HEMOGLOBINOPATIAS

Abordagem Laboratorial

Hemoglobina
A hemoglobina é uma metaloproteína globular tetramérica.

Ferro (Fe2+) Grupo heme
duas subunidades

Cadeia heme
α Cadeia tipo α e duas tipo
β
não-α

Glóbulo

quatro grupos heme
Vermelho Cadeia Cadeia α (grupo prostético)
β α

Representação da estrutura de uma molécula de hemoglobina.

1
 Hemoglobinas humanas nos diferentes períodos do desenvolvimento
Estadio de
Embriónico Fetal Adulto
desenvolvimento

Hb Gower I Hb A
( ζ2ε2 ) ( α2β2 )

Hb Gower II Hb F
Hemoglobinas ( α2 G ou A
γ2 )
( α2ε2 ) Hb A2
Hb Portland ( α2δ2 )
( ζ2γ2 )

Hemoglobinas humanas na vida adulta

Hemoglobina cadeias percentagem

Hb A α2β2 96 a 98 % da Hb total

Hb A2 α2δ2 2 a 3,0 % da Hb total

Hb F α2γ2 < 1 % da Hb total

Hemoglobinopatias
As hemoglobinopatias resultam de mutações que
afectam os genes responsáveis pela síntese das
cadeias de globina da hemoglobina.
Quantitativas: diminuição ou ausência de
síntese de uma ou mais cadeias de globina-
talassemias
Qualitativas:
dão origem a variantes estruturais das
hemoglobinas (ex: Hb S, Hb C, Hb D)

2
As hemoglobinopatias constituem as alterações monogénicas
mais comuns.
Em 1995, estimativas da OMS, indicaram que cerca de 6% da
população mundial é portadora de uma hemoglobinopatia.

As hemoglobinopatias são
transmitidas à descendência
segundo um padrão autossómico
recessivo
Normal Portadores Doente
1 em 4 (25%) 2 em 4 (50%) 1 em 4 (25%)

O sector de hemoglobinopatias da ULR:

 Rastreios - identificação de portadores

 Detecção de casais em risco

 Confirmação de diagnóstico

 Participação em programas externos de avaliação da

Qualidade ( NEQAS e PNAEQ)

 Colaboração em projectos de investigação

 Formação e ensino

3
Metodologias utilizadas na caracterização analítica do
fenótipo:
Técnicas electroforé
electroforéticas:
ticas:
Focagem isoelé
isoeléctrica em gel de poliacrilamida

Técnicas cromatográ
cromatográficas:
ficas:
HPLC de troca catió
catiónica
HPLC de fase reversa das cadeias de globina

Estudos funcionais da Hb
Teste de solubilidade da HbS
Teste de estabilidade - Teste do isopropanol
Pesquisa de corpos de inclusão de Hb H
Estudos de afinidade para o O2

Focagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida

A focagem isoeléctrica é uma técnica de electroforese em gel
de poliacrilamida, a potência constante e em gradiente estável
de pH, e que permite a separação de proteínas de acordo com
o seu ponto isoeléctrico.

Permite detectar Método com boa resolução

Hb S Separação Hb A da Hb F
Hb D Punjab
Detecção variantes de Hb raras
Hb C
Hb E
Hb Lepore

4
 Focagem isoelé
isoeléctrica em gel de poliacrilamida

Hb D Hb S Hb Lepore

C C
S C
S S
F
F F
A
A A

Hb C
Hb E

C
S C
F S
A F
A

HPLC de troca catiónica

É uma técnica cromatográfica que separa as hemoglobinas com base na sua
carga global e no seu comportamento ácido-base.
É um mé
método de escolha para quantificar fracç
fracções normais e fracç
fracções
anó
anómalas:
 Quantificaç
Quantificação relativa dos níveis de Hb A2
Hb A2
 Quantificação relativa dos níveis de Hb F (%)

 Quantificação relativa de variantes estruturais da

Hb S
Hb
(%)
 Identificação presuntiva de variantes de Hb
intervalos de tempos de retenção previamente
estabelecidos: Hb S, Hb D, Hb C, Hb E.

5
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa - RP-HPLC
Leone et al (1985) e Wacjman et al (2002)

 Fase estacionária
Coluna LiChrospher 100 RP-8 (Merck) : partículas de sílica, ligadas através de grupos silanol a
cadeias hidrocarbonadas (C8)

 Fase móvel

Tempo Acetonitrilo Metanol NaCL 0,155M H2O

(min) (mL) (mL) pH 2,7 desionizada
(mL) (mL)
0 31,0 31,2 30,0 7,8

75 46,2 19,6 30,0 4,2

Separação em Gradiente:75min., fluxo 0,7 mL/min Representação do equipamento HPLC

Detector UV : 215 nm

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa

Mecanismo de retenção envolve:

Interacções hidrofóbicas entre as cadeias hidrocarbonadas fase

estacionária com as regiões de baixa polaridade do soluto

A separação das cadeias de globina é baseada essencialmente

na sua diferença de hidrofobicidade.

6
 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa

Identificação presuntiva de variantes estruturais da hemoglobina -

tempos de retenção relativos -TRR

Quantificação das variantes estruturais

Identificação do tipo de cadeia globínica variante (α

α ou não-α
α)

Detectar variantes de hemoglobina neutras

VWD1 A, Wavelength=215 nm (GLOBINAS\7AGOS092.D)

40.517

50.775
mAU

400
β α
350

300

250 heme

Avaliar, na presença de níveis de Hb F

26.733
200

AγΙ
150
γ
δ

63.757
aumentados, as cadeias γ, G A γ I, A γ T da Hb F
100

37.329

48.513
35.984

54.244

65.184
43.652

57.896
45.740

67.478
50

25 30 35 40 45 50 55 60 65 min

HPLC fase reversa das cadeias de globina

Estudos de afinidade da hemoglobina para o O2

Sistema automático que permite determinar a

curva de dissociação do O2 da oxihemoglobina.

Hemox Analyzer

A curva de dissociaç
dissociação da oxihemoglobina
relaciona a % de hemoglobina saturada com
oxigé
oxigénio com a pressão parcial de O2 em contacto
com o sangue.

7
 Fluxograma do diagnóstico laboratorial
Eritrograma com Focagem isoeléctrica
índices eritrocitários

VGM < 80 fl Banda FIE

zona HbS Banda FIE
HGM < 27 pg
(Fe/CTFFe) x 100>16%

Teste solubilidade-HbS HPLC troca catiónica

Quantificação da Hb A2
HPLC troca catiónica +
HPLC troca catiónica
+
Quantificação da Hb F
HPLC troca catiónica
Estudo cadeias e
TS = positivo
TS = negativo
+ globina RP-HPLC
+
Hb A2 ↓ TRR de acordo
Hb A2 ↑ Hb A2 N ou ↓
Hb F ↑ com HbS
Hb F N ou ↑ Hb F N Identificação cadeia
presuntiva α ou β
HbD
Portador β Suspeita δβ Identificação
Suspeita portador α Identificação presuntiva,
talassémia talassémia Identificação Biologia
talassémia presuntiva HbS HbC, HbE
presuntiva Hb molecular
(estudos (estudos
Se HGM<25pg Lepore DG
familiares e familiares e
estudo do Suspeita portador α0 estudo do
cônjuge ) talassémia cônjuge ) (estudos familiares e estudo do
cônjuge )

Portador de β-talassemia
Sexo masculino Hemograma Focagem Isoeléctrica
adulto
caucasiano Hb=12,6 g/dL
G.V.=6,21x1012/L
Ht=0,386 L/L C
controlo

S
VGM=62,2 fL F
HGM=20,3 pg A
CHGM=32,6 g/dL
RDW=16,4%

Cromatografia de troca catiónica

% Hb A2=4,3

%Hb A2= 5,4

%Hb A2=5,1

8
 Sexo feminino
33 anos
Portador de Hb S
Hemograma Focagem Isoeléctrica Teste de solubilidade:
Hb=12,4 g/dL
Focagem Isoelé
Isoeléctrica
Hb S controlo
G.V.=4,52x1012/L
Hct=0,379 L/L C
VGM=83,9 fL S Positivo
HGM=27,5 pg F
CHGM=32,7g/dL A
RDW=13,7%

Cromatografia de troca catiónica

% Hb S = 33,8 Hb S

“janela”S/C
37,5%

Sexo feminino Portador de Hb D

adulto

Hemograma Focagem Isoelé

Isoeléctrica Teste de solubilidade:

Hb=13,2g/dL
Hb D
G.V.=4,07x1012/L
Hct=0,399 L/L C
controlo

VGM=98,1 fL Negativo
S
HGM=32,5pg F
CHGM=33,1 g/dL A
RDW=12,3%

Cromatografia
α Área α = 370,025
Área não α = 378,854
βD-Punjab

Hb D= 37,0% β
Variante Hb cadeia β

TRR= tr βx / tr β
Heme
Hb D-Punjab = 40,9%
δ

HPLC troca catiónica da hemoglobina

HPLC fase reversa das cadeias de globina

9
Sexo masculino
44 anos
Portador de Hb E
Hemograma Focagem Isoeléctrica
Hb=14,5 g/dL
G.V.=5,61x1012/L
Hct=0,418 L/L C

controlo
VGM=74,5 fL S
HGM=25,2 pg F
A
CHGM=33,8 g/dL
RDW=13,3%

Cromatografia
Área α = 399,354
β α
Hb E elui na “janela Área não α = 396,737
“Hb A2
Hb E Variante Hb cadeia β
Heme
% Hb E=29,8 βE
TRR= tr β x / tr β

δ Hb E = 23,0%

HPLC fase reversa das cadeias de

HPLC troca catió
catiónica da hemoglobina globina

Variantes de hemoglobina raras e neutras

Métodos usados para a detecção de variantes de Hb:

Focagem isoeléctrica ou electroforese

HPLC de troca catiónica

Estas técnicas não detectam variantes neutras.

A cromatografia liquida de alta eficiência de fase

reversa pode ser usada para detectar e quantificar ,
este tipo de variantes, que diferem apenas na sua
hidrofobicidade.

10
 Variantes de hemoglobina raras e neutras
Hb Malmö /Hb Palmela
Sexo masculino Hemograma Focagem Isoeléctrica
14 anos Hb= 17.2 g/dL
G.V.= 5,36x1012/L C
Eritrocitose

controlo
Hct= 0,503 L/L S Hb Malmö
VGM= 93.9 fL F
HGM= 32.1 pg
A
CHGM= 34.2 g/dL
RDW= 12.4%

α
βX
β
Cadeia beta variante Hb Malmö
Malmö
47.5%
heme
αx

Cadeia alfa variante Biologia molecular

δ
20.6% DG

HPLC fase reversa das cadeias de globina

Hb Malmö /Hb Palmela

A mutaç
mutação no codão 15 (GCC>GTC)
(GCC>GTC) do gene alfa 1 causa a substituiç
substituição
da alanina por valina na posiç
posição correspondente na cadeia alfa globina

Variante de hemoglobina assintomá

assintomática:

 Hb Palmela: substituiç
substituição da alanina por valina
Aminoá
Aminoácidos com cadeias laterais alifá
alifáticas de
tamanho similar que não parecem alterar a
geometria da região
Alanina
Valina
 Eritrocitose:
Eritrocitose: Hb Malmö
Malmö (afinidade para o O2 aumentada)

 Estudos familiares: pai e irmão ,heterozig

,heterozigó
óticos para Hb Palmela-
Palmela-
fenó
fenótipos hematoló
hematológicos normais

11
 Variantes de hemoglobina raras e neutras

Hb Loves Park
anemia
microcítica, hipocrómica

Sexo/ M/2 anos

idade Área α = 321,221
α
Área não α = 310,098
RBC 3.70
(×1012/L)
Hb (g/dL) 9.2 βA βX
Variante Hb
cadeia β
Hct (L/L) 0.277
48.4%
MCV (fL) 74.9 heme

MCH (pg) 24.9

δ
MCHC 33.3 Biologia
(g/dL) molecular
RDW (%) 14.1 DG

HPLC fase reversa das cadeias de globina

Variantes de hemoglobina raras e neutras

Hb Loves Park

Leucina → fenilalanina - posiç
posição 68 da cadeia β globí
globínica

São ambos aminoá

aminoácidos hidrofó
hidrofóbicos
(substituiç
(substituição de um aa por outro com uma
difí
difícil detecç
detecção
cadeia lateral igualmente neutra)

Fenilalanina
Cadeia lateral maior dimensão
Posiç
Posição interna-
interna- bolsa heme

Diminuição da afinidade para O2

12
 PNCH - Janeiro – Julho 2009
Casuí
Casuística de portadores de hemoglobinopatias -PNCH-
PNCH- Janeiro - Julho 2009

Nº casais em
ARS Nº de rastreios Total rastreios positivos % rastreios positivos
risco
Lisboa 413 27 6,5 3
Algarve 225 61 27,1
Alentejo 169 15 8,9
Leiria 13 1 7,7
Total 820 104 12,7 3

450
413
400
Nº total rastreios
350
Nº rastreios positivos
300 Casais em risco

250
Nº amostras

225

200
169

150

100
61
50 27
15 13
3 1
0
Lisboa Algarve Alentejo Leiria ARS

Casuí
Casuística de portadores de hemoglobinopatias -PNCH-
PNCH- Janeiro - Julho 2009

PNCH - Janeiro – Julho 2009

Casuí
Casuística de portadores de hemoglobinopatias –PNCH – Janeiro - Julho 2009
Total % %
Nº de Outras var
ARS rastreios rastreios Port β tal % Port β tal Port Hb S % Port Hb S Outras
rastreios Hb
positivos positivos var Hb

Lisboa 413 27 6,5 3 1,3 24 5,8 0 0

Algarve 225 61 27,1 39 17,3 21 9,3 1 0,4

Alentejo 169 15 8,9 8 4,7 5 3,0 2 1,2

Leiria 13 1 7,7 0 0,0 0 0 1 7,7

Total 820 108 12,7 50 6,1 50 6,1 4 0,5

61
60 30,0
Total rastreios positivos 0,4
% Outras var Hb
50 Port b tal 25,0
39 9,3
Nº de casos

% Port Hb S
Port Hb S
40 20,0
% de casos

Outras var Hb % Port b tal

30 27
24 15,0
21
20 15 1,2
10,0
8 17,3
10 3 5 3,0
1 2 1 1 5,0 5,8 7,7
0 4,7
0,0 1,3
Lisboa Algarve Alentejo Leiria ARS
Lisboa Algarve Alentejo Leiria ARS

Casuí
Casuística de portadores de hemoglobinopatias -PNCH-
PNCH- Janeiro - Julho 2009 Casuí
Casuística de portadores de hemoglobinopatias -PNCH-
PNCH- Janeiro - Julho 2009

13
 Hemoglobinopatias - Janeiro – Julho 2009
Casuí
Casuística de portadores de hemoglobinopatias –PNCH – Janeiro - Julho 2009
Nº Total total
Nº rastreios % Port b Port Hb % Port Hb %outras
de % Port b tal outras var Alfa tal
positivo Positivos tal S S var Hb
rastreios Hb

Utentes- INSA 187 34 18,2 14 7,5 16 8,6 4 2,1 39

INSA (DG; IJM) 61 21 34,4 12 19,7 7 11,5 2 3,3 1

Hospitais 53 15 28,3 2 3,8 11 20,8 2 3,8 28

Lab Privados 57 24 42,1 11 19,3 5 8,8 8 14,0 1

Total 358 94 26,3 39 10,9 39 10,9 16 4,5 69

% Port b tal % Port Hb S %outras var Hb

200 187 45,0
Nº Total de rastreios
Nº rastreios positivos
40,0

150 35,0 14,0

3,3
Nº de amostras

30,0
11,5 3,8

% de casos
25,0 8,8
100
20,0
2,1
61 57 15,0 20,8
53
8,6
50 10,0 19,7 19,3
34
21 24 5,0
15 7,5
3,8
0,0
0
Utentes- INSA INSA (DG , CGMJM) Hospitais Lab Privados Utentes- INSA INSA (DG; IJM) Hospitais Lab Privados

Casuí
Casuí stica de portadores de hemoglobinopatias -PNCH-
PNCH- Janeiro - Julho 2009 Casuí
Casuí stica de portadores de hemoglobinopatias -PNCH-
PNCH- Janeiro - Julho 2009

Variantes de hemoglobina: Hb C,Hb D, Hb Lepore,

Lepore, Hb Lisbon,
Lisbon,
Hb N-Baltimore,
Baltimore, Hb Malmö
Malmö, Hb Porto Alegre

Perspectivas futuras: referência

 Acreditação de ensaios – NP EN ISO15189 / 15195

 Utilização de materiais de referência, doseamento Hb A2

 Utilizaç
Utilização da espectrometria de massa (LCMSMS):

Método de referência doseamento da HbA2

14
Agradecimentos:

Departamento de Promoç
Promoção da Saú
Saúde e Doenç
Doenças Cró
Crónicas

Departamento de Gené
Genética

15