está sujeto
exactamente a la misma secuencia del procedimiento analítico (Miller y Miller, 2002; Skoog, et
al., 2008).
Figura 4. Esquema de celda de absorción de radiación UV-visible

para cromatografía de líquidos de alta resolución. Tomado de Skoog, et al., 2008.
Desempeño de la cuantificación:
Es importante evaluar el desempeño de los instrumentos en cuanto a la calidad de la
cuantificación, ya que todos los métodos instrumentales tienen un grado de ruido asociado con la
medición que limita la cantidad de analito que se puede detectar. El ruido se refleja en la
17
precisión de la réplica en el blanco o señal de fondo, y el ruido puede aparecer incluso cuando no
hay señal significativa de réplica en el blanco. Esto puede deberse a diversos factores que tienen
que ver con el funcionamiento del detector (Christian, 2009).
Figura 5. Curva de calibración. Tomado de Miller y Miller, 2002.
Para evaluar la capacidad de los detectores se usa el límite de detección (LOD, por sus
siglas en inglés), el cual se puede describir como aquella concentración del analito que
proporciona una señal en el instrumento significativamente diferente de la señal del blanco o
línea de fondo. Existen diferentes criterios para determinar el límite de detección, por ejemplo la
concentración que da dos veces el ruido pico a pico de una serie de mediciones de señal de fondo
(figura 6). Sin embargo, un límite de detección generalmente aceptado es el que se calcula a partir
de la mínima señal analítica distinguible (Sm), la cual se obtiene al sumar la media de la señal del
blanco (Sbl) más tres veces la desviación estándar del blanco (s bl), con esta fórmula se puede
calcular estadísticamente que el nivel de confianza en la detección será de un 95 % en la mayoría
de los casos (Miller y Miller, 2002; Skoog, et al., 2008; Christian, 2009):
Sm = Sbl + 3sbl
18
Figura 6. Nivel de ruido pico a pico como base para el límite de detección. Una señal de analito
“detectable” sería de 12 divisiones sobre una línea trazada a través del promedio de las
fluctuaciones de la línea base. Tomado de Christian, 2009.
Para calcular el LOD esta fórmula se sustituye en la ecuación de la recta generada en la

curva de calibración pero colocando como intercepto la media de la señal del blanco (S bl) y al
despejar nos queda (Skoog, et al., 2008):
S m−S bl
Límite de detección ( LOD)=
m
Otro criterio para evaluar la cuantificación es el intervalo dinámico del método analítico
(figura 7), el cual se extiende desde la concentración mínima a la cual se pueden efectuar
mediciones cuantitativas (límite de cuantificación, LOQ por sus siglas en inglés) hasta la
concentración a la cual la curva de calibración se desvía de la linealidad por una cantidad
especificada (límite de linealidad, LOL por sus siglas en inglés), este intervalo nos indica el
intervalo útil para la cuantificación analítica. En general, se considera que el límite inferior de las
medidas cuantitativas es igual a 10 veces la desviación estándar de las medidas repetitivas
realizadas sobre un blanco, es decir, 10sbl.
Mínima señal analítica cuantificable (SQ) = Sbl + 10sbl
Antecedente de la investigación:
Entre los antecedentes en que se ha trabajado con HPLC-UV para el DDT, Aldrín,
Dieldrín o Lindano tenemos:
• Chem, et al., 2007: realizó una extracción dinámica asistida con microondas acoplada a
extracción sólida en linea con HPLC (DAME-SPE-HPLC) para analizar o,p'-DDD, p,p'-
19
DDT, o,p'-DDT, p,p'-DDE, o,p'-DDE y pentacloronitrobenzeno, como solvente de

extracción se usó acetonitrilo al 95 %, la columna del HPLC fue C18 con fase móvil
acetonitrilo al 75 % a 1 mL/min, la longitud de onda del UV fue de 238 nm y se observó
linealidad entre 80 a 4000 ng/g y el límite de detección esta entre 19 a 37 ng/g. La
muestras fueron granos pulverizados de trigo, arroz, maíz y soya.
Figura 7. Intervalo dinámico de un método analítico. Tomado de Skoog, et al., 2008.
• Moreno, et al., 2006a: analizó 4,4'-DDD, 4,4'-DDT, 2,4'-DDT, 4,4'-DDE, Aldrín y

Dieldrín por extracción micelar asistida por microondas y HPLC-UV con columna de C18
a 30 °C, se inyectaron 30 μL, la fase móvil fue metanol-agua (85:15% v/v) isocrática con
un flujo de 1 mL/min. Para extraer se usó dos diferentes mezclas de surfactantes no-
iónicos: POLE y Polioxietileno 10 Cetil éter, POLE y Polioxietileno 10 Stearil éter. Se
obtuvo linealidad entre 100 a 1000 μg/L y los límites de detección estaban para los DDT y
sus metabolitos y entre 80 y 290 ng/g y para el Aldrín y el Dieldrín entre 590 y 800 ng/g.
Las longitudes de onda utilizadas fueron 238 para los DDT y sus metabolitos y 220 para
el Aldrín y el Dieldrín. Las muestras fueron suelos agrícolas.
• Moreno, et al., 2006b: analizó 4,4'-DDD, 4,4'-DDT, 2,4'-DDT, 4,4'-DDE y Dieldrín pero
en este caso a diferencia del anterior uso microextracción en fase sólida (SPME) para la
extracción, las otras variables fueron similares. El límite de detección se encontró entre 56
a 96 ng/g.
20
• Naidu, et al., 2016: analizó Lindano por HPLC-UV en una columna C18 usando como
fase móvil acetonitrilo-agua (50:50 v/v) isocrática con un flujo de 0,5 mL/min y 1
mL/min a una longitud de onda de 254 nm. Realizaron extracciones líquidas con n-
hexano, obteniendo recuperación ente 83 y 94 %, dependiendo de la muestra, las cuales
fueron heces, orina y suero de ratas.
21
CAPITULO III
METODOLOGÍA
Condiciones para el HPLC:

Se prepararon las soluciones madres de aproximadamente 6500 ppm (6500 mg/Kg) en
acetonitrilo para cada uno de los plaguicidas a trabajar: Lindano, 4,4'-DDT, Aldrín y Dieldrín. Se
usaron patrones de pesticidas marca Riedel-De Haën Ag ≥99% de pureza, el acetonitrilo usado
fue AnalaR 99,5% de pureza. Se propuso como objetivo trabajar solo con estos cuatro pesticidas
porque son contaminantes ampliamente difundidos en Venezuela y además debido a que solo se
cuenta con estos patrones en los laboratorios del ICT.
Estas soluciones se prepararon en viales de vidrio, los cuales se pesaron en una balanza
analítica, Mettler H51AR, de apreciación ±0,00001 g, luego se añadió y peso el acetonitrilo y por
último el pesticida. Después de pesar los viales se colocaron en el ultrasonido por 5 minutos para
disolver completamente los pesticidas. Los patrones se conservaron refrigerados hasta su uso.
A partir de las soluciones madres se realizaron diluciones de los pesticidas en acetonitrilo,
las cuales se prepararon en viales de vidrio, las concentraciones de estas diluciones fueron de
aproximadamente 1000 ppm, estas soluciones se utilizaron para fijar las condiciones de trabajo
del HPLC-UV-visible. Se usó un HPLC marca Angilent 1200 Infinity Series acoplado a un
detector de arreglo de diodos (DAD en sus siglas en inglés) Angilent 1200 Infinity Series, con
una columna de fase reversa Angilent Eclipse XDB-C18 (5 µm, 4,6*150mm).
Las primeras condiciones que se estudiaron fueron: la fase móvil y los tiempos de
retención en que aparecía cada pesticida. Se probaron tres (3) opciones para la fase móvil:
acetonitrilo:agua 50:50, acetonitrilo:agua 80:20 y acetonitrilo:agua 85:20. Para determinar el
tiempo de retención se inyectó un pesticida por vez para cada fase móvil.
Luego se analizó la longitud de onda del detector más adecuada para cada pesticida, al
revisar el espectro de 3 dimensiones aportado por el equipo, donde se puede comparar la
absorbancia de todo el barrido de longitudes de onda del rango del espectro UV-visible. La
longitud de onda de mayor absorbancia fue escogida para cada pesticida.
22
Después de determinar la longitud de onda más adecuada se optimizó los siguientes

