Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
03.03.01 - физиология
АВТОРЕФЕРАТ
Москва, 2013.
Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики соматических клеток
Отдела вирусной и клеточной молекулярной генетики Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики
Российской академии наук
Защита диссертации состоится " 16 " декабря 2013 года в 15 часов 30 минут на
заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Московском государственном
университете им. М.В. Ломоносова» по адресу: Москва,119234, Ленинские горы, д. 1,
корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Клиническая депрессия является одним из наиболее
распространённых и тяжелых типов аффективных расстройств. Согласно прогнозу
Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), к 2030 г. депрессия станет ведущей
причиной бремени болезней в глобальном масштабе. Депрессия связана с
повышенным риском суицида, провоцирует развитие различных соматических
заболеваний и существенно ухудшает качество жизни. Несмотря на наличие
эффективных фармакологических методов лечения депрессии, существенная часть
пациентов (не менее 30%) невосприимчива к действию применяемых в настоящее
время антидепрессантов, вызывающих также широкий спектр негативных побочных
эффектов, несмотря на значительное улучшение их переносимости (Keitner et al.,
2006; Kennedy, Rizvi, 2009; Connolly, Thase, 2012). Таким образом, поиск
принципиально новых путей лечения депрессии является актуальным направлением
современной медицины и фармакологии.
Гетерогенность и многофакторность депрессии существенно затрудняют
исследование патофизиологии этого заболевания и поиск адекватной стратегии
лекарственной терапии. Точные патофизиологические механизмы, приводящие к
развитию депрессии, до сих пор остаются неизвестными, что ограничивает
разработку новых антидепрессантных подходов. Кроме того, не вполне ясно, каковы
молекулярные и физиологические механизмы ответа организма на
антидепрессантную терапию (Krishnan et al., 2008). Почти 50 лет моноаминовая
система мозга считалась основной мишенью действия антидепрессантов и
рассматривалась как точка фокуса исследований, направленных на изучение
молекулярных и физиологических механизмов развития депрессии. Однако к
настоящему времени достаточно очевидно, что понимание механизмов развития
депрессии и разработка новых стратегий терапии этого заболевания требуют
принципиально новых теорий возникновения депрессивных расстройств.
Одной из таких теорий является так называемая нейротрофическая модель
депрессии, основанная на данных о вовлеченности нейротрофических факторов,
регулирующих выживаемость нейронов, нейрогенез и нейрональную пластичность, в
процессы, лежащие в основе возникновения депрессии и антидепрессантных
эффектов (Duman, Monteggia, 2006). В частности, было показано, что клинически
применяемые антидепрессанты способны увеличивать экспрессию в гиппокампе
нейротрофического фактора мозга (BDNF) и нейротрофического фактора глиальных
клеток (GDNF) и/или их рецепторов (Nibuya et al., 1995; Karege et al., 2005; Liu et al.,
2012). В связи с этим представляется важным с фундаментальной и практической
точек зрения исследование наличия про- или антидепрессантной активности у
факторов, способных регулировать уровни нейротрофичесих факторов и их
3
рецепторов в гиппокампе. Ранее было показано, что периферическое введение
клинически применяемого синтетического аналога фрагмента 4-10
адренокортикотропного гормона (АКТГ) Семакса (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro)
стимулирует экспрессию BDNF и его высокоаффинных рецепторов в гиппокампе
крысы (Dolotov et al., 2006), что может указывать на потенциально возможную
активность данного пептида при депрессивных состояниях. Однако физиологические
и поведенческие эффекты Семакса и других меланокортинов при депрессии не
исследованы.
Достаточно реалистичной и широко используемой экспериментальной
моделью депрессии считается модель непредсказуемого хронического стресса (НХС),
предложенная Паулем Виллнером (Willner et al., 1987) и заключающаяся в
предъявлении животным комбинаций чередующихся мягких стрессоров, что в
течение нескольких недель может приводить к развитию состояний, сходных с
депрессией у человека и нормализуемых хроническим введением клинически
используемых антидепрессантов. Важно отметить, что данная модель вызывает
развитие ангедонии (снижение способности испытывать удовольствие) — одного из
двух, наряду со сниженным настроением, ядерных симптомов депрессии (Kennedy,
2008), и только этот ядерный симптом может быть исследован в модели in vivo
(обычно детектируемый у грызунов как снижение предпочтения сладких растворов
воде). Предметом данной работы являлось изучение влияния Семакса и ряда
родственных ему меланокортинов (семейство, включающее АКТГ и
меланоцитстимулирующие гормоны, их фрагменты и аналоги) на выраженность у
крыс эффектов НХС как экспериментальной стрессовой модели депрессии.
Цель исследования: проверка гипотезы о наличии у природных и
синтетических представителей пептидного семейства меланокортинов (Семакс, АКТГ
(4-10), α-меланоцитстимулирующий гормон (α-МСГ) и меланотан II)
антидепрессантноподобной активности в экспериментальной модели депрессии,
вызванной хроническим стрессом.
