INMUNODIAGNÓSTICO

I.INTRODUCCION:

El laboratorio de Microbiología tiene un importante papel en el diagnóstico y control de las

enfermedades infecciosas.
El diagnóstico microbiológico de una enfermedad infecciosa puede ser:

 Directo cuando se busca el microorganismo o alguno de sus componentes

(antígenos o ácidos nucleicos).

 Indirecto, tradicionalmente llamado serológico, detecta la respuesta del sistema

inmunitario de la persona que padece la infección, al agente biológico que la
produce.
En la actualidad es más correcto hablar de inmunodiagnóstico para referirnos a todos los
procedimientos de diagnóstico de las enfermedades infecciosas basados en la reacción
antígeno anticuerpo.

II.MARCO TEÓRICO:

El desarrollo de la Inmunología moderna abre nuevas posibilidades en el diagnóstico,

monitoreo y tratamiento de las enfermedades transmisibles y no transmisibles en el ser
humano.

i. Concepto de inmunodiagnóstico

Conjunto de técnicas, basadas en la reacción antígeno- anticuerpo, que se aplican en el

estudio del proceso infeccioso. Su utilidad es detectar antígenos o anticuerpos en muestras
biológicas (principalmente suero) para saber si un paciente está infectado (infección
aguda), ha respondido inmunológicamente a una infección (infección pasada) o a una
vacuna.

 Antígeno (anti - gen):

Histórica y etimológicamente significa, molécula capaz de producir anticuerpos. Esto

implica que estimulan al sistema inmunitario para que produzca anticuerpos. Pero además
tienen otra propiedad, que reaccionan específicamente con los anticuerpos que producen.

Los antígenos por su procedencia pueden ser:

 Sustancias solubles, que se liberan al medio, como las toxinas y cápsulas

bacterianas.
  Particulados o formes son los antígenos que forman parte de la estructura de virus,
bacterias, hongos y parásitos.
 Obtenidos por recombinación genética o por síntesis en el laboratorio.

 Anticuerpo:

Molécula de inmunoglobulina (glicoproteína) con una secuencia de aminoácidos específica

en virtud de la cual interacciona solamente con el antígeno que indujo su síntesis en las
células de la serie linfoide (células plasmáticas) o con antígenos muy relacionados con él.
Las inmunoglobulinas, por su composición proteica, también actúan como antígenos. Las
principales clases de anticuerpos son las inmunoglobulinas G, M, A y E.

ii. Elaboración de la respuesta inmunitaria

Desde que se produce el contacto con un antígeno, la respuesta inmune humoral

(producción de anticuerpos) tarda en desarrollarse y detectarse de una a tres semanas.
La primera clase de inmunoglobulinas que aparece son los anticuerpos de la clase M, que
por lo general desaparecen pronto.
Las inmunoglobulinas de la clase G aparecen después y persisten más tiempo, en algunos
casos se detectan durante toda la vida, de ahí su interés en epidemiología.

iii. Reacción antígeno-anticuerpo

La reacción del antígeno (Ag.) con el anticuerpo (Ac.) para formar complejos Ag.-Ac., se
realiza en una zona pequeña en la que se complementan el determinante antigénico y la
zona combinante del anticuerpo. Es una reacción físico química específica, reversible, que
ocurre in vivo (en el ser humano) e in vitro (en el laboratorio).

Los factores que hacen posible esta unión son:

 La complementariedad de las regiones que intervienen en la reacción. Hace que

ambas regiones estén muy próximas.
 Las fuerzas de atracción: iónicas por la carga diferente de los reactivos,
hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van Der Waals. Estas fuerzas se
potencian por la proximidad de las regiones que intervienen en la reacción.
 iv. Tipos de reacción Ag.-Ac.

1.- Las reacciones clásicas, aglutinación, precipitación o fijación del complemento. Se

caracterizan por que cuando se encuentran el antígeno y su anticuerpo específico se
produce la formación de complejos Ag.-Ac. que no son visibles y se evidencian por una
nueva propiedad que manifiesta el complejo:

 Formación de agregados que se ven a simple vista, en la aglutinación.