parámetros del detector:
• Ancho de banda: define el rango de longitud de onda sobre el cual los valores de
absorbancia son promediado para obtener el resultado de cada punto en el tiempo.
• Longitud de onda de referencia: longitud de onda que se resta a la longitud de onda de
análisis para determinar la línea base.
• Ancho de banda de referencia: rango de longitud de onda sobre el cual los valores de
absorbancia son promediado para obtener el resultado de referencia.
• Ancho de pico: ancho de pico mínimo que es integrado por el equipo (Angilent
Technologies, 2013).
La optimización de estos parámetros se realizó inyectando un mismo patrón y variando
cada parámetro independientemente hasta encontrar la mayor sensibilidad para cada longitud de
onda. Por ultimo, se determinó el volumen de inyección de muestra en el HPLC más adecuado
para una cuantificación adecuada, se probaron dos loops de inyección: de 20 μL y de 50 μL. Para
esta prueba se diluyeron los pesticidas a concentraciones entre 0,15 a 1,5 ppm.
Curva de calibración:
Para realizar la curva de calibración se prepararon soluciones multipatrones de los cuatro
pesticidas a las siguientes concentraciones aproximadas para cada pesticidas: 0,15; 0,5; 1; 1,5; 3;
5; 10, 15, 35 y 60 ppm. Se prepararon en viales diluyendo con acetonitrilo, se colocaron todos los
pesticidas en cada solución para cuantificar los cuatro pesticidas a la vez.
Seguidamente se inyectó 50 μL de cada vial en el HPLC-UV-visible con acetonitrilo-agua
(85:15 v/v) como fase móvil a 1 mL/min. La inyección de cada solución se realizó por triplicado.
Se trabajó con las longitudes de ondas: 220 nm (Lindano, Aldrín y Dieldrín) y 238 nm (DDT). Se
inyectó 50 μL en el HPLC porque las soluciones de concentración menor a 1 ppm del Aldrín no
se detectaron cuando se inyectó 20 μL.
Luego para generar la curva de calibración se realizó la gráfica concentración vs. área del
cromatograma, se hizo una gráfica para cada pesticida. Con la línea recta generada de cada
gráfica se calculó la ecuación de la recta, esta ecuación se uso para calcular la concentración del
resultado de cada extracción a partir del área de los cromatogramas.
23
Extracción líquido-líquido:
Se prepararon 2 soluciones, a partir de la madre de 6500 ppm, de 50 mL de todos los
pesticidas en una mezcla agua:acetonitrilo (50:50 v/v), la primera solución de 2 ppm y la segunda
de 20 ppm aproximadamente para cada pesticida. Se utilizó una mezcla acetonitrilo:agua para
simular una matriz natural que puede ser capaz de disolver gran cantidad de pesticidas, lo que no
ocurre en agua pura (tabla 1).
De estas soluciones se tomó una alícuota de 10 mL, se pesó y se agregó en un embudo de
separación de 50 mL, para facilitar la extracción se agregó 0,05 g de KCl. La extracción líquido-
líquido se realizó con tres extracciones sucesivas usando 5 mL de cloroformo para cada una de
las extracciones, el cloroformo usado fue AnalaR 99,5% de pureza. El cloroformo fue recolectado
en un balón de 50 mL, se le agregó 0,5 g de Na 2SO4 anhidro para secar la muestra transvasándose
la solución a un vaso de precipitado donde se dejó evaporar el cloroformo a temperatura
ambiente. Una vez evaporado el solvente se arrastró los pesticidas a un vial (previamente pesado)
usando diclorometano. Este último solvente también se dejo evaporar para a continuación diluir
el residuo con 2 mL de acetonitrilo, de esta última solución se inyectó 50 μL en el HPLC-UV-
visible con una fase móvil de acetronitrilo:agua (85:15) a 1 mL/min. Se trabajó con las longitudes
de ondas: 220 nm (Lindano, Aldrín y Dieldrín) y 238 nm (DDT). Se repitió la extracción una vez
para cada muestra de agua, la inyección para cada extracción se realizó por triplicado.
Para el blanco se empleó 10 mL de la mezcla acetonitrilo:agua (50:50 v/v), a la cual se le
realizó la extracción líquido-líquido con cloroformo (3*5 mL), luego se dejó evaporar el
cloroformo, se arrastró el residuo con diclorometano a un vial y después de evaporarse este
último solvente se le añadió 2 mL de acetonitrilo para a continuación inyectar 50 μL en el HPLC-
UV-visible con las mismas condiciones de las extracciones de las soluciones acuosa problema. La
inyección del blanco en el cromatógrafo se realizó seis veces.
Para cuantificar los resultados de todas las extracciones y del blanco se usaron las
ecuaciones obtenidas de las curvas de calibración para cada pesticida.
Límite de detección y límite de cuantificación:

Se calculó de forma independiente el promedio y la desviación estándar de las señales del
blanco para cada pesticida (Sbl y sbl respectivamente), los resultados de estos cálculos se usaron
24
para determinar la mínima señal analítica distinguible (S m) y la mínima señal analítica

cuantificable (SQ) para cada uno de los pesticidas usando las siguientes formulas:
Sm = Sbl + 3sbl SQ = Sbl + 10sbl
A continuación se sustituyó Sm y SQ en cada una de las ecuaciones obtenidas a partir de las
curvas de calibración de cada pesticida pero colocando como intercepto la media de la señal del
blanco (Sbl) y al despejar nos quedó:
S m−Sbl SQ −Sbl
LOD= LOQ=
m m
25
CAPITULO IV
RESULTADOS
Condiciones para el HPLC:

Se prepararon los patrones concentrados de los pesticidas en viales, en los cuales se pesó
el acetonitrilo y luego el pesticida, los resultados de los pesos y las concentraciones se pueden
observar en la tabla 3.
Tabla 3. Patrones concentrados de los pesticidas

Nombre Pesticida (± 0,01 mg) Masa total (± 0,00000001 Kg) Concentración (mg/Kg)
Lindano 17,09 0,00273961 6238 ± 4
4,4’-DDT 19,72 0,00305631 6452 ± 3
Aldrín 20,64 0,00295143 6993 ± 3
Dieldrín 22,37 0,00331262 6753 ± 3
Lindano 2 8,35 0,00620010 1347 ± 2
A partir de estos patrones se prepararon patrones diluidos, los cuales se diluyeron con
acetonitrilo en otros viales, los resultados de los pesos y las concentraciones de los patrones
diluidos se pueden observar en la tabla 4.
Tabla 4. Patrones diluidos de los pesticidas

Nombre Pesticida (± 0,01 mg) Masa total (± 0,00000001Kg) Concentración (mg/Kg)
Lindano 2,32 0,00253146 917 ± 4
4,4’-DDT 2,45 0,00297538 825 ± 3
Aldrín 2,27 0,00239193 949 ± 4
Dieldrín 2,43 0,00215196 1128 ± 4
Con estos patrones diluidos se realizó la prueba de la fase móvil y determinación de

tiempos de retención de los pesticidas. La primera opción de fase móvil fue la mezcla
acetonitrilo:agua (50:50), la cual fue descartada porque los tiempos de retención de los pesticidas
26
no se mantenían constante al realizar repeticiones y se presentaba un gran ensanchamiento de los

picos cromatográficos.
La segunda opción de fase móvil fue la mezcla acetonitrilo:agua (80:20), en la cual si se
mantenían los tiempos de retención al realizar repeticiones. Sin embargo, el Aldrín, el cual es el
último compuesto en eluir en el cromatograma presentaba un gran ensanchamiento, de más de 1
minuto. Por lo tanto, se decidió aumentar el porcentaje de acetonitrilo en la fase móvil llegando a
la relación acetonitrilo:agua (85:15), con esta mezcla si se logró que los tiempos de retención se
mantuvieran al realizar repeticiones y que no se presentara ensanchamiento de los picos
cromatográficos (tabla 5), en la figura 8 se puede observar un cromatograma.
Figura 8. Cromatograma de todos los pesticidas para longitud de onda 220 nm
El gráfico 3D mostrado en la figura 9 se uso para determinar la longitud de onda con

