Detección rápida de infecciones del torrente sanguíneo de Bacillus anthracis mediante el uso de un

nuevo ensayo en el sistema GeneXpert

RESUMEN Bacillus anthracis es un agente selecto de nivel 1 con el potencial de causar rápidamente
una enfermedad grave. La identificación rápida de este patógeno puede acelerar el tratamiento y
reducir la mortalidad en caso de un ataque de bioterrorismo. Desarrollamos un ensayo rápido y
sensible para detectar la bacteriemia por B. anthracis utilizando un sistema que es adecuado para
las pruebas en el punto de atención. Un cartucho basado en filtro que incluía tanto el procesamiento
de muestras como las funciones de amplificación de PCR se cargó con todos los reactivos necesarios
para el procesamiento de muestras y la PCR anidada multiplexada. El límite de detección (LOD) y el
rango dinámico del ensayo se determinaron mediante la adición de B. anthracis ADN en mezclas de
PCR individuales y B. anthracis CFU en sangre humana. Se agregaron muestras de sangre de un
mililitro al cartucho de detección basado en filtro y se probaron para B. anthracis en un instrumento
GeneXpert. La especificidad del ensayo se determinó mediante el análisis de sangre enriquecida con
aislados bacterianos sin ántrax o mediante el análisis de muestras de sangre extraídas de pacientes
con no-B concurrente. Bacteriemia por antracis o controles no bacterianos. Los LOD de ensayo
fueron 5 equivalentes de genoma por reacción y 10 UFC / ml de sangre para ambos B. Anthracis
Sterne y V1B. Hubo un rango dinámico de 6 log10. La especificidad del ensayo fue del 100% para las
pruebas de no B. Aislamientos bacterianos de antracis y muestras de sangre de pacientes. El tiempo
de ensayo fue inferior a 90 min. Este sistema automatizado, adecuado para la detección en el punto
de atención, identifica rápidamente B. anthracis directamente de la sangre con alta sensibilidad.
Este ensayo podría conducir a una detección temprana y una terapia más rápida en caso de un
ataque de bioterrorismo.

INTRODUCCIÓN

Bacillus anthracis, el patógeno causante del ántrax, es un agente selecto de nivel 1, lo que significa
que tiene un gran riesgo de uso indebido deliberado y un potencial significativo para causar víctimas
masivas y otras consecuencias graves (https://www.selectagents.gov/history.html) (1). El ántrax
pulmonar o por inhalación se produce cuando las esporas de B. anthracis se inhalan en bronquiolos
y alvéolos y luego se transportan de macrófagos a los ganglios linfáticos mediastínicos, donde las
esporas germinan. El ántrax pulmonar induce una mediastinitis hemorrágica que puede conducir a
bacteriemia y meningitis. La tasa de mortalidad para el ántrax pulmonar no tratado es de 50 a 90%
(2, 3). Los ataques de ántrax de 2001, introducidos por cartas a individuos desprevenidos, dieron
lugar a 22 casos de ántrax, la mitad de ellos pulmonares y la otra mitad como resultado de
infecciones cutáneas. Cinco de las 11 víctimas con enfermedad pulmonar murieron (3, 4). Un
reciente brote de ántrax en Siberia llevó a la hospitalización de aproximadamente 100 casos
sospechosos, incluidos niños, y mató a un niño de 12 años (5). El ántrax puede progresar
rápidamente después de la exposición a las esporas, y el diagnóstico y tratamiento rápidos son
componentes críticos de la defensa contra la exposición al ántrax. Sin embargo, con las
metodologías existentes, actualmente lleva entre 12 horas y 5 días detectar B. anthracis en sangre
a través de hemocultivos, que se considera el estándar de oro (6, 7). Las pruebas de amplificación
de ácido nucleico (NAA) son potencialmente más rápidas y más sensibles que la detección de
patógenos utilizando hemocultivos (8). Sin embargo, la mayoría de los ensayos comerciales para B.
anthracis, incluido el sistema GeneXpert BA-plex (9), se realizan para probar polvos, contaminación
de la superficie o contaminación ambiental (9–13). Los ensayos de NAA actualmente disponibles no
pueden detectar rápidamente B. anthracis a partir de muestras de sangre de pacientes no cultivados
con sensibilidad suficiente para detectar la sepsis temprana (8, 14). Además, la mayoría de las
tecnologías de detección de ántrax actualmente disponibles requieren pasos manuales de
extracción de ADN que aumentan el tiempo y la complejidad del ensayo. En contraste, el sistema
GeneXpert detecta patógenos utilizando un cartucho de plástico simple que integra el
procesamiento de muestras y la detección de objetivos y requiere unos pocos pasos manuales para
realizar (9, 15, 16). Una prueba basada en GeneXpert para las esporas de B. anthracis se ha utilizado
en la oficina de correos de EE. UU. Desde 2004 (9, 17); sin embargo, hasta la fecha, esta tecnología
no se ha adaptado para analizar directamente especímenes humanos para el ántrax.