Задачи исследования:
• Изучить влияние Семакса на продукцию нейротрофического фактора GDNF в
культивируемых астроглиальных клетках крысы линии С6.
• Изучить влияние Семакса на продукцию нейротрофических факторов GDNF и
BDNF в гиппокампе крысы при остром периферическом введении.
• Изучить влияние хронического периферического введения меланокортинов на
выраженность эффектов НХС (ангедония, уменьшение набора массы тела,
гипертрофия надпочечников, изменение уровня BDNF в гиппокампе) у крыс.
Научная новизна работы. В представляемой работе впервые показана
4
способность Семакса дозозависимо стимулировать продукцию GDNF в
культивируемых астроглиальных клетках крысы линии С6. Впервые показано, что
острое внутрибрюшинное введение Семакса приводит к повышению уровней GDNF и
BDNF в гиппокампе крысы. Полученные данные согласуются с показанной ранее
способностью Семакса стимулировать уровень нейротрофина BDNF в гиппокампе
крысы при периферическом (интраназальном) введении и расширяют представление
о вызываемой Семаксом стимуляции продукции нейротрофических факторов
различных семейств. Обнаружена ранее неизвестная способность периферически
вводимых эндогенных и синтетических меланокортинов ослаблять ключевые
поведенческие и физиологические эффекты НХС (ангедония, замедление набора
массы тела) и предотвращать вызванное им снижение уровня BDNF в гиппокампе.
Получены данные, указывающие на вовлеченность меланокортиновых рецепторов 3 и
4 типа в осуществление этих эффектов. Обнаружено, что отложенное хроническое
периферическое введение Семакса и АКТГ (4-10) в условиях НХС эффективно
корректировало ангедонию и замедление скорости набора массы тела.
Научно-теоретическое и практическое значение работы. Полученные
данные свидетельствуют об антидепрессантноподобном действии периферически
вводимых представителей пептидного семейства меланокортинов в условиях НХС,
что, с учетом ранее известных депрессогенных эффектов центрально вводимых
меланокортинов, позволяет расширить представление о роли эндогенных
меланокортинов в регуляции поведенческих и физиологических эффектов стресса.
Практическая значимость работы связана с обнаружением способности
периферически вводимых меланокортинов значительно ослаблять в широко
применяемой экспериментальной модели депрессии выраженность ядерного
симптома депрессии — ангедонии. Следует отметить, что представители пептидного
семейства меланокортинов являются достаточно безопасными при периферическом
введении, а пептид Семакс на протяжении длительного времени является клинически
применяемым ноотропным и нейропротекторным лекарственным средством. Исходя
из очевидной потребности в новых фармакологических подходах к лечению
депрессии, полученные в представляемой работе данные могут быть использованы
для дальнейшего исследования возможности и эффективности применения
меланокортинов в терапии и профилактике депрессивных расстройств.
5
2) Обнаружена способность Семакса существенно ослаблять в
экспериментальной модели вызванной стрессом депрессии (непредсказуемый
хронический стресс) ядерный симптом депрессии — ангедонию и ряд других
эффектов непредсказуемого хронического стресса.
Апробация работы.
Материалы диссертационной работы были представлены автором на IV съезде
Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия,
2008), Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009), 5-й
Международной конференции «Биологические основы индивидуальной
чувствительности к психотропным средствам» (Поведники, Россия, 2010), VIII
Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток»,
(Звенигород, Россия, 2011), Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, Россия,
2013), а также на семинарах ОВКМГ Института молекулярной генетики РАН. В
завершенном виде результаты диссертационной работы были представлены на
заседании Ученого совета Института молекулярной генетики РАН 21 октября 2013 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 3 статьи в
журналах, рекомендованных ВАК для соискателей ученых степеней, и тезисы 8
докладов в материалах российских конференций.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и
методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения,
заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 153
страницах машинописного текста, включает 37 рисунков. Библиография включает
223 названия.
8
5. «Стресс-пептид-Отложенное введение» - процедура НХС, ежедневное введение
ФР с 1 по 14 день НХС, а с 15-го дня - ежедневное введение пептидов.
Тест на предпочтение сахарозы. Измерение предпочтения сахарозы
проводили согласно стандартной методике (Grønli et al., 2005) с модификациями.
Крысам в индивидуальных клетках (37х20х15 см) на ночь (18 ч) предоставляли
свободный доступ к двум предварительно взвешенным идентичным шариковым
поилкам (250 мл), одна из которых содержала питьевую воду, вторая – 1% раствор
сахарозы (Panreac, Испания) в питьевой воде. Крысы стрессовых групп получали
свободный доступ к питьевой воде по крайней мере за 24 ч до начала теста,
проводимого не ранее, чем через 24 ч после окончания предъявления стрессора.