mayor absorbancia para cada uno de los pesticidas en la región UV-visible del espectro
electromagnético (tabla 5). Para cada longitud de onda seleccionada se determinaron los
parámetros que mostraron mayor sensibilidad, los parámetros seleccionados para cada longitud
de onda se pueden observar en la tabla 6. En cuanto al volumen de inyección se decidió usar el
loop de inyección de 50 μL porque a concentraciones menores a 1 ppm el Aldrín no era
detectado.
Curva de calibración:
Cada solución usada para realizar la curva de calibración se inyectó por triplicado en el
HPLC-UV-visible, se promedió los tres resultados y se calculó la desviación estándar entre las
áreas obtenidas del cromatograma, en las tablas 7, 8, 9 y 10 se pueden observar los promedios de
27
las áreas obtenidas, la concentración respectiva para cada pesticida, la desviación estándar y el
porcentaje de variación de las áreas obtenidas con respecto al promedio, las soluciones que no
presentan desviación estándar es debido a que no se pudieron realizar repeticiones. En las figuras
10, 11, 12 y 13 se pueden observar las curvas de calibración generadas por estos datos, con la
ecuación de la recta y el valor de R2, las cuales se resumen en la tabla 11.
Tabla 5. Tiempos de retención y longitud de onda mayor absorbancia para cada pesticida
Pesticida Tiempo de retención (minutos) Longitud de onda (nm)
Lindano 3,7 220
Dieldrín 4,7 220
4,4’-DDT 6,5 238
Aldrín 10,3 220
Figura 9. Espectro 3D de la absorbancia de los pesticidas en la región UV-visible
Tabla 6. Parámetros de mayor sensibilidad para cada longitud de onda

Parámetros
Longitud de Ancho de Longitud de onda Ancho de banda de longitud Ancho de
onda (nm) banda (nm) de referencia de onda de referencia pico (min)
220 12 320 100 >0,1
380 8 360 100 >0,1
28
Tabla 7. Soluciones usadas para realizar la curva de calibración del Lindano

Concentración (± 0,01 ppm) Promedio área (mAU/s) Desviación estándar % desviación
0,16 56 2 2,7
0,92 267 44 16,5
7,49 391 - -
Tabla 8. Soluciones usadas para realizar la curva de calibración del Dieldrín

0,27 45 16 36,7
3,78 115 9 8,1
5,28 172 8 4,9
5,83 200 16 8,0
15,50 450 - -
50,71 1379 51 3,7
61,45 1841 74 4,0
Tabla 9. Soluciones usadas para realizar la curva de calibración del 4,4´-DDT

0,14 34 13 38,7
0,69 74 19 25,0
0,76 102 9 8,9
0,79 100 - -
1,95 172 20 11,6
3,11 289 21,32 7,4
3,27 290 - -
4,34 401 3 0,7
8,71 785 - -
34,53 3172 - -
41,70 3768 117 3,1
29
Tabla 10. Soluciones usadas para realizar la curva de calibración del Aldrín
Concentración (± 0,01ppm) Promedio área (mAU/s) Desviación estándar % desviación
0,34 3 3 39,8
0,60 11 13 60,3
1,70 26 24 45,7
4,57 89 6 3,6
7,72 151 - -
20,53 410 - -
43,90 1008 36 1,8
81,41 1821 69 1,9
Figura 10. Curva de calibración del Lindano
Para los pesticidas Dieldrín, 4,4'-DDT y Aldrín se obtienen unas muy buenas curvas de
calibración con R2 mayor a 0,995, lo que no sucede con el Lindano, por lo tanto se prepararon
nuevamente patrones diluidos para el Lindano a partir del patrón concentrado (tabla 3). Sin
embargo, nuevamente no se obtuvo reproducibilidad en los cromatogramas para el Lindano o no
fue detectado. En las dos primeras extracciones líquido-líquido (20 ppm) se obtuvo un
comportamiento similar para el Lindano.
30
Figura 11. Curva de calibración del Dieldrín
Figura 12. Curva de calibración del 4,4´-DDT
Este hecho se atribuyó en primera instancia a que la soluciones concentradas de Lindano

al estar almacenadas en la cava un largo tiempo sufrían una estratificación (la cual no se
apreciaba a simple vista), para corroborar esta teoría se inyectó en tres ocasiones el patrón diluido
del Lindano (917 ppm, tabla 4). La primera vez se inyectó el patrón sin agitarlo, la segunda vez
31
se agitó vigorosamente antes de inyectarlo y la tercera vez se sometió 5 minutos al ultrasonido

antes de inyectarlo. Obteniéndose las siguientes áreas cromatográficas: 290,22 mAU; 358,23
mAU y 376,03 mAU respectivamente.
Figura 13. Curva de calibración del Aldrín
Tabla 11. Ecuación de la recta y R2 para las curvas de calibración