B. anthracis forma un linaje monomórfico dentro del grupo de Bacillus cereus y puede ser fácilmente
identificada erróneamente como otras especies de Bacillus (18, 19). B. anthracis puede diferenciarse
clásicamente del grupo B. cereus por la presencia de dos plásmidos importantes (pX01 y pX02). El
plásmido pX01 (toxina) transporta los genes que codifican el factor de edema (FE), el factor letal (LF)
y el antígeno protector (PA), que son necesarios para la virulencia; los genes capA a -D responsables
de la síntesis y degradación de la cápsula se encuentran en pX02. La ausencia de cualquiera de estos
dos plásmidos atenúa significativamente la virulencia de la cepa. El plásmido px01 a menudo está
presente en altos números de copias (24 a 243) y se encuentra en B. anthracis y en cepas
seleccionadas de B. cereus biovar anthracis, lo que lo convierte en un objetivo ideal para los ensayos
de NAA. En contraste, px02 es más pequeño (97 kb), está presente en números de copia más bajos
(1 a 32) (10, 20) y también se encuentra en otras especies de Bacillus, lo que disminuye
considerablemente su utilidad como un objetivo específico del ensayo de B. anthracis ( 20). Hemos
desarrollado un ensayo automatizado que es lo suficientemente sensible como para detectar el
ántrax directamente de la sangre del paciente no procesada. El ensayo utiliza un procesamiento de
muestras integrado y un cartucho de PCR y es adecuado para el uso en el punto de atención (15).
Aquí, demostramos el rendimiento analítico del ensayo de B. anthracis.

RESULTADOS

LOD analítica. El ensayo de detección de B. anthracis, basado en cartuchos, utilizó un enfoque de

PCR anidada para lograr el nivel más alto de sensibilidad necesario para detectar B. anthracis
directamente de las muestras de sangre del paciente sin una amplificación previa del cultivo. Las
diluciones en serie del ADN de B. anthracis Ames 35 en tampón mostraron que el ensayo tenía un
límite de detección (LOD) de 5 equivalentes genómicos (GE) por ml de muestra (Fig. 1A). Cuando B.
anthracis Sterne CFU se añadieron a la sangre humana, el LOD fue de 10 UFC / ml de sangre (Fig.
1B). Una prueba similar de la cepa patógena B. anthracis V1B mostró una LOD de 5 UFC / ml (Fig.
1C).

Estudios de rango dinámico en sangre total. El rango dinámico del ensayo de cartucho basado en
filtro (FB) se probó para confirmar que el ensayo no fue inhibido por números más altos del objetivo.
Las células de B. anthracis Sterne se enriquecieron en 1 ml de sangre total en cantidades de 1 a 106
UFC / ml. B. anthracis se detectó en todas las concentraciones de CFU por encima del LOD y luego
de forma variable por debajo del LOD en muestras de sangre con picos (Fig. 2).

