Taller laboratorio

1. Consulte un protocolo de extracción de ADN microbiano de otra casa comercial y describa

las similitudes o diferencias con el usado en la práctica.
2. ¿Qué es la integridad de un ADN? Investigue
3. ¿Por qué la integridad y purificación del ADN son cruciales para los experimentos que se
realizan en Biología Molecular? Investigue.
4. Investigue y describa la forma como puede conocerse la calidad (integridad y pureza) de
cualquier ADN extraído en laboratorio.

Solución

1. Bacterial Genomic DNA Mini-prep Kit (BayGene/Sigma-Aldrich):

este kit es aplicable tanto a bacterias Gram negativas como positivas y el ADN
extraído es adecuado para digestiones por endonucleasas de restricción, PCR y
Southern blots. Utiliza un sistema basado en sílica con un formato de
microcentrifugado y puede aislar ADN de hasta 50 kb de largo. En este kit las células se
lisan enzimáticamente en una solución que contiene sales caotrópicas, y el ADN es
adsorbido específicamente en la membrana de sílica, luego los otros componentes del
lisado son lavados y los contaminantes eliminados. Por último, el ADN es eluído en un
búfer apropiado.

BACMAX DNA purification kit (Epicentre Biotechnologies/Cambio):

es ideal para aislar ADN de clones de copia única de BAC (cromosoma bacteriano
artificial) o clones BAC CopyControl® inducidos, para aplicaciones tales como
secuenciación, identificación genética, PCR y preparación de bibliotecas de
secuenciación por “shotgun”. Se basa en un procedimiento de lisis alcalina modificado,
y utiliza una mezcla de EPICENTRE's® RiboShredder® y ARNasa junto con varios pasos
de precipitación selectiva para eliminar contaminantes.
2. El ADN es un ácido nucleico, con nucleótidos que forman las moléculas de DNA.
Consta de tres componentes esenciales: una base nitrogenada (purinas; A, G y
pirimidinas; C, T), azúcar desoxirribosa, y un grupo fosfato. El emparejamiento de las
bases nitrogenadas en dirección C-5´ a C-3´ por puentes de hidrogeno van formando
la estructura de doble hélice característica de ADN. Por lo tanto, la integridad del ADN
es aquella donde por medio de pruebas (electroforesis) se observen bandas
cromosomales integras, descartando ADN fragmentado, degradado o que no sea
visible a las centrifugación. Así mismo, tiene la característica que es de alto peso
molecular. Por último, que sea puro es decir, que el ADN no se encuentre
contaminado con productos resultantes durante la realización de la lisis celular como
proteínas (relacionada con mayor contaminación), membrana lipídica, enzimas
proteolíticas y demás componentes celulares y que no hallan restos de reactivos y
solventes usados durante el procedimiento

3. La extracción de ADN íntegro y sin contaminantes es esencial para tener éxito en la

obtención de datos genéticos, es el primer paso en la lista de técnicas moleculares que
nos llevarán a comprender mejor y conservar la diversidad biológica a partir del
conocimiento de genes y genomas que anteriormente era inaccesible para la
evolución , es importante conocer si el ADN obtenido está integro. La integridad del
ADN se puede observar mediante electroforesis en gel de agarosa . Si el ADN está
integro, se debe observar una banda estrecha cercana al pozo en que se colocó la
mezcla de ADN. Si está fragmentado, se observará una banda de más de un cm de
ancho o un sendero luminoso en el carril de la muestra . El ADN fragmentado dificulta
la amplificación de productos de PCR de alto peso molecular y afecta la
reproducibilidad de las técnicas.

4. Pureza

(espectrofotometría) la absorción ultra violeta puede ser para evaluar la pureza del adn
extraído.
Para una muestra del ADN , la relación entre la absorbancia a 260 y 280 nm (A260/A280)
es
1.8 . Una relación menor a 1.8 indica que la muestra se encuentra contaminada con
proteínas o solventes orgánicos como el fenol.
 Método de tinción con bromuro de etidio: es un compuesto fluorescente que se intercala
entre las bases del ADN . al producirse dicha unión cambia las propiedades de
fluorescencia del bromuro de etidio incrementándose la forma muy importante su
emisión fluorescente en presencia del ADN, la fluorescencia obtenida es proporcional a la
cantidad de ADN presente . sin embargo es poco sensible ya que también reacciona al
ARN. La interferencia se puede eliminar tratando las muestras con ARNasa

Integridad

(electroforesis) la electroforesis en gel de agarosa al 0.7 % (p/v) teñido con bromuro de

etidio posteriormente , el gel fue fotografiado bajo luz ultra violeta . si la muestra es
integrada presentara una banda de adn única perfectamente definida en la parte superior
del agarosa . una muestra del adn degradada presentara una estela a lo largo del gel que
sera mas pronunciada cuanto mayor sea la degradación de la muestra .

ARTICULOS DE REFERENCIA

1. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K182001
2. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/PrlnkGenmcBro_flr.pdf
3. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/purelink_genomic_man.pdf
4. file:///C:/Users/usuario02/Downloads/HB-2248-
002_1104551_HB_DNY_UltraClean_Microbial_0817_WW.pdf
5. https://mobio.com/us/shop/dna-isolation/di-microbial/dneasy-ultraclean-microbial-kit/
6. http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-028X2014000200003