Pesticida Ecuación de la recta de la curva de calibración R2
Lindano y = 35,317x + 137,095 0,7018
Dieldrín y = 28,486x + 20,013 0,9957
4,4’-DDT y = 90,586x + 11,861 0,9998
Aldrín y = 22,618x + 14,512 0,9991
Estos últimos resultados nos confirman que si se presenta una estratificación en el

Lindano, por lo que se tomó la decisión de preparar un segundo patrón concentrado para este
compuesto (tabla 3), el cual se usó para preparar nuevamente la curva de calibración y realizar las
dos últimas extracciones (2 ppm), tomando la precaución de pasar las soluciones por el
ultrasonido antes de usarlas. Sin embargo, no se obtuvo el resultado esperado, la curva de
calibración presentada para el Lindano posee las tres únicas soluciones que presentaban ciertos
valores lógicos.
32
En cuanto a la desviación entre repeticiones de cada solución aumenta el porcentaje de

desviación cuando la concentración de la solución es menor (tablas 8, 9 y 10), a medida que la
concentración de la solución aumenta el porcentaje de desviación disminuye, variando de
porcentaje de desviaciones de cerca del 40% para concentraciones de aproximadamente 0,15 ppm
a porcentaje de desviaciones de entre 2 y 4% para concentraciones de 50 ppm aproximadamente.
Se realizaron dos extracciones líquido-líquido, en la primera las concentraciones de los
pesticidas era de aproximadamente 20 ppm y en la segunda extracción era de 2 ppm, cada
extracción se realizó por duplicado. Las concentraciones de las soluciones resultante de la
extracción a la muestra de 20 ppm fue de más de 100 ppm por lo tanto se tomó la decisión de
diluir para que la concentración resultante quedara dentro de la curva de calibración. No hay
resultados de la extracción para el Lindano porque en algunas extracciones no se detectó y en las
que se detectó el área resultó ser muy baja y al usar la curva de calibración del Lindano se
obtuvieron concentraciones negativas, por lo que se descartaron los resultados.
En la tabla 12 se pueden observar los resultados de la extracción de las soluciones de 20
ppm que luego fueron diluidas, en esta tabla se observan las concentraciones iniciales de los
pesticidas antes de la extracción, las concentraciones calculadas a través de la curva de
calibración después de la extracción y el porcentaje de recuperación en la extracción. Para le
segunda repetición del Aldrín no se presenta resultado porque se obtuvo valores negativos de
concentración.
Debido a que en las curvas de calibración se obtuvieron desviaciones grandes entre
repeticiones cuando la concentración de los pesticidas fue baja, tal y como se presentan las
concentraciones en la tabla 12. Se tomó la decisión de analizar por el HPLC-UV-visible las
soluciones extraídas de la muestra de 20 ppm, en esta ocasión sin diluirlas, los resultados de esta
prueba se presentan en la tabla 13.
Las extracciones de las muestras de 2 ppm generaron soluciones entre 10 y 15 ppm, por lo
tanto no fue necesario diluir las soluciones y se inyectaron directamente en el equipo, los
resultados de esta extracción se muestran en la tabla 14. No se pudo correlacionar el porcentaje
de extracción con los pesos obtenidos porque parte del Na 2SO4 usado para secar el agua fue
transferido a los viales, afectando de esta manera el peso final.
33
Tabla 12. Extracción a solución de 20 ppm de pesticidas (diluida)

Repetición Dieldrín 4,4´-DDT Aldrín
Concentración inicial 1 1,95 1,89 1,60
(mg/Kg) 2 1,29 1,32 1,07
Concentración 1 5,90 2,04 0,89
experimental (mg/Kg) 2 6,41 1,79 -
1 302,13 107,49 55,50
% recuperación
2 497,26 135,33 -
Promedio del % recuperación 400 121 55,50
Desviación estándar 138 20 -
Tabla 13. Extracción a solución de 20 ppm de pesticidas (sin diluir)

Concentración inicial 1 168 163 138
(mg/Kg) 2 160 164 132
Concentración 1 173 162 136
experimental (mg/Kg) 2 169 170 132
1 103 99 98
% recuperación
2 106 104 100
Promedio del % recuperación 104 101 99,0
Desviación estándar 2 3 0,9
Tabla 14. Extracción a solución de 2 ppm de pesticidas

Concentración inicial 1 12,6 11,3 12,7
(mg/Kg) 2 12,8 11,4 12,8
Concentración 1 15,4 14,2 12,3
experimental (mg/Kg) 2 18,8 14,7 11,0
1 122 126 97
% recuperación
2 147 129 86
Promedio del % recuperación 134 128 91
Desviación estándar 17 2 8
34

Para calcular el límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ) para cada
pesticida se analizó a través del HPLC-UV-visible el blanco en seis ocasiones y se calculó: el
promedio de las señales del blanco (Sbl), la desviación estándar entre las señales (sbl), la mínima
señal analítica distinguible (Sm) y la mínima señal analítica cuantificable (S Q). Los resultados de
estas operaciones, LOD y LOQ están reportados en la tabla 15.
Tabla 15. Límites de detección y cuantificación para cada pesticida

Pesticida Sbl (mAU) sbl (mAU) Sm (mAU) SQ (mAU) LOD (mg/Kg) LOQ (mg/Kg)
Dieldrín 0,388 0,266 1,185 3,04 0,028 0,093
4,4'-DDT 0,629 1,187 4,191 12,50 0,039 0,131
Aldrín 0,202 0,215 0,846 2,35 0,028 0,095
35
CAPITULO V
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
HPLC-UV-visible para cuantificar Lindano, Dieldrín, 4,4'-DDT y Aldrín:

El HPLC-UV-visible demostró ser un equipo instrumental adecuado para cuantificar los
pesticidas Dieldrín, 4,4'-DDT y Aldrín, ya que se obtuvieron curvas de calibración con un buen
desempeño en cuanto a la linealidad, lo que se puede apreciar en los valores de R2 (tabla 11).
Sin embargo, la reproducibilidad no es buena cuando se disminuye mucho la
concentración de los analitos, ya que se observan porcentajes de desviaciones de las réplicas de
hasta un 40% (tablas 8, 9 y 10). Para evitar esta alta variabilidad se debe inyectar en el equipo 50
µL de 4,4'-DDT con concentraciones mayores a 1 ppm y para el Dieldrín y Aldrín
concentraciones mayores a 2 ppm.
La velocidad de la fase móvil en el HPLC es controlada por altas presiones, para un flujo
de 1 mL/min la presión del sistema es de 40 bar, ligeras variaciones de presión en el sistema
ocasionan fluctuaciones en las áreas del cromatograma, tal y como se observa en el
cromatograma de la figura 8 donde el primer pico corresponde a una variación de presión al
permitir pasar la muestra a la columna, otro motivo para variación de presión del sistema son las
burbujas generadas en el solvente por disolución y exsolución de gases. Es por esta razón que el
HPLC-UV-visible muestra poca reproducibilidad a concentraciones bajas, ya que ligeras
variaciones de presiones generan pequeñas distorsiones y ensanchamiento de las áreas que
afectan cuando las concentraciones son bajas porque estas producen áreas pequeñas.
Para concentraciones altas el HPLC-UV-visible no presenta problemas de
reproducibilidad y mantiene una buena linealidad por lo menos hasta valores de concentraciones
cercanas a los 150 mg/Kg, las extracciones de las soluciones de 20 ppm (no diluida) mostraron
una adecuada cuantificación de la solución extraída (tabla 13), no importando el hecho de que ha
estas concentraciones las áreas de las mismas no están interpoladas en la curva de calibración.
A diferencia de los otros pesticidas estudiados el Lindano no presenta buena
reproducibilidad ni linealidad al realizar la curva de calibración del mismo (figura 10). Se
observó que, con el tiempo de almacenamiento en la cava, los patrones concentrados de Lindano
36
se estratificaban y al agitar o pasar por ultrasonido el área reportada por el equipo aumenta, sin
embargo, este no es la única complicación mostrada por el Lindano, ya que a partir de ese
momento se pasaron los patrones por el ultrasonido antes de utilizarlos y no hubo mejoras en la
reproducibilidad y linealidad de la detección.
No se logró determinar con precisión que causa que el Lindano muestre este
comportamiento, sin embargo, se cree que hay dos posibles causas y futuras investigaciones
podrán determinarlo.
Una de estas posibles causas es la solubilidad del Lindano en acetonitrilo, es posible que
la solubilidad del Lindano en acetonitrilo no sea alta y al realizar los patrones y pasarlo por el
ultrasonido el tamaño de grano del pesticida disminuya a tamaño no visible (coloide) pero no
estén completamente en solución, por esta razón con el tiempo y temperaturas bajas se
estraficaría y al agitar o pasarlo por ultrasonido nuevamente se dispersaría y por eso aumenta el
área detectada por el equipo. Sin embargo, de los cuatro pesticidas usados el Lindano es el más
soluble en agua (tabla 1) y al tener el menor tiempo de retención implica que es retenido en
menor grado por la fase estacionaria (C18), esto significa que es el que tiene mayor carácter polar
por lo que debería ser más soluble en acetonitrilo.
La otra posible causa es que el Lindano interactué de alguna manera con el acetonitrilo
transformándose posiblemente a uno o varios de sus isómeros (α-HCH y β-HCH), la diferencia
entre el Lindano y sus dos isómeros es la orientación espacial de los Cl. Si esto sucede el área que
reportará el equipo para el Lindano disminuirá y aparecerán dos picos más o si el equipo no es
capaz de separarlos eficientemente aumentará la línea base en la región cercana al Lindano.
Basheer et al. (2005) reporta que el α-HCH eluye antes que el Lindano mientras que el β-HCH
eluye después para una columna DB-5 en un cromatógrafo de gases.
En el presente estudio el Dieldrín eluye inmediatamente después del Lindano (figura 8,
tabla 5), además de los tres pesticidas cuantificados el Dieldrín mostró el R 2 mas bajo (0,9958) y
en las extracciones de las soluciones de 2 ppm el Dieldrín y el 4,4´-DDT reportaron porcentajes
de recuperación mayor al 100% (tabla 14). Estos resultados pudieran estar indicando que una
fracción del Lindano se transformó en alguno de sus isómeros y está coeluyendo con el Dieldrín
en algunas de las soluciones usadas para la curva de calibración afectando de esta manera la
curva de calibración del Dieldrín.
37
Lo mismo pudo suceder para la extracción de la solución de 2 ppm pero esta vez con el
Dieldrín y el 4,4´-DDT, el cual eluye inmediatamente después del Dieldrín (figura 8, tabla 5), el
porcentaje de extracción de la muestra posiblemente solo se afecto para las soluciones de 2 ppm
porque esta solución fue preparado después de la prueba de estratificación del Lindano y por lo
tanto, se paso por el ultrasonido el patrón 2 del Lindano (tabla 3) antes de ser utilizado.
La extracción de la solución de 20 ppm (diluida) mostró mucha diferencia con las
concentraciones iniciales (tabla 12), este hecho puede ser debido a la baja concentración de las
muestras que como ya se mencionó, ocasiona una gran variabilidad de las mediciones.
La extracción de la solución de 20 ppm (no diluida) y la extracción de la solución de 2
ppm (tabla 13 y 14) muestra un porcentaje de extracción muy cercano a 100%, lo que nos indica
que la extracción líquido-líquido de cloroformo a los pesticidas diluidos en una mezcla
acetonitrilo:agua (50:50 v/v) es altamente eficiente.

