Juan Manuel Hilarión Eslava
Carlos Felipe Alonso Contreras
Evaluación del Producto obtenido mediante fermentación sólida siguiendo el Manual
de Cenicafé por Trichoderma Harzianum
*Laboratorios, Universidad de La Sabana, Chía, Cundinamarca-Colombia, 27 de marzo del 2017.
Abstract
The present article it was determined by solid
fermentation, products from Trichoderma
harzianum which were grown on rice. The fungus
was grown on rice after preparing a solution and
allowed to grow the fungus for a week. Following
the manual of cenicafe, for quality control of
Trichoderma harzianum taking microscopic to
calculate the amount of conidia in watching shows
Newbauer chamber samples, germination capacity
and purity percentage. Finally, the sample was
grown on water agar and PDA, observing changes
that had every 24 hours for five days.
Resumen
En el presente trabajo se determinó mediante
fermentación sólida, unos productos a partir de
Trichoderma harzianum que fueron cultivados en
arroz. El hongo se cultivó en el arroz después de
haber preparado unas soluciones y se dejó crecer
el hongo por una semana. Siguiendo el manual de
cenicafé para el control de calidad del Trichoderma
harzianum tomando muestras microscópicas para
calcular la cantidad de conidios en la muestra
observándolos en la cámara de Newbauer,
capacidad germinativa y porcentaje de pureza.
Finalmente, se cultivó la muestra en agar de agua
y en PDA, observando los cambios que tenía cada
24 horas por cinco días.
Palabras Clave: Trichoderma harzianum, cámara
de newbauer, arroz, fermentación sólida, Agar de
agua, agar PDA.
Introducción
El género Trichoderma posee buenas cualidades
para el control de enfermedades en plantas
causadas por patógenos fúngicos del suelo,
principalmente de los géneros Phytophthora,
Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium y Fusarium entre
otros. Las especies de Trichoderma actúan como
hiperparásitos competitivos que producen
metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas a
los que se les atribuyen los cambios estructurales a
nivel celular, tales como vacuolización,
granulación, desintegración del citoplasma y lisis
celular, encontrados en los organismos con los que
interactúa (Mohammed E., Pérez C., Ahmed Sid.,
Requena M., Candela M., 2004).
Las especies del género Trichoderma son los
antagonistas más utilizados para el control de
enfermedades de plantas producidos por hongos,
debido a su ubicuidad, a su facilidad para ser
aisladas y cultivadas, a su crecimiento rápido en un
gran número de sustratos y a que no atacan a
plantas superiores (Papavizas et al. 1982).
El arroz original es rico en aceite que a su vez es
rico en vitamina E. Este aceite tiene un alto
contenido en ácido linoleico por lo que se enrancia
muy fácilmente (Otálora, 2001). Permitiendo el
crecimiento del hongo
La estructura química del almidón es relativamente
sencilla comparada con otros sustratos.
Esencialmente el almidón está compuesto de dos
polímeros relacionados en diferentes proporciones:
amilosa (16-30%) y amilopectina (68-85%). De esta
manera Trichoderma sp., hidroliza el polímero del
almidon mediante enzimas como glucoamilasas, α-
amilasas, β-amilasas, pululanasas e isoamilasas
(Raimbault, 1998), obteniendo moléculas libres de
glucosa, las cuales son fáciles de asimilar,
permitiendo el crecimiento micelial y la producción
de conidios, al mismo tiempo se producen acidos
organicos producto del desarrollo del
microorganismo los cuales influyen en la
disminución gradual del pH (Otalora & Col, 2001).
Metodología
Reactivación de la cepa a partir del banco
primario
Se adiciono 19 mL de agua con tweem 80 al 0.1%
(v/v) a la caja con T. Harzianum, se le colocó
perlas de vidrio dentro de la caja de Petri y con una
aguja de disección, se desprendió por remoción
física los conidios de la caja. Con ayuda de una
pipeta Pasteur se transfirió la totalidad de la
solución concentrada a un tubo de ensayo.
Determinación del porcentaje de germinación
de conidios
Se tomó una muestra de la dilución de 10-2 y se
depositó en una caja de Petri con agar PDA como
se muestra en la figura 1 y se incubo por 24 horas.
En la zona donde se agregaron las alícuotas sobre
el agar, se agregó una gota de azul de lactofenol y
dichas zonas se cortaron con un bisturí en
cuadrados de 1 cm x 1 cm. Los cuadros se
colocaron en una laminilla y posteriormente se
miraron en el microscopio contando 100 conidios
por zona registrando los germinados y no
germinados, se realizaron los cálculos que se
muestran en la parte de análisis y resultados.