Inclusividad y exclusividad. La inclusividad del ensayo se probó en todos los cultivos disponibles de
especies de B. anthracis, incluyendo Sterne, Weybridge, UM23, Ames35, B. virulenta. anthracis V1B,
y ADN genómico de Ames y B. cereus G9241 obtenido de BEI Resources (Manassas, VA). Todas las
pruebas se realizaron con 50 CFU / ml o GE / ml (5 el LOD) y 100 CFU / ml o GE / ml (10 el LOD). El
ensayo detectó B. anthracis en cada muestra analizada y B. cereus G9241. La cepa B. cereus G9241
alberga el plásmido pBCXO1, que es un 99.6% homólogo al plásmido pX01 de B. anthracis, y alberga
todo el complejo biosintético de toxina del ántrax. También causa enfermedad similar al ántrax en
ratones infectados (21). La especificidad del ensayo se evaluó mediante la adición de 1 ml de sangre
completa con 106 a 108 UFC / ml (o 106 a 108 equivalentes genómicos) de un amplio panel de
bacterias grampositivas y gramnegativas, incluidas 8 cepas diferentes de B. cereus y otras 6 especies
de Bacillus (Tabla 1). El ensayo no detectó ninguno de los patógenos no dirigidos, mostrando una
especificidad analítica del 100%. Por lo tanto, nuestro ensayo es altamente sensible y específico
para las especies que albergan el gen pX01 de B. anthracis.

Especificidad clínica. La especificidad del ensayo se probó adicionalmente utilizando muestras de

sangre de pacientes recogidas en tubos anticoagulados con k2-EDTA. Veinte de las muestras de
sangre se obtuvieron de pacientes que se sabe que son hemocultivos positivos para organismos
distintos de B. anthracis (Tabla 2) (11 especies de estafilococos; 2 cepas de Klebsiella pneumoniae,
Enterococcus faecalis y Escherichia coli; 1 cepa de Enterobacter especies de cloacas y bacilos
distintas de las antracis). Se obtuvieron 20 muestras de sangre adicionales de pacientes con un
estado de hemocultivo confirmado (sin crecimiento durante aproximadamente 48 h). El ensayo fue
negativo para todas las muestras analizadas, lo que indica una especificidad clínica del 100%.

Tiempo de resultado. El ensayo no tuvo otros pasos manuales, aparte de cargar el cartucho de
detección con sangre e insertar el cartucho en el instrumento GeneXpert. El tiempo total de ensayo
en el instrumento GeneXpert fue de 90 min.

FIG 2 Rango dinámico del ensayo de B. anthracis. Ensayo basado en cartuchos que muestra los
valores de umbral de ciclo para diferentes números de B. anthracis Sterne CFU incrustados en
sangre humana. Tres réplicas biológicas de 3 (n 9) se probaron en cada concentración.
DISCUSIÓN

En este estudio, pudimos adaptar la PCR sensible de amplicón pequeño anidado y las técnicas
integradas de procesamiento de muestras con manos libres utilizadas en nuestros ensayos sensibles
descritos anteriormente (15) para producir una prueba rápida, sensible y automatizada para B.
anthracis en sangre . La amenaza del bioterrorismo se convirtió en una realidad en los Estados
Unidos en 2001, cuando se enviaron cartas a las oficinas de los medios de comunicación y dos
senadores de los Estados Unidos (22, 23) a varias oficinas de medios de comunicación y dos esporas
de ántrax. Los diagnósticos mejorados son un componente importante de la defensa contra futuros
ataques. La exposición a agentes de tratamiento biológico como B. anthracis puede convertirse
rápidamente en una enfermedad grave; por lo tanto, los diagnósticos rápidos disponibles en el
punto de atención pueden salvar vidas. La detección temprana de un agente de tratamiento
biológico también puede ayudar a informar a los servicios de salud pública y de aplicación de la ley
encargados de identificar la fuente de la infección. Finalmente, la disponibilidad de diagnósticos que
pueden operar en plataformas existentes debería disminuir las barreras para las pruebas rápidas en
caso de un ataque de bioterrorismo. No hemos podido encontrar ningún ensayo comercial que
tenga la capacidad de detectar bacteriemia de ántrax de bajo nivel en la sangre extraída
directamente de un paciente sin preincubación o manipulación práctica de la muestra de sangre.
Por lo tanto, nuestro ensayo puede representar un avance significativo en la capacidad para
detectar infecciones por ántrax humano.

El sistema GeneXpert cumple con varios criterios necesarios para la detección en el punto de
atención de patógenos transmitidos por la sangre. Nuestra prueba requiere solo un paso manual,
cuando 1 ml de sangre se transfiere al cartucho de prueba después de una extracción de sangre.
Además del paso de transferencia de muestras, el sistema es altamente automatizado, lo que hace
posible que las pruebas se realicen después de un entrenamiento mínimo. Además, los ensayos se
realizan con cartuchos de un solo uso, lo que permite que las pruebas se realicen según sea
necesario en lugar de mantenerse hasta que se acumulen muestras suficientes para las pruebas por
lotes. Finalmente, un tiempo rápido para obtener resultados puede proporcionar información
procesable a los proveedores de atención médica durante el momento de un solo encuentro con un
paciente. En nuestros estudios anteriores, utilizamos con éxito el sistema GeneXpert para detectar
Mycobacterium tuberculosis (24, 25) y Staphylococcus aureus (15) directamente de muestras de
sangre clínicas y Francisella tularensis de la sangre de macacos infectados (26). El estudio actual
demuestra que un enfoque similar puede detectar B. anthracis bacilli en sangre con un LOD muy
bajo, lo que sugiere que este ensayo puede ser clínicamente útil incluso si se aplica en las primeras
etapas de una infección del torrente sanguíneo de B. anthracis, ya que la dosis infectiva estimada
Puede ser tan bajo como 10 esporas (27). El ensayo parece ser inclusivo, ya que detectó siete cepas
diferentes de B. anthracis y en una cepa similar a antracis de B. cereus. Estos resultados indican que
el ensayo también será positivo para cepas de B. cereus que contienen el plásmido pX01 que lleva
el gen pag, como B. anthracis. A partir del 12 de abril de 2017, HHS / CDC estableció una regla final
al agregar B. cereus biovar anthracis a la lista de agentes regulados de nivel 1 (28). Por lo tanto,
nuestro ensayo tiene el beneficio de detectar ambas especies de B. cereus que causan síntomas
similares al ántrax y requieren un diagnóstico y tratamiento rápidos, como lo hace el ántrax.
También demostramos que es probable que el ensayo tenga una alta especificidad, ya que no
reacciona de forma cruzada con otras especies de Bacillus desprovistas de px01. La especificidad
clínica del ensayo también fue del 100% en las pruebas de muestras de sangre de pacientes que
resultaron positivas para otras bacterias y levaduras y para muestras de sangre que fueron negativas
para el cultivo. Juntos, los resultados de este estudio sugieren que nuestro ensayo puede ser
aplicable para las pruebas en el punto de atención para el ántrax y que tiene un uso potencial en
caso de un futuro ataque de bioterrorismo.
MATERIALES Y MÉTODOS

Declaración de Ética. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional Rutgers-Newark
(IRB) con el número de protocolo P20150002274.

Preparación de células bacterianas y ADN genómico para experimentos analíticos. La Tabla 1

enumera los cultivos bacterianos y sus fuentes utilizadas en este estudio. La cepa B. anthracis Sterne
se obtuvo del Repositorio de Recursos de Investigación de Biodefensa e Infecciones Emergentes (BEI
Resources, Manassas, VA) y se utilizó para todos los estudios analíticos. Se preparó un inóculo inicial
cultivando las bacterias a 37 ° C en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI) (BD, Sparks, MD)
durante 16 a 18 h. Se hicieron diluciones en serie en caldo BHI y se colocaron en placas en agar BHI
para enumerar las UFC por mililitro, y se usaron diluciones concurrentes en experimentos analíticos.
Los estudios realizados con ADN genómico (a diferencia de los realizados con cultivos de células
vivas) utilizaron el ADN proporcionado por BEI Resources o se extrajeron directamente de cultivos
celulares al hervir las muestras a 95 ° C durante 20 minutos en una matriz de InstaGene (Bio-Rad
Laboratories, Hércules, CA).

Ensayo de PCR a base de cartuchos. Desarrollamos un ensayo de PCR anidada (ensayo BA-Pag) que
se dirigió al gen B. anthracis pag, que está presente en el plásmido px01 en aproximadamente 24 a
243 copias por célula (20, 29). El enfoque de PCR anidada se adoptó para aumentar la sensibilidad
de detección (15). La PCR BA-Pag consistió en dos conjuntos de cebadores diseñados para amplificar
secuencialmente un amplicón externo de 122 pb (PCR 1) seguido de un segundo amplicón interno
de 81 pb generado por dos cebadores anidados (PCR 2) (Tabla 3). También se incluyó un ensayo de
control interno (IC) que apuntaba a una secuencia de ADN dentro de Bacillus globigii (Tabla 3). El
ensayo de IC sirvió como control positivo para el procesamiento de muestras y la amplificación por
PCR. Los cebadores específicos de genes se diseñaron utilizando el programa PrimerSelect
(DNASTAR Lasergene v.8.1.3) y / o Primer3 (30, 31), y las balizas moleculares se diseñaron utilizando
el servidor web Mfold (32). La mezcla de PCR (mezcla maestra 1) contenía tampón de liofilización
patentado de Cepheid, MgCl2 2,5 mM, KCl 30 mM, 250 µM de cada nucleótido (desoxinucleósido
trifosfato), 0,25 µM de cada cebador (directo e inverso) y 12 U de Phoenix Taq ADN polimerasa
(Enzymatics, Beverly, MA). Las secuencias de cebadores y sondas se describen en la Tabla 3. Ambas
fases de la PCR usaron la misma mezcla maestra 1, excepto que para la segunda mezcla de PCR, para
lo cual se cambió el MgCl2 a 4 mM y se agregaron la sonda Pag de las balizas moleculares y la sonda
IC. detección de objetivos en tiempo real a concentraciones de 125 nM y 690 nM, respectivamente.
La mezcla maestra se agregó al cartucho ya sea húmedo (reactivos líquidos) o en forma de perlas
liofilizadas. La PCR BA-Pag se optimizó en un cartucho basado en filtro (FB) GeneXpert (15). Los
objetivos de esporas de B. globigii para el ensayo IC también se incluyeron en el cartucho FB. Para
realizar el ensayo, las muestras de prueba se colocaron en un cartucho FB, el cartucho se insertó en
el instrumento GeneXpert y luego todos los fluidos, incluido el procesamiento de la muestra y la
PCR anidada, se realizaron automáticamente siguiendo el procedimiento descrito anteriormente
(15).
Procesamiento de muestras de sangre en el sistema GeneXpert. Los estudios analíticos del ensayo
basado en cartuchos utilizando bacterias enriquecidas en la sangre humana hicieron uso de sangre
expirada del banco de sangre del Hospital Universitario (UH; Newark, NJ) (anticoagulado con citrato-
fosfato-dextrosa-adenina [CPDA]) que normalmente tendría ha sido descartado. Los identificadores
personales se eliminaron de cada unidad antes del transporte al laboratorio de investigación. La
sangre se refrigeró y luego se usó dentro del mes posterior a la extracción del banco de sangre. Los
valores de hematocrito se ajustaron al 40% diluyendo la sangre acumulada (hematocrito,
normalmente del 60% al 80%) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (0,01 M, pH 7,4) para
simular los valores normales de hematocrito en sangre de adultos. La sangre se enriqueció con B.
anthracis Sterne en la CFU deseada, y se añadió 1 ml de esta preparación a un cartucho FB
GeneXpert abierto como se describió anteriormente (15). La adición de la muestra de sangre
enriquecida al cartucho FB fue el único paso manual requerido en el procedimiento de prueba.