 Producción de complejos Ag.-Ac. insolubles, también visibles, precipitación.
 Unión del complemento a los complejos Ag.-Ac. con la observación de la acción de
aquel, en las reacciones de fijación del complemento.

2.- Técnicas de inmunodiagnóstico que emplean reactivos marcados para evidenciar la

reacción Ag.-Ac, las más utilizadas son:

 Inmunofluorescencia, en las que los reactivos se marcan con colorantes

fluorescentes.
 Técnicas inmunoenzimáticas que emplean enzimas como marcadores.

3.- Western Blot:

A partir de una mezcla antigénica se realiza una separación previa de los diferentes
antígenos por electroforesis en un gel de poliacrilamida. A continuación se realiza el
transporte, por capilaridad o electroforesis, a un soporte generalmente de nitrocelulosa. La
búsqueda de anticuerpos frente a los diversos antígenos transferidos se suele realizar en
la membrana soporte por una técnica inmunoenzimática.

En los laboratorios de Microbiología se suelen utilizar los soportes con los antígenos ya
fijados, y se realiza la técnica inmunoenzimática, a esta técnica se la denomina inmunoblot.
Son técnicas muy específicas.

v. Características

De las propiedades de las técnicas de inmunodiagnóstico es preciso destacar tres,

sensibilidad, especificidad y valor predictivo.
  La sensibilidad de una prueba significa en la práctica clínica diaria, su capacidad
para detectar los casos de infección en la población estudiada. Los falsos
negativos (la prueba es negativa en personas infectadas) ponen en cuestión la
sensibilidad de la prueba.

 La especificidad permite asegurar que el resultado positivo de una prueba indica

con precisión que el paciente está infectado. Las pruebas con elevada especificidad
deben tener muy pocos falsos positivos (la prueba es positiva en una persona no
infectada).

 El valor predictivo de una prueba, indica su capacidad para confirmar la presencia

de una enfermedad (valor predictivo positivo) o para descartarla (valor predictivo
negativo).

i. Utilidad

Las aplicaciones del inmunodiagnóstico en relación a las enfermedades infecciosas son:

1º. Diagnóstico directo: detección de antígenos.

a) En la detección de enfermedades infecciosas, antígeno de superficie del virus

de la hepatitis B.
b) Para identificar microorganismos en el laboratorio.

2º. Diagnóstico indirecto: detección de anticuerpos.

a) Detección de infecciones o enfermedades infecciosas, infección por el virus de

la inmunodeficiencia humana (VIH), hepatitis C, sífilis.

b) Determinación del estado inmunitario de individuos y poblaciones. Conocer el

porcentaje de personas de una población que ha pasado la infección por el
virus de la hepatitis A, (herramienta epidemiológica)

vi. Situaciones en que se emplean:

1). Como pruebas tamiz (cribado):

Se utilizan para estudiar poblaciones en las que se quiere detectar la existencia de

una infección aguda o anticuerpos frente al agente causal (infección antigua). Las
técnicas utilizadas con este fin deben tener elevada sensibilidad (superior al 95%) y
un elevado valor predictivo negativo. Las más utilizadas en la actualidad son las
técnicas inmunoenzimáticas.

Ejemplos de este tipo de pruebas son, la determinación del antígeno de superficie

del virus de la hepatitis B o de anticuerpos frente al virus de la hepatitis C en
donantes de sangre, o de anticuerpos frente al virus de la rubeola en mujeres en
edad fértil que no han sido vacunadas.

2). En el diagnóstico:

Se aplican a pacientes en los que se sospecha padecen una determinada

enfermedad infecciosa. Deben ser técnicas muy sensibles. Se utilizan técnicas muy
 diversas, aglutinación látex, hemaglutinación pasiva, inmunofluorescencia y
técnicas inmunoenzimáticas.

3). Para afianzar el diagnóstico:

Se utilizan como complemento de las pruebas tamiz o pruebas diagnosticas

positivas para conseguir una elevada especificidad. Son técnicas muy específicas
(98 a 99 %) y con un elevado valor predictivo positivo. Con este fin se utilizan las
técnicas de Western blot o inmunoblot.

vii. ¿En qué enfermedades infecciosas han tenido utilidad tradicionalmente los
métodos de inmunodiagnóstico?

