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51992
Investigación______________________________________________ Rev Med Vet Zoot. 62(2), mayo - agosto 2015: 23-39
H. Jurado-Gámez∗1, M. Gúzman-Insuasty2
Artículo rebicido: 27 de noviembre de 2014. Aprobado: 14 de abril de 2015
RESUMEN
Se determinó cinética, pruebas de crecimiento y efecto de inhibición in vitro de L.
casei sobre S. aureus, S. epidermidis, S. agalactiae y E. coli. Se usaron cepas comerciales
y cepas aisladas de muestras de leche con mastitis subclínica (Vereda La Victoria, Pasto,
Colombia). Se evaluó el efecto de los antibióticos Dicloxacilina, Cefepima, Cefalotina,
Ciprofloxacina, Gentamicina, Penicilina, Trimetropim Sulfa y Ampicilina, así como la
inhibición de L. casei y su sobrenadante sobre las bacterias patógenas. El crecimiento de
L. casei se evaluó a diferentes condiciones gastrointestinales y su cinética de crecimiento.
Se determinaron péptidos y ácidos orgánicos en el sobrenadante (HPLC). L. casei fue
susceptible a la Ciprofloxacina y Ampicilina, mientras que S. aureus comercial mostró
susceptibilidad a los antibióticos, lo mismo se observó en S. epidermidis, pero las cepas
de S. agalactiae y E. coli fueron susceptibles. E. coli fue la única resistente a la cepa
láctica. El sobrenadante tuvo resultados similares a la cepa. Se encontró un crecimiento
de 2,3 x 107 a 1,1 x 1011 UFC/ml a diferentes condiciones gastrointestinales. La fase
exponencial se encontró a 16:48 h (3 x 1010 UFC/ml) y las variables pH, azúcar total,
acidez y proteína durante esta fase fueron: de 4,94; 0,88 mg/l; 2,89 mg/l y 1,9 mg/l. Se
encontró el péptido VAL-TIR-VAL y un 83,46% de ácido láctico. L. casei mostró buenas
características probióticas en condiciones in vitro que permitirían su aplicación en ensayos
in vivo para el control de microorganismos causantes de mastitis subclínica en vacas.
Palabras claves: bacteria, biomasa, salud, fermentación.
1
Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Programa de Zootecnia, Facultad de Cien-
cias Pecuarias, Universidad de Nariño. Ciudad Universitaria Torobajo - Clle 18 Cr 50, Pasto (Co-
lombia).
2
Grupo de investigación Fise-Probiotec, Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño. Ciu-
dad Universitaria Torobajo - Clle 18 Cr 50, Pasto (Colombia).
* Autor para correspondencia: henryjugam@gmail.com
ABSTRAC
Kinetics, growth tests and in vitro inhibition effect of L. casei on S. aureus, S. epidermidis, S.
agalactiae and E. coli. Was determined. commercial and strains isolated from milk samples
with subclinical mastitis (La Victoria, Pasto, Colombia) strains were used. The effect of
Dicloxacillin, Cefepime, Cephalothin, Ciprofloxacin, Gentamicin, Penicillin, Ampicillin
and Trimethoprim Sulfa antibiotics, as well as inhibition of L. casei and the supernatant on
bacterial pathogens was evaluated. L. casei growth was assessed at various gastrointestinal
conditions and growth kinetics. Peptides and organic acids in the supernatant (HPLC) were
determined. L. casei was susceptible to Ciprofloxacin and Ampicillin, while commercial S.
aureus showed susceptibility to antibiotics, the same was observed in S. epidermidis, but strains
of S. agalactiae and E. coli were susceptible. E. coli was the only strain resistant lactic. The
supernatant had similar results to the strain. an increase of 2.3 x 107 to 1.1 x 1011 CFU/ml
was found to various gastrointestinal conditions. Exponential phase was found to 16:48 h
(3 x 1010 CFU/ml) and the pH, total sugar, acidity and protein during this phase variables
were: 4.94; 0.88 mg/l; 2.89 mg/l and 1.9 mg/l. Peptide-VAL VAL-TIR and 83.46% lactic
acid was found. L. casei probiotic characteristics showed good in vitro conditions that allow its
application in vivo assays for controlling causative organisms of subclinical mastitis in cows.
Key words: bacterium, biomass, health, fermentation.