Todos los otros pasos necesarios para procesar la muestra de sangre, realizar la PCR anidada e
interpretar la salida de datos se realizaron automáticamente por el sistema de ensayo. Los fluidos
de este procedimiento automatizado fueron similares a los descritos en nuestro protocolo publicado
anteriormente (15), excepto por pequeños cambios necesarios para usar un nuevo cuerpo de
cartucho que contenía un tubo de PCR de 50 µl que aumenta la sensibilidad al duplicar la cantidad
de nucleico purificado ácido añadido a la mezcla de PCR. Los otros cambios fueron el uso de NaOH
0,5 N en lugar de Tris (50 mM) -EDTA (0,1 mM) -Tween (0,1%) (TET) tampón (pH 8) como uno de los
tampones de lavado y optimización del protocolo de PCR, que Ayudó a mantener el tiempo total de
ensayo a? 90 min. Durante el protocolo automatizado, las células de Bacillus globigii (control
interno) se mezclaron con tampón y se agregaron a la muestra de sangre. Luego, la muestra se
mezcló 1: 1 con NaOH 2 N, la sangre lisada se pasó a través del filtro de cartucho interno y las
bacterias capturadas en el filtro se lavaron exhaustivamente con NaOH 0,5 N y tampón TET. Las
perlas de vidrio presentes en la cámara de filtro fueron luego agitadas por un cuerno ultrasónico
para lisar las células bacterianas capturadas. Finalmente, aproximadamente el 80% del ADN total
eluido en el tampón TET se movió al tubo de PCR que está integrado en el cartucho FB para la
amplificación y detección de PCR. Se produjo una prueba positiva cuando los ciclos en tiempo real
frente a las unidades de fluorescencia para la baliza molecular específica de B. anthracis alcanzaron
un valor superior a 20. Una prueba negativa requirió una reacción IC positiva. Todas las pruebas
negativas con reacciones de CI negativas se consideraron inválidas.

Límite de detección. El límite analítico de detección (LOD) se determinó probando diluciones

seriadas del ADN genómico (B. anthracis Ames 35) en células tampón y / o bacterianas (B. anthracis
Sterne y B. anthracis V1B) impregnadas en sangre entera humana. Para este estudio, el LOD se
definió como el número más bajo de ADN enriquecido o CFU en el que el 100% de las muestras
analizadas fueron positivas.

Rango dinámico analítico. El rango dinámico analítico del ensayo se estudió en muestras de sangre
(n? 9) enriquecidas con 1, 10, 102, 103, 104, 105 y 106 UFC / ml de B. anthracis Sterne.

Inclusividad. La prueba de inclusión analítica se llevó a cabo en ambos 5? y 10? el LOD para 8 cepas
BSL2 diferentes de B. anthracis, B. cereus G9241 (obtenido de BEI Resources) y una cepa virulenta
de B. anthracis V1B (Tabla 1).
Especificidad analítica. La especificidad del ensayo de ántrax basado en cartuchos se determinó
mediante la adición de 106 a 108 UFC / ml de diferentes bacterias o especies de levaduras en la
sangre como se describe anteriormente. Cuando las células no estaban disponibles, el ADN de varias
especies bacterianas se disparó a concentraciones que variaban de

106 a 108 copias en la mezcla maestra de PCR externa. Se analizaron un total de 36 especies
bacterianas, incluidas 22 grampositivas (17 especies de Bacillus), 13 gramnegativas y 1 especie de
Candida (Tabla 1). Los aislamientos de prueba se obtuvieron de BEI Resources o del laboratorio de
microbiología de UH (University Hospital, Newark, NJ).

Especificidad clínica. Las muestras de sangre extraídas de pacientes con bacteriemia confirmada o
hemocultivos confirmados se obtuvieron como se describe anteriormente (15). Brevemente, los
tubos de sangre anticoagulantes k2-EDTA enviados para recuentos sanguíneos completos (CBC) al
Departamento de Hematología en la UH se guardaron en un refrigerador a 4 ° C durante 4 a 6 días
después de que se hubieran utilizado para fines de rutina y normalmente se habrían descartado.
Estos tubos usualmente tenían de 1 a 3 ml de sangre restante. Con la ayuda del laboratorio de
microbiología clínica de la UH, se identificó a los pacientes con hemocultivos positivos junto con la
fecha en que la muestra de sangre se había extraído del paciente para la prueba de hemocultivo.
Esta información luego se comparó con los tubos k2-EDTA almacenados según la fecha y los
números de identificación del paciente. Los identificadores de los pacientes se eliminaron o
modificaron por completo antes de que las muestras se tomaran del laboratorio clínico. Las
muestras de control con cultivo negativo se recogieron de forma similar después de confirmar que
el resultado del hemocultivo del paciente correspondiente fue negativo durante aproximadamente
48 h. Se utilizó un mililitro de sangre de estas muestras en todos los experimentos.

Análisis estadístico. El análisis estadístico estándar (promedio, desviación estándar y prueba t) se

realizó utilizando Microsoft Excel 2000 para Windows. Se realizó un ajuste de la curva de regresión
de Gompertz utilizando Sigma Plot v.13.