1. En las de larga evolución, sífilis, hepatitis, brucelosis, SIDA.

2. En las que no se ha conseguido aislar el agente causal, o es difícil de aislar

(sífilis, toxoplasmosis...).

3. Aquellas en que el inmunodiagnóstico es más precoz que el diagnóstico directo

tradicional (distomatosis por F.hepatica).

4. En las que resulta ser el método de diagnóstico más rápido. El rosa de bengala
o la aglutinación, son técnicas sencillas y rápidas, que permiten realizar el
diagnóstico de brucelosis en minutos o en horas (respectivamente), mientras que
el cultivo es un procedimiento más lento (días o semanas) y peligroso, por el
riesgo de contagio en el laboratorio si no se procesan las muestras con las
medidas de seguridad adecuadas.

PRUEBA DE ELISA

El examen de ELISA es una de las pruebas más eficaces para detectar el virus del VIH. Se
realiza en las enzimas y su nombre viene del término inglés "Enzyme-linked
immunosorbent assay", que quiere decir “ensayo inmonoenzimático ligado a enzimas".

Este estudio es muy rápido, efectivo y confiable y sus resultados son tratados con toda la
confidencialidad que el paciente requiere.

También se puede detectar el virus por medio de otro análisis, llamado por “aglutinación” y
se realiza también por medio de la toma de una muestra de sangre.

Otras pruebas de laboratorio para confirmar la presencia de anticuerpos del VIH, incluyen
la inmunoelectrotransferencia o examen de Western Blot, la inmunofluorescencia y la
radioinmnoprecipitación o RIPA.
Fundamentos y Tipos de ELISAS.

El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de

forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como
enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una
enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-
anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición
de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple
vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuación:

 Anticuerpos marcados:
 ELISA Directo
 ELISA Indirecto
 ELISA sándwich
 Doble (DAS)
 Heterólogo (HADAS) Antígeno marcado
 ELISA competitiva

ELISA Directo. Consta de las siguientes etapas:

• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar

los antígenos fijados deficientemente o no fijados.

• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos

reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se

puede parar la reacción si se desea.

• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas:

• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de

estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán
específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.

• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los
anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los
antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se

puede parar la reacción si se desea.

• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

Pasos generales de un ELISA.

1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.

2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el
pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adición del substrato
9. Unión del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color

Forma en que se realiza el examen

La sangre se extrae de una vena, usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la
mano. El sitio de punción se limpia con un antiséptico y luego se coloca una banda elástica
alrededor del antebrazo con el fin de ejercer presión y hacer que las venas se llenen de
sangre.

Luego, se introduce una aguja en la vena y se recoge la sangre en un frasco hermético o

en una jeringa. Durante el procedimiento, se retira la banda para restablecer la circulación
y, una vez que se ha recogido la sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de punción
para detener cualquier sangrado.

En los bebés o niños pequeños, el área se limpia con un antiséptico y se punza con una
aguja o lanceta puntiaguda. La sangre se puede recoger en una pipeta (tubo pequeño de
vidrio), en una lámina de vidrio, sobre una tirilla de examen o en un recipiente pequeño.
Finalmente, se puede aplicar un algodón o un vendaje en el sitio de la punción si hay algún
sangrado.

Lectura e interpretación de los resultados.

La lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimétricamente. A
simple vista, pueden ser leídos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una
cuantificación y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz
de discernir una variación de 0,1 de densidad óptica) ya que dicha lectura visual tendrá el
inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos límite. No
obstante, evita la adquisición de aparatos relativamente costosos como son los lectores de
microplaca.

Una de las grandes ventajas de la técnica ELISA es la posible automatización de la lectura

y, por lo tanto, su objetividad.

Dicha automatización se puede conseguir con un simple colorímetro o espectrofotómetro

de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automática de microplacas.

Los resultados finales de la lectura colorimétrica se reflejan numéricamente mediante

valores de absorbancia o densidad óptica que se obtendrán a la longitud de onda más
adecuada para la coloración final alcanzada.

Razones por las que se realiza el examen

La prueba para la infección por VIH se realiza y se recomienda por muchas razones,
incluyendo la evaluación de grupos de alto riesgo (hombres homosexuales, usuarios de
drogas inyectables, trabajadores sexuales, etc.), mujeres embarazadas (dado que el
tratamiento apropiado a menudo puede prevenir la transmisión del virus al feto) e
individuos con ciertas afecciones e infecciones (como el sarcoma de Kaposi, neumonía
por Pneumocystis carinii).

Significado de los resultados anormales

El ELISA se emplea como una prueba de detección. Un resultado positivo no significa
necesariamente que la persona ha estado expuesta al virus del VIH, ya que hay ciertas
condiciones que pueden llevar a que se presenten resultados falsos positivos como la
enfermedad de la sífilis o el lupus.

Una prueba ELISA positiva siempre va seguida de una prueba confirmatoria llamada
inmunoblot, que de ser positivo es generalmente considerada como concluyente para una
infección por VIH.

Las pruebas negativas no necesariamente descartan la infección por VIH, debido a que
existe un intervalo, llamado "período de ventana inmunológica", entre dicha infección por
VIH y la aparición de anticuerpos anti-VIH mesurables. Por lo tanto, si se sospecha que
una persona tiene la infección aguda o la infección primaria por VIH y que por ende esté en
el período de ventana inmunológica, un ELISA y un inmunoblot negativos no descartan
este diagnóstico. Es necesario entonces realizar otras pruebas adicionales para carga viral
de VIH.

Cuáles son los riesgos

 Sangrado excesivo
 Desmayo o sensación de mareo
 Hematoma (acumulación de sangre debajo de la piel)
 Infección (un riesgo leve en cualquier momento que se presente ruptura de la piel)
 Punciones múltiples para localizar las venas

INMUNOCROMATOGRAFÍA

La inmunocromatografía es una de las técnicas de inmunodiagnóstico más modernas

cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez del test. Cada vez son más las
aplicaciones de esta técnica, como test de campo debido a que no es necesario reactivos
ni instrumentación adicional, como en el campo clínico.

En el siguiente esquema se resume el fundamento del método:

 La muestra se pone en contacto con la zona del conjugado. Esta lleva impregnada
un conjugado formado por un anticuerpo específico contra uno de los epítopos del
antígeno a detectar y un reactivo de detección. Si la muestra contiene el antígeno a
detectar, éste se unirá al conjugado formando un complejo y empezarán a migrar a
través de la membrana de nitrocelulosa. Si no, migrarán el conjugado y la muestra
sin unirse.
 La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico contra otro
epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por
la unión del antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará
(muestras positivas). Si la muestra no contenía el antígeno, el segundo anticuerpo
no captura nada y la línea queda trasparente (muestras negativas).
 La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de
detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al
conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un
control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con
muestras positivas y negativas.

Interpretación De Los Resultados:

 NEGATIVO: Solo aparece una línea transversal coloreada en la zona central
blanca de la tira.

POSITIVO: Aparecen dos líneas transversales coloreadas en la zona central blanca

de la tira.

Toda línea que por la naturaleza de la muestra pueda aparecer pasados 15 minutos no
tendrá valor diagnóstico. Si no aparece ninguna línea coloreada en la zona blanca central
el test será inválido porque no se ha procedido correctamente o bien porque los reactivos
se han deteriorado. Repetir el test con una nueva tira. Para obtener el máximo de
sensibilidad y para asegurarse de los resultados negativos, la lectura final deberá hacerse
a los 10 minutos. No deben interpretarse resultados pasados este tiempo.

Advertencias generales

o La muestra no debe superar nunca la zona de las flechas.

o La tira reactiva es sensible a la humedad. Cerrar siempre bien el
contenedor. Una vez roto el precinto no guardar en la nevera a fin de evitar
la condensación de agua.
o MUY IMPORTANTE: Utilizar una pipeta distinta para cada muestra.

Fundamento

 Es un método cualitativo indirecto basado en el principio de la absorción selectiva

de inmunoglobulinas

III.OBJETIVOS:

 Detectar anticuerpos anti-VIH y no componentes virales.

