INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL.

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS.
INGENIERIA BIOQÍMICA.

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS.

REPORTE DE PRÁCTICA CORRESPONDIENTE A:

“VERIFICACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE UN

ESPECTROFOTÓMETRO.”

 PROFRA. LORENA RODRÍGUEZ PAÉZ.

 DORANTES MOLINA ALBA PALOMA.

4IV1.
SECCIÓN 4

LUNES 04/ABRIL/2016.
INTRODUCCIÓN.
Los componentes básicos de los instrumentos analíticos de absorción, así como los de emisión y
espectroscopia de fluorescencia, son muy parecidos en cuanto a su funcionamiento y desempeño,
independientemente de que dichos instrumentos estén diseñados para radiación UV, visible o IR.
Debido a las semejanzas, con frecuencia se hace referencia a estos instrumentos, como instrumentos
ópticos. La mayoría de los instrumentos espectroscópicos de las regiones UV, visible e IR incluyen
cinco componentes:
1. Una fuente estable de energía radiante.
2. Un selector de longitud de onda que aísla una región limitada del espectro para hacer la medición.
3. Uno o más recipientes para la muestra.
4. Un detector de radiación, que convierte la energía radiante en una señal eléctrica que puede
medirse.
5. Un sistema que procesa y lee la señal que consta, actualmente, de una computadora
Las celdas, ventanas, lentes, espejos y elementos de selección de longitud de onda de un instrumento
de espectroscopia óptica deben transmitir la radiación en la región de la longitud de onda que se
emplea. El vidrio común, de silicato, es adecuado para la región visible y tiene la gran ventaja de bajo
costo. En la región UV, a longitudes de onda menores de 380 nm, el vidrio empieza a absorber, por
lo que se debe sustituir por sílice fundida o cuarzo. Tanto el vidrio como el cuarzo y la sílice fundida
absorben en la región IR a longitudes de onda mayores a 2.5 µm. Por lo tanto, los elementos ópticos
para espectroscopia IR comúnmente están hechos de sales de halogenuros o materiales poliméricos.
Para que se pueda utilizar en los estudios espectroscópicos, la fuente debe generar un haz de radiación
que tenga potencia suficiente que facilite su detección y medición. Además el voltaje de salida deberá
ser estable durante periodos razonables.
Las lámparas de tungsteno-halógeno, también llamadas lámparas de cuarzo-halógeno, contienen una
pequeña cantidad de yodo dentro de la cubierta de cuarzo que aísla al filamento; el cuarzo permite
que el filamento opere a una temperatura aproximada de 3,500 K, con lo cual se producen intensidades
mayores y aumenta el intervalo de la lámpara hasta la región UV. Las lámparas de deuterio se utilizan
para proporcionar una radiación continua en la región UV. Los instrumentos espectroscópicos para
las regiones UV y visible, normalmente están equipados con uno o más dispositivos que restringen la
radiación que se va a medir, a una banda estrecha para que el analito la absorba o emita. Estos
dispositivos aumentan mucho la selectividad y sensibilidad del instrumento.
Muchos instrumentos emplean un monocromador o un filtro para aislar para aislar la banda de la
longitud de onda deseada de manera que solo se detecta y se mide la longitud de onda que se desea.
Por lo general, los monocromadores emplean una rejilla de difracción para dispersar la radiación en
las longitudes de onda que la componen. El intervalo de longitudes de onda que pasa por un
monocromador, denominadas paso de banda espectral o ancho de banda efectiva, puede ser menor de
1 nm para los instrumentos más caro o mayor de 20 nm para los sistemas baratos.
Los filtros que se utilizan para las mediciones de absorción comúnmente son filtros de interferencia.
Estos filtros transiten radiación en un ancho de banda de 5 a 20 nm. La radiación que queda fuera de
la banda se elimina por medio de interferencia destructiva.
Los filtros tienen como ventajas que son sencillos, resistentes y de bajo costo. Sin embargo, un filtro
solo puede asilar una banda de longitudes de onda; para esta banda se debe utilizar un filtro diferente.
Además, los instrumentos con filtros de interferencia se utilizan solo para mediciones que se realizan
a una longitud de onda fija o que no se cambia con frecuencia.
Para obtener información espectroscópica, la energía radiante transmitida, fluorescente o emitida,
debe detectarse de alguna forma y convertirse en una cantidad que pueda medirse.
Un detector es un dispositivo que indica la existencia de algún fenómeno físico. Un transductor es
una clase de detector que transforma varios tipos de cantidades físicas y químicas en señales eléctricas
como carga eléctrica, corriente o voltaje. 1
OBJETIVO.
Verificar el rendimiento instrumental del espectrofotómetro número 11 ubicado en el cuarto de
espectrofotómetros del departamento de bioquímica “Dr. Guillermo Carvajal Sandoval” en base a
parámetros como exactitud tanto fotométrica como en su escala de longitud de onda, la presencia o
ausencia de luz parasita o dispersa, la existencia de proporcional fotométrica entre todos los
componentes del aparato y que no exista una variación en el ancho de banda a lo largo de la
verificación.
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME.
1. Exactitud de la escala de longitud de onda.

1.1 Método del filtro de tierras raras (Didimio).

Tabla 2. Espectro de transmisión del filtro de didimio.2
Longitud de onda %T Longitud de onda %T
[𝒏𝒎] [𝒏𝒎]
400 39,2 510 40,2
410 50,4 520 29,0
420 55,6 530 31,2
430 51,6 540 47,6
440 45,8 550 65,0
450 45,8 560 57,6
460 46,2 570 30,6
470 44,0 580 9,6
480 48,0 590 5,6
490 56,8 600 16,6
500 54,0

1
Skoog A, Donald M. Química analítica. México: McGraw-Hill; 2001. p. 592-598.
2
Longitudes de onda donde se presentaron picos.
 Espectro de transmisión del filtro de didimio.

70

60

50

40
%T

30

20

10

0
0 100 200 300 400 500 600 700
Longitud de onda (nm)

Longitudes de onda donde se presentaron picos.

Picos observados. Picos teóricos.
420 430
490 490
550 550
560

¿Coincidieron los máximos con las longitudes de onda informadas por el fabricante o a qué longitudes
de onda no fue así? El primer pico observado esta desplazado en 10 nm de forma negativa, es decir
a la izquierda. El segundo pico y tercer pico observado se presentaron a la longitud de onda teórica
indicada. Pero nosotros encontramos un pico más el cual se da a una longitud de onda de 560 nm.
1.2 Método de la solución de estándar (𝐍𝐢𝐒𝐎𝟒 ∗ 𝟔𝐇𝟐 𝐎 𝐚𝐥 𝟐𝟎%).
Tabla. 3 Espectro de transmisión de la solución de 𝐍𝐢𝐒𝐎𝟒 ∗ 𝟔𝐇𝟐 𝐎 𝐚𝐥 𝟐𝟎%.
Longitud de onda %T Longitud de onda %T
[𝒏𝒎] [𝒏𝒎]
380 8,2 490 91,2
390 5,4 500 93,6
400 5,4 510 93,6
410 7,4 520 91,4
420 14,2 530 88,8
430 27,6 540 87,4
440 45,4 550 84,0
450 59,4 560 75,8
460 68,6 570 69,2
470 77,2 580 61,4
480 86,2 590

La longitud de onda en la que se obtuvo el valor máximo de %T fue a 500 nm.

¿Cómo es la exactitud de la escala de longitud de onda del espectrofotómetro a esta longitud de onda?
La escala de longitud de onda del espectrofotómetro es exacta ya que la referencia teórica fue 500
nm.
Ventajas y desventajas de los métodos empleados para estimar la exactitud de la escala de longitud
de onda.
Los filtros presentan algunos inconvenientes: los picos son más anchos que los obtenidos con las
disoluciones y además existen variaciones entre las distintas series de fabricación del vidrio.
2. Proporcionalidad fotométrica.
Longitud de onda [𝒏𝒎] Absorbancia
530 0,052
540 0,058
550 0,076
560 0,095
570 0,120

𝑨 = 𝟐 − 𝒍𝒐𝒈% … fórmula utilizada para el cálculo de la absorbancia a través de los valores de %T de tabla
3.
 Gráfica de A vs. ƛ.

0.14

y = 0,0017x - 0,8713
R² = 0,9627
0.12

0.1

0.08
A

0.06

0.04

0.02

0
525 530 535 540 545 550 555 560 565 570 575
ƛ

Valores para:
Ordena al origen. - 0.8713
Pendiente. 0.0017
Coeficiente de correlación. 0,9627

¿Qué se puede concluir respecto a la proporcionalidad fotométrica en este intervalo de longitudes de

onda?
Que no existe una falla en la fuente de radiación, el monocromador, el detector o bien la presencia de
luz dispersa. Pues se esperaba un valor para el coeficiente de correlación de 1.
¿Qué relación existe entre la absorbancia y la longitud de onda en este intervalo de longitudes de
onda?
Existe una relación lineal entre A vs. ƛ.
3. Luz dispersa.
Valores de %T por el método de solución de 𝐍𝐢𝐒𝐎𝟒 ∗ 𝟔𝐇𝟐 𝐎 𝐚𝐥 𝟐𝟎%a 400 nm y filtros de 325-405 y
600-900 a 500 y 450 nm respectivamente.
Método %T
NiSO4 ∗ 6H2 O al 20% 5.2
Filtro de 325-405 0.2
Filtro de 600-900 0.2

No hay presencia de luz dispersa pues obtenemos un valor de 0.2 comparado con cero, que es el valor
que esperaríamos obtener. Esta puede darse por la presencia de polvo, esto debido a que el
monocromador no se encuentre bien sellado, pero es este caso podemos decir que tenemos ausencia
de luz dispersa.
4. Ancho de banda.

La variación en el ancho de banda se presenta cuando hay disminuciones o incrementos en el %T de

más de 3%T, en relación a los valores de referencia. Obtuvimos un valor de %T de 93,6 a 500 nm,
comparado con el %T a 500 nm obtenido para NiSO4 ∗ 6H2 O al 20% contenido en la tabla 3 al cual
le corresponde un valor de 93.6 podemos decir que no existe una variación en el ancho de banda. La
presencia de sustancias interferentes puede influir en los espectros de absorción de los compuestos,
así como las variaciones en la anchura de la hendidura (ancho de banda efectivo) en el
espectrofotómetro.
5. Exactitud fotométrica.

5.1 Método del filtro de transmisión.

Valor obtenido: %𝑇530 = 86.5
Valor de referencia %𝑇530 = 87
En base al valor obtenido en comparación con el de referencia, se puede decir que el aparato es exacto;
pues recordemos que se tiene un intervalo de variación del 5%T en el valor obtenido respecto al de
referencia.
5.2 𝑴é𝒕𝒐𝒅𝒐 𝒅𝒆 la solución de estándar de 𝐍𝐢𝐒𝐎𝟒 ∗ 𝟔𝐇𝟐 𝐎 𝐚𝐥 𝟐𝟎%.
Tabla 5. Exactitud fotométrica. 𝐌é𝐭𝐨𝐝𝐨 𝐝𝐞 𝐍𝐢𝐒𝐎𝟒 ∗ 𝟔𝐇𝟐 𝐎 𝐚𝐥 𝟐𝟎%.
Longitud de onda. 400 nm 500 nm
Parámetro.
Absorbancia esperada. 1.397 0.045
Tolerancia esperada. 1.328 – 1.466 0.042
Absorbancia medida. 1.284 0.026

En base a los resultado obtenido el espectrofotómetro no tiene exactitud fotométrica, pues la

absorbancia medida no se encuentra dentro de la tolerancia o el intervalo de valores de absorbancia
esperados para que el aparata se exacto.
6. Intervalo dinámico lineal de concentración.
Tabla 6. Intervalo dinámico lineal de concentración.
Tubo Concentración 𝐝𝐞 𝐍𝐢𝐒𝐎𝟒 ∗ 𝑨𝟒𝟎𝟎
𝟔𝐇𝟐 𝐎
1 1’ 0,00000 0,000 0,000
2 2’ 0,000038 0,022 0,020
3 3’ 0,000114 0,112 0,113
4 4’ 0,000266 0,263 0,264
5 5’ 0,000418 0,452 0,472
6 6’ 0,000570 0,610 0,622
7 7’ 0,000608 0,646 0,634
8 8’ 0,000684 0,710 0,702
9 9’ 0,000722 0,734 0,738
10 10’ 0,000760 0,770 0,770

Curva de calibración.
0.9

0.8 y = 1043.8x - 0.0036

R² = 0.9968
0.7

0.6

0.5
A

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 0.0006 0.0007 0.0008
-0.1
[]

El intervalo dinámico de concentraciones teórico es 1 obtenemos una correlación lineal de 0.9958,

observamos que a lo largo de del intervalo de concentraciones la respuesta es lineal entre la
concentración y la absorbancia.
Si el intervalo obtenido hubiese sido menor al esperado no se tendría un intervalo lineal de
concentraciones el cual nos indica una relación lineal entre la concentración y la absorbancia, pues
sabemos que a mayor concentración, se tienen una mayor absorbancia.
PREGUNTA EXTRA.
1. Señale dos causas que originen. 3
a) Luz extraña: Su presencia puede deberse a la presencia de polvo en el aparato o que el
monocromador no se centre bien sellado, pues recordemos que es el componente en el cual se
selecciona la longitud de onda a utilizar dejan así pasar solo un ancho de banda que contenga
dicha longitud.
b) Cambio en el ancho de banda: el ancho de banda es un intervalo de longitudes de onda de
radiación saliente de la rendija de salida de un monocromador medido en la mitad de un pico del
flujo radiante detectado. El ancho de banda espectral está en función del ancho físico de la rendija
de salida y que cuando el ancho de la rendija es demasiado grande las líneas vecinas pueden
traslaparse con el ancho de banda del instrumento.
c) Alteración de la respuesta relativa o rendimiento instrumental: Puede darse a nivel de:
1 Fuente de luz:
 Lámparas fundidas.
 Lámparas inadecuadas.
 Paso óptico bloqueado.
 Variaciones altas de voltaje.
2 Sistema disperso:
 Variación de ancho de banda.
 Mal sellado del monocromador.
3 Celdas:
 Material óptico inadecuado.
 Celdas mal colocadas.
 Celdas sucias.
 Absorción por reflexión de la luz incidente.
4 Fotodetector:
 Luz parasita.
5 Sistema de medida:
 Variación porcentual de incertidumbre.

3
A. Baeza. Química analítica instrumental I; Precisión es espectrofotometría. México: Facultad de química UNAM;
2006. p. 1-9.
 Tabla 7. Resumen de resultados de evaluación del funcionamiento del espectrofotómetro.
Parámetro estudiado. Valor de referencia. Valor experimental. Conclusión.
Exactitud de la Filtro de didimio. 430-490-550 420-490-550-560 Escala de longitud
escala de longitud de onda exacta.
de onda. NiSO4 500 500
∗ 6H2 O al 20%
No existe falla
Proporcionalidad R de 530 a 570 1 0.9627 en alguno de los
fotométrica. nm componentes del
aparato.
Filtro de didimio. 0 0.2
%T a450 nm
%T a 500nm 0 0.2 El aparato no
Luz dispersa. tiene luz parasita.

NiSO4 0 5.2
∗ 6H2 O al 20%
No hay variación
Acho de banda. %T a 500 nm 93.6 93.6 en el ancho de
banda.
Exactitud Filtro de vidrio
fotométrica. neutro. 86.5 87
%T a 530 nm El aparato es
NiSO4 exacto.
∗ 6H2 O al 20% 1.397 1.284
A a 400nm
A a 500 nm 0.045 0.026
Intervalo Intervalo lineal de
dinámico lineal de Regresión lineal 1 0.9968 concentraciones.
concentración.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
En base a los resultados, podemos decir que el aparato utilizado es exacto es la escala de longitud de
onda, esto porque presento la máxima lectura de transmitancia en la longitud de onda de referencia;
tanto por el método de solución de NiSO4 ∗ 6H2 O al 20% como por el filtro de didimio; aunque en
este último obtuvimos un pico más a una longitud de onda que no se encontraba en el valor de
referencia, presentando así una inconveniencia, pues los picos son más anchos que los obtenidos con
las disoluciones y además existen variaciones entre las distintas series de fabricación del vidrio. El
dispositivo presento proporcionalidad fotométrica, esto en un intervalo de longitudes de onda que
va de [530 − 590] 𝑛𝑚 para la solución de NiSO4 ∗ 6H2 O al 20%. Esto representa la “relación que
hay entre la intensidad de radiación registrada en el detector y la lectura arrojada por el transductor y
que al no haber una reducción en el intervalo de concentraciones no existe una falla en la fuente de
radiación, el monocromador, el detector o bien la presencia de luz dispersa4”. Pues se esperaba un
valor para el coeficiente de correlación de 1 y el valor obtenido experimental mente fue de 0.9627.
Corroboramos el hecho de que no se presentara luz dispersa o parasita, la cual consiste en que el haz
de luz no pasa a través de la muestra, esto puede deberse a la presencia de polvo en el dispositivo o
el mal sellado del monocromador, esperábamos un valor de 0 en el %T y el valor obtenido
experimentalmente fue de 0.2.

4
C. Acuña, M. Cabrera, P. Cervantes. Manual de prácticas de métodos de análisis. México: Departamento de
bioquímica; 2016. p. 32.
El ancho de banda del aparato no cambia en ningún momento a la hora de elaborar la verificación de
dicho espectrofotómetro, esto lo determinamos porque tomamos lectura nuevamente del %T en las
misma condiciones en que se tomaron las lecturas para el parámetro de exactitud por el método de
solución de NiSO4 ∗ 6H2 O al 20%, esto a 500 nm, longitud de onda en la cual se dio la mayor lectura
de %T, arrojando el mismo valor de 93.6. El espectrofotómetro utilizado presento exactitud
fotométrica para el método del filtro de transmisión, pero no para el método de la solución estándar
de NiSO4 ∗ 6H2 O al 20%. Esto puede deberse a que esta solución es más sensible, o bien por el hecho
de su almacenamiento y su exposición a los cambios en el ambiente, le lectura de absorbancia
obtenida experimentalmente, no entro en los intervalos de tolerancia. El dispositivo presento intervalo
dinámico lineal, esto en un intervalo de concentraciones que va de [0,000038 − 0,000760] 𝑀 de
NiSO4 ∗ 6H2 O. Pues se observa una respuesta lineal entre la absorbancia y la concentración. Se
esperaba un valor de correlación lineal de 1 y el valor experimental obtenido fue de 0.9968.
CONCLUSIÓN.
El rendimiento instrumental del espectrofotómetro numero 11 ubicado en el cuarto de
espectrofotómetros del departamento de bioquímica “Dr. Guillermo Carvajal Sandoval” es viable en
la exactitud de la escala de longitud de onda, y fotométrica, presento proporcionalidad de respuesta
entre la intensidad de radiación registrada en el detector y la lectura arrojada por el transductor. No
presenta luz parasita o dispersa y su ancho de banda no cambia durante las determinaciones
experimentales. Por lo tanto el rendimiento global del aparato es eficiente.
BIBLIOGRAFÍA.
 A. Baeza. Química analítica instrumental I; Precisión es espectrofotometría. México: Facultad de química
UNAM; 2006. p. 1-9.

 C. Acuña, M. Cabrera, P. Cervantes. Manual de prácticas de métodos de análisis. México:

Departamento de bioquímica; 2016. p. 32.

 Skoog A, Donald M. Química analítica. México: McGraw-Hill; 2001. p. 592-598.