Los cálculos de límite de detección y límite de cuantificación son cálculos estadísticos
basados en la línea base del cromatograma (blanco) y aunque se usan las curvas de calibración
para relacionar el área con la concentración, la magnitud del área depende exclusivamente del
funcionamiento del detector. Por lo tanto, aunque se reportan límites de detección y
cuantificación bastante bajos para todos los pesticidas (tabla 15), en la práctica aunque se pueda
detectar y cuantificar los pesticidas a estas concentraciones, ya se demostró que estos resultados
no son reproducibles.
Uso de la metodología para muestras naturales:

Debido al buen desempeño en cuanto a la linealidad de las curva de calibración (tabla 11)
de los pesticidas Dieldrín, 4,4'-DDT y Aldrín obtenidas a partir del HPLC-UV-visible es bastante
factible usar este equipo para cuantificar pesticidas en muestras naturales. Sin embargo, hay que
acotar que la variabilidad de la determinación del equipo por debajo de 1 ppm para el 4,4´-DDT y
de 2 ppm para el Dieldrín y el Aldrín es muy alta, por lo tanto se debe trabajar por encima de
38
estas concentraciones. Este hecho implica que esta metodología se puede usar en muestras
naturales siempre que se puedan concentrar a estas concentraciones.
A través de la extracción líquido-líquido de 10 mL de muestra se aumento
aproximadamente un (1) orden de magnitud la concentración de los pesticidas, de 20 a 160 ppm y
de 2 a 12 ppm (tablas 13 y 14 respectivamente). Por lo tanto, si se usa 1 L de muestra se podrá
concentrar tres (3) ordenes de magnitud, esto implica que se podrán trabajar con muestras
naturales con concentraciones iniciales de 0,001 ppm para el 4,4´-DDT y 0,002 ppm para el
Aldrín y Dieldrín (1 ppb y 2 ppb respectivamente).
Como consecuencia a la necesidad de concentrar las muestras para usar el HPLC-UV-
visible para cuantificar los pesticidas Dieldrín, 4,4'-DDT y Aldrín, queda descartada el posible
uso de este equipo para muestras humanas, ya que los valores que se han conseguido del DDT en
leche materna está en un rango de 0,0051 a 0,0683 ppm (Brunetto et al., 1996), lo que significa
que se necesitaría entre 0,1 a 1 L de leche materna, cantidad que no es posible conseguir. Para
otras muestras naturales como: aguas, suelos y alimentos si se puede manejar cantidades mayores
de muestra.
De ser necesario concentrar mucho la muestra es recomendable aplicar otra técnica de
extracción más amigable con el ambiente, como la extracción en fase sólida, porque una
extracción líquido-líquido de 1 L de muestra requiere 1,5 L de cloroformo si se usa la misma
proporción.
39
CAPITULO VI
CONCLUSIONES
• El 4,4'-DDT puede ser cuantificado eficientemente por el HPLC-UV-visible desde

concentraciones de 1 ppm a 160 ppm.
• Se obtuvo un LOD para el 4,4'-DDT de 39 ng/Kg y un LOQ de 131 ng/Kg.
• Se observó alta variabilidad entre réplicas para concentraciones menores a 1 mg/Kg.
• El Dieldrín y Aldrín puede ser cuantificado eficientemente por el HPLC-UV-visible desde
concentraciones de 2 ppm a 140 ppm.
• Se obtuvo un LOD para el Dieldrín y Aldrín de 28 ng/Kg y un LOQ de 93 ng/Kg y 95
ng/Kg respectivamente.
• Se observó alta variabilidad entre réplicas para concentraciones menores a 2 mg/Kg.
• El Lindano no puede ser cuantificado eficientemente por el HPLC-UV-visible con las
condiciones experimentales usadas en este trabajo.
• Se pueden extraer los pesticidas Dieldrín, 4,4'-DDT y Aldrín de soluciones acuosas
mediante extracción líquido-líquido con cloroformo, con porcentaje de extracción entre
86 al 106%.
40
CAPITULO VII
RECOMENDACIONES
• Se puede probar el comportamiento del Lindano en el HPLC con otro solvente como fase
móvil y comparar con los resultados obtenidos con la mezcla acetonitrilo:agua (85:15).
• Probar la estabilidad en el tiempo de las soluciones con el Lindano al inyectar la misma
solución por un periodo de tiempo definido.
• Tratar de conseguir los patrones de los isómeros del Lindano para determinar su tiempo
de retención en el HPLC-UV-visible.
• Para evitar burbujas en los solventes a utilizar en el HPLC-UV-visible pasar los solventes
por el ultrasonido antes de trabajar con ellos.
• De ser posible pasar por el ultrasonido las muestras a inyectar en el HPLC-UV-visible.
• Realizar las inyecciones en el HPLC-UV-visible lo más cercano posible en el tiempo para
evitar diferencias en las condiciones de trabajo, en especial con la presión del sistema.
• No usar el Na2SO4 como desecante para evitar que afecte el peso de los viales y así
comparar la eficiencia de extracción con los pesos antes y después de la extracción, ya
que si se deja a la intemperie el agua también se evaporará.
• Inyectar las muestras que se les va a realizar la extracción en el HPLC-UV-visible para
tener otra forma de determinar la eficiencia de extracción.
41
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Evaluación de Las Condiciones para Cuantificar Pesticidas en Agua Por La Técnica de HPLC Con Detector de Uv-Visible