Recuento de conidios/mL en cámara de

Newbauer
A partir de la solución concentrada obtenida con
anterioridad, se realizan diluciones de 10-1, 10-2, 10-
3
. Posteriormente se tomó una muestra pequeña de
la dilución número dos y se realizó el conteo,
contando los conidios que se encuentras en las
cuadriculas de los extremos (esquinas) y la del
Figura 1. Solución diluida en agar PDA
centro, para realizar el cálculo se alude a la
siguiente ecuación: Determinación del porcentaje de pureza
𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 ∑ 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑥 1/𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 Se tomaron las diluciones 10-2 y se sembró sobre
3
=
𝑚𝑚 1𝑚𝑚 𝑥 1𝑚𝑚 𝑥 1𝑚𝑚 𝑥 5/25 una superficie de agar PDA, se incubo por siete
días para verificar la presencia de microorganismos
Inoculación del arroz en bandejas de aluminio
contaminantes.
como sustrato solido
Análisis y resultados
Bajo condiciones estériles, se inoculo la totalidad
de la solución concentrada de conidios, se Caracterización macroscópica y microscópica
distribuyó uniformemente sobre el sustrato y se
tapó, se incubo por 8 días a temperatura ambiente.
Determinación del número de conidios/g de
producto
Bajo condiciones estériles se retiró la tapa de la
caja con sustrato y solución concentrada, se
retiraron los conidios por medio de filtración usando
un colador y gasa en un vaso de precipitado. A
partir de la solución filtrada, se realizaron
diluciones desde 10-1 hasta 10-8, se eligió la
dilución de 10-2 para realizar conteo en cámara, al
obtener un conteo de conidios/mL, se aludió a la
siguiente ecuación para obtener los conidios/g: Fermentación solida por Trichoderma Harzianum

𝐶𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 Inicialmente se observa sobre el arroz un moho

𝐶𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑚𝐿 𝑥 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒 color blanco, pero con el paso del tiempo en la
=
𝑔 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜 incubación del hongo, este torna a ser verde, esto
se debe a que los conidios de la T. harzianum son
de este color tras el proceso de la esporulación fermentación solida fue eficaz (Romero-Arenas,
para su propia reproducción (Universidad Nacional Lara, Huato, & Hernández, 2009).
de Córdoba). Cabe destacar que esta especie
generalmente prefiere un pH correspondido entre
4.5 - 5, y además se desarrolla en condiciones
ambientales de alta humedad con posibles
estancamientos de CO2 en la atmosfera en la que
se encuentra (Rivera 1993).

Estructura microscópica de la Trichoderma Harzianum

(resultado obtenido en el laboratorio de La Sabana)

Recuento de conidios en cámara de Newbauer

Para realizar el conteo en la cámara se hizo uso de
una de las diluciones preparadas a partir de la
solución concentrada dando como resultado lo
siguiente:
𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 427/10−2
=
𝑚𝑚3 1𝑚𝑚 𝑥 1𝑚𝑚 𝑥 1𝑚𝑚 𝑥 5/25
= 2,13500000𝑥105 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝑚3
Estructura microscópica de la Trichoderma Harzianum
(Romero-Arenas, Lara, Huato, & Hernández, 2009).

Dando como resultado en la dilución de 10-2 un

Los conidios son de color verde como se nombró total de 213500 conidios por milímetro cubico.
anteriormente, estos presentan diversas
ramificaciones perpendiculares con formas
piramidales y sus fiálides (células terminales de los Determinación de número de conidios/g de
conidióforos que constituyen el soporte de los producto
conidios) son largas y delgadas. Los conidióforos
Para cuantificación de conidios por gramo de
presentan tamaños de 62.5-69 x 3-4.7 m, las
producto se hace uso de la siguiente ecuación:
fiálides tienen tamaños de 6.3-15.6 x 2.7-3.4 m y
los verticilos constan de un tamaño de 3.8-4 x 3.1- 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠
𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑥 𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒
3.7 m según estudios realizados por otros = 𝑚𝑙
investigadores (Gilchrist, 2005). 𝑔 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

Como se puede observar en la imagen a Para obtener los conidios por ml se usa el siguiente
continuación. Se obtuvo dicha imagen factor de conversión:
microscópica en el laboratorio de la Universidad de 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 1000 𝑚𝑚3 1 𝑐𝑚3
5
La Sabana, donde dicha muestra tiene apariencia 2,13500000𝑥10 𝑥 𝑥
𝑚𝑚3 1 𝑐𝑚3 1 𝑚𝑙
similar en comparación con la teórica, por lo que se = 213500000 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝑙
puede deducir que la esporulación de la
Aplicando la ecuación de conidios por gramo del
producto se obtienen 1,60125000x108 conidios/g,
esta es la cantidad obtenida por gramo del sustrato
manejado en el laboratorio.
Determinación de porcentaje de germinación
La Trichoderma Harzianum como la mayoría de los
hongos se reproduce de forma asexual, realizando
el proceso de esporulación para su reproducción.
En el momento de la esporulación no todos los
conidios germinan para que el hongo crezca, por
ende, el 100% de ellos no contribuyen a la
reproducción del hongo, siendo esto se realizó el
cálculo correspondiente para determinar el
porcentaje de germinación de dicho hongo tratado Alícuota en agar No.1
en el laboratorio, obteniéndose el siguiente
resultado junto con su correspondiente calculo
(Rifai, 1969)

280 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠

𝑥 100%
500 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑦 𝑛𝑜 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠
= 56%
Como se muestra en la ecuación anterior, se
obtuvieron 280 conidios germinados en las 5
muestras de alícuotas en agar (cultivo) de un total
de 500 conidios germinados y no germinados,
dando como resultado un 56% de germinación. El
valor permitido de germinación es 85%, el valor
obtenido es más bajo y puede deberse a que las Alícuota en agar No. 2
condiciones ambientales como humedad en las
que se encontraba el hongo pudieron no haber sido
adecuadas (Hoog, 2000). Este organismo trabaja
mejor en condiciones con poca humedad, por
ende, la Trichoderma posiblemente se encontraba
en un ambiente con altas cantidades de agua o
siendo este un organismo heterótrofo (organismos
que requieren materia orgánica para la obtención
de energía y a partir de ella, realizar sus procesos
biológicos) no obtuvo la suficiente energía para su
reproducción, disminuyendo la posibilidad de un
crecimiento adecuado del mismo (Chávez, 2006)
El valor del conteo de conidios se obtuvo a partir
de las muestras en agar que se pueden observar a
continuación: Alícuota en agar No. 3

Alícuota en agar No. 4
Alícuota en agar No. 5
Determinación de la pureza en la muestra
No se tomaron en cuenta los UFC/ml de T.
harzianum ya que no existen agentes
contaminantes en la muestra, esto se notó ya que
en el cultivo sobre agar de PDA creció
exclusivamente el hongo con color blanco sin notar
algún otro color en particular, con esto se pudo
deducir que la muestra no estaba contaminada y
su pureza se ve reflejada alrededor del 100%.
(Lorito, 1993)
Representación Gráfica de los resultados
En la siguiente grafica se puede observar el
comportamiento de los resultados obtenidos a
partir de la práctica de laboratorio, donde se
deduce que a pesar de haber obtenido una
germinación con un porcentaje bastante bajo, se
logró adquirir una buena cantidad de conidios y así
lograr que el hongo tenga un crecimiento positivo y
logre esparcirse sobre una muestra para realizar el
proceso de la fermentación sólida.
Conidios vs Pureza vs Germinación
120 1.80E+08
1.60E+08
100
1.40E+08
% Pureza y Germinación
80 1.20E+08
Conidios/g
1.00E+08
60
8.00E+07
40 6.00E+07
4.00E+07
20
2.00E+07
0 0.00E+00
Conidios/g Pureza Germinación
Conclusiones
La morfología de trichoderma harzianum se
caracteriza por un desarrollo temprano rápido en
materiales orgánicos y de cultivo y que al ser
cultivados generan un hongos rápidamente en el
medio de cultivo y dependiendo de la humedad se
desarrollan más rápido.
El porcentaje de germinación no fue el esperado ya
que se esperaba un porcentaje mayor al 85%, por
lo que probablemente se tomó una dilución en la
que no habían suficientes conidios desarrollados
para que diera el porcentaje esperado o no
crecieron adecuadamente debido a las condiciones
ambientales
No hubo contaminación en el agar-PDA y que no
se evidenciaba presencia e contaminantes por lo
que el porcentaje de 100% de pureza está bien
definido.
Se obtuvo una fermentación solida bastante
desarrollada ya que se pudo comprobar mediante
el análisis microscópico de la muestra que se
generan bastantes conidios germinados y no
germinados en Trichoderma harzianum.
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