 Saber diferenciar un resultado positivo de un negativo en un kit con las líneas
coloreadas en la zona central.
 Interpretar una prueba de inmunocromatografia.
 Conocer los pasos para realizar una prueba de inmunodiagnóstico (ELISA) así
como su interpretación para un buen diagnostico.
IV.MATERIALES Y MÉTODO:

 MATERIALES:

 Prueba de ELISA

 Un suero positivo

 MÉTODO:

 Inmunocromatocrafia
 Aglutinación

V.OBSERVACIÓN:

PRUEBA DE ELISA

1. Primero la explicación de las partes del kit para poder interpretarlo y ver si es una
prueba positiva o negativa
 2. Para colocar la muestra de suero en el kit este, debe estar de forma horizontal.

3. Se coloca el suero con las debidas precauciones de bioseguridad sobre la parte

inferior del kit

4. La sangre debe difundirse por el papel de filtro luego se agrega el diluyente para
que esta se difunda rápidamente, se esperan entre 5 a 20 minutos para que
aparezca la línea.
5. Una vez pasado ese tiempo observamos los resultados del kit

6. El resultado será positivo si presenta líneas de color rojo sobre T1 (VIH tipo 1) o T2 (VIH
tipo 2) o a veces los dos.

7. El resultado será negativo si este no presenta líneas marcadas ni el uno ni el tipo dos
 PRUEBA DE AGLUTINACION

 El objetivo de este método fue realizar la prueba de aglutinación en sangre fresca

para realizar el análisis de tipos sanguíneos, haciendo una observación macroscópica
de la aglutinación.

Vamos a hacer una prueba aglutinación en sangre fresca, utilizando los

anticoagulantes, anti- A, anti- B y anti-D color amarillo, azul y transparente
respectivamente, punteando la sangre sobre la placa excavada.

1.-Se tomara la muestra de sangre y se colocara sobre la lámina portaobjetos.

2. se echara una gota de cada anticoagulante sobre la gota de sangre siendo para
cada uno de ellos una gota de sangre independiente una de otra.

3. Se mezclara la sangre utilizando los palillos de madera, después se harán

movimientos en rotación y traslación para observar la aglutinación y darna cuenta si
la sangre es tipo positivo o negativo.

 Positiva si se observa aglutinación y negativa si esta no presenta

aglutinación
 a el factor Rh será positivo si hay aglutinación y será negativo si esta no
presenta aglutinación
  Esta práctica fue muy importante puesto que aquí se aprendió a determinar tipo
sanguíneo y de igual manera muchas cosas más que serán de gran ayuda en un
futuro

VI.DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En esta práctica se logro realizar adecuadamente los pasos, para realizar una prueba de
ELISA de manera rápida respetando el tiempo y el orden de los pasos, así como también
teniendo en cuenta el protocolo de bioseguridad necesario para este tipo de pruebas.

Para esta prueba se tomaron muestras de suero fisiológico positivo y negativo para hacer
una diferenciación y como se verían e interpretarían sus resultados.

Presentando el suero fisiológico positivo dos líneas en la zona central a diferencia de la

negativa que solo presenta la línea de control indicándonos que uno de ellos el positivo
presenta el VIH y el de una línea el negativo que no presenta VIH demostrando la eficacia
de este tipo de prueba.

También se hicieron identificación de grupos sanguíneos por el método de la aglutinación,

donde se colocaban tres gotas de sangre en un portaobjetos y se colocaban los grupos
antígenos anti A, anti B, y el Rh ,donde presentaba aglutinación identificaba el grupo
sanguíneo y el factor Rh + o –

VII. BIBLIOGRAFIA

 http://www.clinicadam.com/salud/5/003538.html
 http://www.monarcasmexico.org/elisa.htm
 http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/medicina_experimental/v19_n1/prueba.htm
 http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043o.pdf
 http://www.saludalia.com/Saludalia/servlets/contenido/jsp/parser.jsp?nombre=doc_i
nmunodiagnostico1
 http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=37962305
 http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/mariamc/lacteos/practica8.htm