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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD NACIONAL POLITÉCNICA

EVALUACIÓN DE LAS CONDICIONES PARA

TRABAJO DE ASCENSO PRESENTADO ANTE EL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS

AUTOR: ESP. LEAL CARRASCO, BERNARDO ALFONSO

CARACAS, 25 DE JULIO DE 2017

REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

EVALUACIÓN DE LAS CONDICIONES PARA CUANTIFICAR

AUTOR: ESP. LEAL CARRASCO, BERNARDO ALFONSO

Se optimizó la técnica de cuantificación de los pesticidas organoclorados Dieldrín, 4,4'-

No existe un método único para extraer de soluciones acuosas y cuantificar

Los pesticidas organoclorados son resistentes a la degradación, por lo que se han

Tabla 1. Clase y propiedades de los pesticidas. Tomado y modificado de Ballesteros, 2007.

Uso de Aldrín, Dieldrín, DDT y Lindano en Venezuela:

Carabobo y en el estado Trujillo primero en Valera y posteriormente en el Cenizo. No se ha

Presencia de Aldrín, Dieldrín, DDT y Lindano en Venezuela:

donde los corchetes denotan concentración de X en cada fase a temperatura constante (o

Figura 2. Diagrama de solubilidad de solventes. Tomado y modificado de Ballesteros, 2007.

El factor de recuperación, Rx, es la fracción del analito extraído dividido por la

Tabla 2. Serie mixotrópica y algunas propiedades fisicoquímicas de solventes. Tomado y

Métodos de análisis de los pesticidas:

Figura 3. Esquema de HPLC. Tomado y modificado de

1. Reservorios de solventes: envases donde se almacenan los diferentes solventes a utilizar.

Cuantificación de los plaguicidas:

La relación matemática que representa esta suposición se llama modelo de regresión, y se

Figura 4. Esquema de celda de absorción de radiación UV-visible

Figura 5. Curva de calibración. Tomado de Miller y Miller, 2002.

Para calcular el LOD esta fórmula se sustituye en la ecuación de la recta generada en la

DDT, o,p'-DDT, p,p'-DDE, o,p'-DDE y pentacloronitrobenzeno, como solvente de

Figura 7. Intervalo dinámico de un método analítico. Tomado de Skoog, et al., 2008.

• Moreno, et al., 2006a: analizó 4,4'-DDD, 4,4'-DDT, 2,4'-DDT, 4,4'-DDE, Aldrín y

Condiciones para el HPLC:

Después de determinar la longitud de onda más adecuada se optimizó los siguientes

Límite de detección y límite de cuantificación:

para determinar la mínima señal analítica distinguible (S m) y la mínima señal analítica

Condiciones para el HPLC:

Tabla 3. Patrones concentrados de los pesticidas

Tabla 4. Patrones diluidos de los pesticidas

Con estos patrones diluidos se realizó la prueba de la fase móvil y determinación de

no se mantenían constante al realizar repeticiones y se presentaba un gran ensanchamiento de los

Figura 8. Cromatograma de todos los pesticidas para longitud de onda 220 nm

El gráfico 3D mostrado en la figura 9 se uso para determinar la longitud de onda con

Figura 9. Espectro 3D de la absorbancia de los pesticidas en la región UV-visible

Tabla 6. Parámetros de mayor sensibilidad para cada longitud de onda

Tabla 7. Soluciones usadas para realizar la curva de calibración del Lindano

Tabla 8. Soluciones usadas para realizar la curva de calibración del Dieldrín

Tabla 9. Soluciones usadas para realizar la curva de calibración del 4,4´-DDT

Figura 10. Curva de calibración del Lindano

Figura 11. Curva de calibración del Dieldrín

Figura 12. Curva de calibración del 4,4´-DDT

Este hecho se atribuyó en primera instancia a que la soluciones concentradas de Lindano

se agitó vigorosamente antes de inyectarlo y la tercera vez se sometió 5 minutos al ultrasonido

Figura 13. Curva de calibración del Aldrín

Tabla 11. Ecuación de la recta y R2 para las curvas de calibración

Estos últimos resultados nos confirman que si se presenta una estratificación en el

En cuanto a la desviación entre repeticiones de cada solución aumenta el porcentaje de

Tabla 12. Extracción a solución de 20 ppm de pesticidas (diluida)

Tabla 13. Extracción a solución de 20 ppm de pesticidas (sin diluir)

Tabla 14. Extracción a solución de 2 ppm de pesticidas

Límite de detección y límite de cuantificación:

Tabla 15. Límites de detección y cuantificación para cada pesticida

HPLC-UV-visible para cuantificar Lindano, Dieldrín, 4,4'-DDT y Aldrín:

Límite de detección y límite de cuantificación: