PRUEBA DE LA RESAZURINA

La resazurina es otro indicador que se utiliza para detectar la reductasa microbiana. Esta se
reduce antes que el azul de metileno, es más sensible, por lo tanto los resultados se obtienen
antes. En su tiempo de decoloración forma una escala de colores que permite ver las
diferentes calidades. La forma oxidada es azul en la leche normal, la forma reducida es rosa y
existe una tercera forma, más reducida e irreversible que es incolora.

Una leche limpia conserva un color azulado, la gama de colores intermedios corresponde a
calidades decrecientes hasta decoloración completa en 1 hora para leches con cargas
microbianas muy elevadas.

COLORACION CALIDAD

Alilado Muy buena

Alilado rosado buena

Rosado alilado Regular

Rosado Medocre

Rosado blanco Mala

Blanco rosado Muy mala

Blanco Pésima

Material:

1. Baño de María a 37 ° C

2. Tubos de ensayo estériles

3. Pipetas de 1 ml. y l0 ml estériles

Reactivos

 Resazurina............................. 0,05 g

 Etanol 96°............................... l0 ml

 Agua destilada.........................cantidad necesaria para completar 100 ml

Se disuelve la droga en etanol y se completa en matraz aforado de 100 ml con agua destilada
hervida o esterilizada. Se guarda en frasco color caramelo, a una temperatura de 5 ó 6 ° C. En
estas condiciones la solución dura aproximadamente l0 días.

Técnica:
Colocar en tubos de ensayo estériles 1 ml de reactivo según se indicó su preparación y
agregarle con pipeta l0 ml de la leche a analizar, mezclar y llevar a Baño de María a 37 ° C e ir
observando cada 15 min, anotar la coloración al cabo de 1 hora.

Representa una modificación de la prueba de la reductasa, en que se substituye el azul

de metileno por la resazurina, colorante derivado de la oxazina. En un tubo esterilizado
se mezclan 10 ml de la leche con 1 ml de la solución colorante al 0,2 por mil en agua
destilada estéril. Después de mantener la mezcla durante 10° a 37°C se compara el
color resultante con una escala cuyos colores tienen los siguientes valores
comparativos:

I, de color azul; Calificación: muy buena = Reductasa: 5 horas o más.

II, de color azul-violeta; Calific.: buena = Reductasa: 2 a 5 horas.
III, de color rojo-violeta; Calific.: suficiente = Reductasa: 20° a 2 horas.
IV, de color rojo; Calificación: insuficiente = Reductasa hasta 20°.
V, incoloras Calificación: mala = Reductasa: hasta 20°.

También se pueden leer los colores en un Comparador de Lovibond.

Fuente: Biblioteca digital de la Universidad de Chile. Sistemas de servicios

de la información y Bibliotecas. “Determinación de reductasa en la leche”.

 NUMERACIÓN DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS VIABLES

Recuento en placa por siembra de superficie:
Materiales
o Placas con agar controlado dejado una noche en estufa en control d
e esterilidad (Plate Count).
o Realizar diluciones hasta 10-3
o Tubos tapa rosca.
o Aparatos Québec.
o Asa de Drigalsky.
o Baño maría
Procedimiento
o De cada dilución sembrar dos
placas por dilución agregando 0.1ml. de linóculo y usando una
espátula de Drigalsky expandir toda la muestra. Incubar
a 30 ºC x24 y 48horas.
o Realizar 1º lectura a las 24 horas y la 2º lectura a las 48 horas.
o Seguidamente hacer el recuento de las colonias en UFC/mL.
o De las diluciones anteriormente hechas se toma de la dilución 10-1
hasta la 10-3.
o Y de cada uno se siembra por agotamiento y estría en placas de agar
ENDO.
o Seguidamente se lleva a incubación a temperatura de 37º/ 24 horas.
o Observar crecimiento de bacterias coliformes.

i) Método de placa vertida - Profundidad:

  Primero se diluye la muestra a analizar.
 Luego se saca con una pipeta 1 ml de todas las diluciones y se vierten en dos
placas por dilución.
 Después de esto rápidamente agregamos el Agar Plate Caunt, homogenizamos
con 5 movimientos lentos de arriba hacia abajo y de derecha – izquierda.
 Para fines de la práctica solo trabajaremos con la dilución 10-3. Por lo que solo
utilizaremos 6 placas.
ii)Método de Superficie:

 De la dilución 10-¹, sacamos 1 ml y hacemos las diluciones hasta 10-6.

 Luego en una placa servida con Agar Plate Count, agregamos 1 ml sobre la
superficie.
 Inmediatamente procedemos a expandir el mililitro sobre la superficie con la
espátula de Drigalsky.
 Con fines de la practica solo se trabaja hasta la dilución 10-3 y con tan solo 1
placa por dilución
iii) Método de Goteo:

 Con una micropipeta sacamos 20 ul, y dejamos caer a manera de gota sobre
un lado de la placa con Agar Plate Caunt. Este procedimiento se realiza dos
veces en la misma placa en lados opuestos.
 Para fines del curso solo otilizaremos las soluciones 10-2 y 10-3.

Cultivo 10¯ 10¯ 10¯ 10¯⁶

³ ⁴ ⁵
10¯² 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml

Fuente: Matos L. et al. 2008. Control microbiológico de la leche.