AISLAMIENTO DE DNA DE ORIGEN VEGETAL Y SU CARACTERIZACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA
IDENTIFICACIÓN DE BASES PÚRICAS Y PIRIMÍDICAS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Objetivo:
 Aislar, purificar y caracterizar
espectrofotométricamente DNA de guayaba
 Identificar por cromatografía en capa fina las
bases nitrogenadas del DNA y RNA
aprovechando su propiedad para absorber
luz UV.
Introducción:
Los ácidos nucleicos representan la cuarta gran
clase de macromoléculas. Éstas, igual que las
proteínas y los polisacáridos, contienen
múltiples unidades monoméricas similares que
se unen en forma covalente para producir
polímeros grandes. El DNA y RNA son muy
apropiados para funcionar como portadores de
información genética en virtud de sus
estructuras covalentes. Los nucleótidos tienen
tres componentes: un azúcar con cinco
carbonos, uno o más grupos fosfato y un
compuesto nitrogenado débilmente básico
llamado base, las cuales son derivadas de
pirimidina (tiene un solo anillo de cuatro átomos
de carbono y dos de nitrógeno) y purina (tiene
un sistema de anillos fundidos de pirimidina y de
imidazol). Los dos tipos de bases son no
saturados, con dobles enlaces conjugados. Esta
propiedad hace que los anillos sean planos, y
también explica su capacidad de absorber la luz
ultravioleta.
El RNA está formado por: el azúcar D-Ribosa,
bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina
o uracilo) y el grupo fosfato.
El DNA esta formado por: el azúcar
desoxirribosa (el prefijo desoxi indica que el
carbono 2´ del azúcar carece del átomo de
oxigeno), bases nitrogenadas (adenina,
guanina, citosina o timina) y el grupo fosfato. El
DNA se encuentra en el núcleo de las células
eucarióticas y para su extracción es necesario:
un procedimiento mecánico para romper la
pared y membrana celular y así facilitar su
extracción, es importante mencionar que el
proceso debe ser llevado en condiciones en que
se inhiban las enzimas degradativas de los
ácidos nucleicos (nucleasas), además de que el
DNA obtenido debe ser purificado.
Análisis de la técnica:
A 15 g de guayaba se le adiciono una solución
de Tris/EDTA/NaCl, trisaminometano, que es un
regulador de pH, ácido
etilendiaminotetraacético, que es un agente
quelante, que puede crear complejos con iones
divalentes, dado que el Ca2+ es un cofactor
requerido por las nucleasas, su secuestro por el
EDTA evita la degradación del DNA, el NaCl …
El almidón de la guayaba se hidroliza por la
acción de la enzima amilasa, la cual rompe los
enlaces α 1, 4.
La solución saturada de NaCl provoca la
precipitación salina de proteínas y el SDS al 10
% es un compuesto tensioactivo aniónico
antipático, toma la parte lipídica de la célula y
forma semimicelas, además rompe enlaces no
covalentes de las proteínas, por lo que deshace
la membrana y libera el contenido de la célula.
Despues de la centrifugación se obtienen tres
fases: En la superior se encuentra el DNA, en la
media las proteínas coaguladas y en la inferior
la mezcla de cloroformo: alcohol isoamílico.
El sobrenadante se vierte en alcohol 96° para la
precipitación de los polímeros biológicos entre
los cuales se encuentra el DNA de guayaba
Resultados:
Se anexa:
Grafica 1. Espectro de absorción de DNA de
guayaba.
La determinación de la concentración de DNA
obtenido en mg/ mL se realizó por tres métodos
diferentes:
Método 1. Se anexa Figura 1. Nomograma para
el cálculo de las concentraciones de ácidos
nucleicos y proteínas.
Factor de dilución: 3
Valor obtenido del nomograma para ácidos
nucleicos: 0.016 mg / mL
 AISLAMIENTO DE DNA DE ORIGEN VEGETAL Y SU CARACTERIZACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA
IDENTIFICACIÓN DE BASES PÚRICAS Y PIRIMÍDICAS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
𝑚𝑔
∴ Á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑛𝑢𝑐𝑙𝑒𝑖𝑐𝑜𝑠 = 3(0.016) = 0.048 ⁄𝑚𝐿
Método 2: Mediante la fórmula:
𝐴260 0.656 ∗ 3
[𝐷𝑁𝐴] = ∗ 𝐹𝐷 =
22500 22500
−5 𝑔 𝑚𝑔
= 8.74𝑥10 ⁄𝑚𝑙 𝑜 𝑏𝑖𝑒𝑛 0.0874 ⁄𝑚𝑙
Método 3: Mediante la relación:
50 𝜇𝑔 𝐷𝑁𝐴 𝑝𝑢𝑟𝑜 − 1 𝐴260
𝑥 − 𝐴260
∴ 𝑥 = 𝐴260 ∗ 50 𝜇𝑔 𝐷𝑁𝐴 𝑝𝑢𝑟𝑜 ∗ 𝐹𝐷
𝑥 = 0.656 ∗ 50 ∗ 3
𝜇𝑔 𝑚𝑔
= 98.4 ⁄𝑚𝑙 𝑜 𝑏𝑖𝑒𝑛 0.098 ⁄𝑚𝑙
Calculo de la pureza:
𝐴260 𝑛𝑚
𝑝𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = ≈2
𝐴280 𝑛𝑚
0.656𝑛𝑚
𝑝𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = = 0.9252
0.709𝑛𝑚
Discusión de resultados:
El espectro de absorción del DNA puro presenta
un máximo a una absorbancia de 260 nm que
corresponde a los ácidos nucleicos y un mínimo
en 230 nm correspondiente a enlaces
peptídicos, sin embargo, los datos de la
espectrofotometría indican un comportamiento
distinto al mencionado, pues la absorbancia a
230 nm y 280 nm son mayores a 260 nm, éste
resultado indica la presencia en mayor cantidad
de proteínas y enlaces peptídicos en
comparación al DNA