INTRODUCCIÓN
hidratos en comparación con la mayoría
La mastitis es considerada la enferme- de Lactobacillus encontrados en las leches
dad infecciosa más costosa de las vacas fermentadas (Santacruz 2004). De acuerdo
lecheras, debido a que induce una dis- con Bouchard et al. (2013) y Parasol et al.
minución en la producción de 4 a 30% (2005), L. casei posee la capacidad de ad-
de leche y baja su calidad, además de herirse al epitelio de la glándula mamaria
incrementar los costos del cuidado de la de vacas productoras de leche, sin presentar
salud del hato y un desecho prematuro ningún efecto citotóxico sobre el huésped.
de animales genéticamente mejorados La cepa láctica ha mostrado efectividad en
(Bedolla y Ponce de León 2008). Esta es el control de microorganismos patógenos
causada más comúnmente por infección como Staphylococcus aureus, Escherichia coli y
intramamaria (patógeno), pero también Streptococcus agalactiae (Ingrassia et al. 2005).
puede ser causada por una lesión (he- Su metabolismo proporciona cualidades or-
rida), y menos frecuente, por alergia ganolépticas a diversas leches fermentadas y
y neoplasias (Pastor-Guízar y Bedolla- quesos; además, se ha encontrado viabilidad
Cedeño 2008). de la cepa durante el tránsito por el tracto
Lactobacillus casei es una bacteria Gram digestivo, lo cual demuestra un adecuado
positiva con forma de bastón que pueden comportamiento en el uso de la cepa como
fermentar una mayor variedad de carbo- probiótica (Park et al. 2005).
32°C durante 48 horas, al final se realizó Se tuvo en cuenta únicamente las cajas de
recuento de bacterias de cada muestra. Petri con conteos entre 30 y 300 colonias.
Más adelante, se determinó si hubo El número de colonias fue multiplicado
producción de gas (Dahl et al. 1989) y por el inverso de la dilución y por 10 para
reacción de catalasa (Cai et al. 1999) en obtener UFC/ml (Lanara 1981).
la bacteria láctica y se si la cepa era viable Para determinar el pH se tomó una
a diferentes niveles de pH, para lo cual muestra del medio y se midió con pH-
se midió el crecimiento a pH 2,5; 4,5 y metro digital (Jenco® VisionPlus). Por su
7; se evaluó por un periodo de 3 horas, parte, el azúcar total se determinó me-
con toma de información cada hora. Para diante el método de Dubois (1956), para
ello, se usó medio MRS comercial y el lo cual, se prepararon diferentes concen-
pH fue ajustado con ácido tartárico, las traciones de glucosa para crear una curva
condiciones de incubación fueron de 32°C patrón mediante los valores obtenidos
durante 48 horas. de la observación de las muestras a una
Seguidamente, se usaron dos medios densidad óptica de 625 nm. Los datos se
de cultivo para evaluar los parámetros graficaron contra la concentración en mg/l
cinéticos de L. casei: el primer medio fue y finalmente se obtuvieron los valores de
el MRS comercial y el segundo el Pro, este la línea recta.
último compuesto por 10 g/l de azúcar El nivel de ácido láctico fue determi-
blanco, 8 g/l de extracto de carne y 4 g/l nado mediante titulación con hidróxido de
de extracto de levadura (Jurado-Gámez sodio (1N) (Negri 2005) y el de biomasa
2010). Para determinar la cinética de cre- con los métodos de Crueger y Crueger
cimiento se tomó un Erlenmeyer por cada (1993) y Rodríguez-León et al. (2003),
medio, se adicionaron 60 ml de inóculo para ello se estableció la velocidad máxi-
de L. casei y 540 ml de medio, se llevaron ma de crecimiento mediante la siguiente
a incubación en incubadora Shaker® con ecuación:
agitación constante a 32°C y 100 rpm, no
se controló el pH debido a las caracterís- dLnX
v max =
ticas de la cepa que resiste niveles bajos. dt
Posteriormente, se evaluó la cepa durante
24 horas, realizando mediciones cada 2 h El tiempo de duplicación celular (td), se
24 min. En cada medición se determinó determinó teniendo en cuenta la siguiente
conteo de microorganismos viables en ecuación:
placa (UFC/ml), pH, azúcar total, pro- Ln2
ducción de ácido láctico y proteína. td =
v max
El conteo de microorganismos viables
en placa se determinó mediante la disolu- El nivel de proteína se determinó con el
ción de 1 ml de muestra en 9 ml de agua método de Lowry et al. (1951), con modifi-
peptonada al 0,1%, se realizaron diluciones cación de Malara y Charra (1972); se obtuvo
decimales que fueron transferidas a cajas una curva patrón a partir de seroalbúmina
de Petri, que contenían medio MRS con bovina, luego se midió la absorbencia en
azul de anilina (0,1 ml) para siembra en espectrofotómetro a 625 nm. La concen-
superficie. Las cajas fueron incubadas a tración fue graficada contra los valores para
32°C y se observaron entre 24 y 48 horas. obtener la ecuación de la línea recta.
En cuanto a la variable acidez, esta mostró proteína mostró un valor inicial, expo-
un valor de 0,49% en la fase inicial, de nencial y final de 0,73; 0,68 y 0,36 mg/l,
0,88% en la fase exponecial y de 1,23% respectivamente (Figura 3); el análisis de
en la final (Figura 1); la regresión indicó regresión determinó que la variable no posee
una pendiente de 0,037% (r2 0,872 p < una tendencia cuando se compara con la
0,05). A su vez, la variable producción de cinética de crecimiento (r2 0,002 p > 0,05).
Por otro lado, la evaluación de los me- el medio Pro (p < 0,05). El resumen
dios mostró que existieron diferencias de datos de la cinética de crecimiento
significativas entre ellos, con un mayor en el medio MRS se puede ver en la
crecimiento de la bacteria láctica en Tabla 1.
Variable Valor
Fase latencia 0
Velocidad específica de crecimiento (μ h- ) 1
1,233
Fin fase log (h) 16:48
Tiempo de duplicación (min) 33
Incremento cel. Total 2,60E+08
Incremento cel. Fin fase log 3,30E+010
% azúcares consumidos totales 70,07
% azúcares consumidos fin fase log 54,35
% proteína consumida total 51,50
% proteína consumida fin fase log 43,50
Coeficiente de determinación R2 0,85
FIGURA 4. Cromatograma del sobrenadante de Lactobacillus casei, color azul estándar de péptidos
y color negro resultados del sobrenadante de L.casei.
Cantidad relativa en
Pico n° Tiempo de retención Concentración
% promedio
1 2,472 1,09 -
2 2,597 6,97 -
3 2,688 2,78 -
4 2,971 18,08 -
5 7,342 8,62 -
6 7,707 3,01 -
7 9,716 21,86 -
8 12,145 33,85 0,55 mg/ml
9 12,541 0,52 -
10 14,836 1,51 -
TABLA 4. Evaluación de sensibilidad (S) y resistencia (R) a antibióticos en cepas aisladas y de referencia.
DCX: Dicloxacilina, FEP: Cefepima, KF: Cefalotina, CIP: Ciprofloxacina, CN: Gentamicina, P: Penicilina, TF:
Trimetropim Sulfa, AM: Ampicilina.
a b
FIGURA 5. a: L. casei con azul de anilina; b: halos de inhibición de los antibióticos de Gentamicina,
Dicloxacilina y Ampicilina, sobre S. aureus.
En la Figura 6 se puede observar que las cepas se encontró resistencia de E. coli a todas las
de referencia fueron susceptibles a la bacteria concentraciones y resistencia de S. epidermidis
láctica, sin embargo, entre las bacterias aisladas a concentraciones de 25 y 100 µl.
FIGURA 7. Inhibición del sobrenadante de L. casei sobre las bacterias patógenas aisladas.
a: sensidisco con filtro, b: sensidisco sin filtro, c: cilindro con filtro, d: cilindro sin filtro.
FIGURA 8. Inhibición del sobrenadante de L. casei sobre las bacterias patógenas de referencia.
a: sensidisco con filtro, b: sensidisco sin filtro, c: cilindro con filtro, d: cilindro sin filtro.
No se encontró relación entre los métodos et al. 2004; Tuomola et al. 2001). En su
evaluados para el sobrenadante, ya que el caso, el crecimiento a niveles bajos de pH
análisis de correlación fue bajo (0,12 p > permite la colonización de lugares difíciles
0,05), por consiguiente las metodología como el estómago, lo cual trae como be-
observadas en la presente investigación neficio el bloqueo de los sitios de adhesión
necesitan evaluarse de mejor manera. para bacterias patógenas y la producción
de metabolitos antimicrobianos (Shiva-
DISCUSIÓN Ramayoni 2007). A su vez, las pruebas de
bilis y sales biliares mostraron resistencia
La cepa láctica mostró un crecimiento de la cepa láctica al estrés producido por
adecuado en los diversos ambientes eva- estas sustancias, factor de importancia
luados (temperatura, pH, sales biliares, si se considera que para una correcta
bilis). Su crecimiento se encuentra por colonización del sistema digestivo de los
encima de los reportados como aceptables animales la cepa administrada de forma
(< 109) para una adecuada colonización oral, debe tener la capacidad de crecer en
del tracto digestivo. En este sentido, uno las diferentes condiciones presentes en
de los factores de mayor importancia en la el huésped. (Melgar-Lalane et al. 2014)
selección de cepas probióticas es la viabili- El valor obtenido durante la fase expo-
dad a diferentes valores de pH (Salvatierra nencial muestra que la cepa láctica posee
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