Правое/левое положение поилок с сахарозой и водой регулярно менялось. Поилки
взвешивали и определяли количество потреблённых жидкостей. Предпочтение
сахарозы определяли как отношение массы потреблённого 1% раствора сахарозы к
суммарной массе потреблённой жидкости. Для каждой крысы определяли базальный
уровень предпочтения сахарозы за 3-4 дня до начала эксперимента.
Определение уровней белка BDNF и GDNF в гиппокампе крысы. Обработку
образцов ткани проводили на льду в полистирольных пробирках. Образцы
взвешивали и добавляли экстракционный буфер (Pollock et al., 2001; 10 мкл/ 1 мг).
Образцы ткани пипетировали и затем гомогенизировали политроном. Гомогенаты
разбавляли экстракционным буфером в 10 раз и ацидифицировали по стандартной
методике, указанной производителем (Promega, США). Полученные образцы
центрифугировали 60 мин (15000 g, 4ºC). Супернатанты замораживали и хранили при
-80 oC. Определение уровней BDNF и GDNF в полученных экстрактах проводили с
использованием наборов BDNF Emax и GDNF Emax (Promega, США), согласно
методике производителя.
Статистическая оценка результатов. Достоверности различий групповых
средних оценивали с помощью непараметрических критериев (тест Манна-Уитни) и
дисперсионного анализа (one-way ANOVA) с post-hoc поправкой (Fischer LSD test).
На графиках представлены средние значения групп с учетом стандартной ошибки
среднего (Mean+SEM), n – количество животных в группе. Обозначения уровней
значимости различий групповых средних в сравнении с контрольной группой: * -
p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001. Обозначения уровней значимости различий
групповых средних в сравнении с группой «Стресс-ФР»: # - p<0,05; ## - p<0,01; ### -
p<0,001.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние Семакса на уровень белка GDNF в культивируемых
актроглиальных клетках линии С6.
9
Ранее было показано, что ноотропный и нейропротекторный меланокортин
Семакс способен стимулировать экспрессию генов нейротрофинов BDNF и NGF в
культивируемых первичных астроглиальных клетках крысы (Shadrina et al., 2001).
Нами была изучена способность Семакса регулировать продукцию другого мощного
нейротрофического фактора, GDNF, в перевиваемых астроглиальных клетках крысы
линии С6, широко используемой для исследования глии in vitro. В качестве
положительного контроля использовали трициклический антидепрессант
амитриптилин, для которого была показана способность увеличивать продукцию
GDNF в астроглиальных клетках линии C6 (Hisaoka et al., 2001).
Как видно из данных, представленных на Рис. 1, Семакс дозозависимо
увеличивал уровень белка GDNF в кондиционированных средах культивируемых
клеток линии C6. Значимые отличия от контроля уровней GDNF в
кондиционированной среде через 4 дня после однократного введения пептида были
обнаружены для диапазона концентраций 1 пМ - 10 мкМ (1,5 — 4 кратная
стимуляция). Увеличение продукции GDNF также наблюдалось в присутствии
амитриптилина, что согласуется с ранее полученными данными (Hisaoka et al., 2001).
При этом не было обнаружено достоверного влияния Семакса в исследованных
концентрациях на жизнеспособность и пролиферацию клеток в МТТ-тесте (данные в
автореферате не приведены).
Таким образом, Семакс в широком диапазоне концентраций стимулировал
продукцию белка GDNF культивируемыми астроглиальными клетками линии С6.
GDNF является мощным фактором выживаемости различных типов клеток и
проявляет выраженную нейротропную и нейропротекторную активность
поддерживая рост нейритов и выживание нейронов (Connor B., Dragunow, 1998;
Airaksinen, Saarma, 2002). Показано, что GDNF вовлечен в генез и развитие
некоторых нейропатологий, в том числе, депрессии (Otsuki et al., 2008). Интересно,
что ряд антидепрессантов и атипичных антипсихотиков, проявляющих
нейропротекторную активность, также стимулируют экспрессию и продукцию GDNF
клетками линии C6 (Shao Z. et al., 2006; Hisaoka K. et al., 2001; 2007, 2008, 2011).
Далее мы изучили способность Семакса влиять на уровень GDNF в гиппокампе
крысы при периферическом (внутрибрюшинном) введении.
10
Рис. 1. Влияние
Семакса на уровень
GDNF в
кондиционированных
средах клеток линии
C6 через 96 ч после
введения. Данные
ИФА. Mean+SEM.
Значимые отличия от
контрольного уровня
отмечены: * - p < 0,05;
** - p < 0,01; *** - p <
0,001. Ами —
амитриптилин.
Средний уровень
GDNF в контроле:
4,3±0,4 пг/мл среды
180 180
160 * * 160
*
140 140
BDNF, % от контроля
GDNF, % от контроля
120 120
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
12
Влияние хронического внутрибрюшинного введения Семакса на
выраженность эффектов непредсказуемого хронического стресса.
Влияние хронического введения Семакса на предпочтение раствора
сахарозы крысами. Анегдония, то есть снижение способности испытывать
удовольствие, является одним из основных последствий НХС и ядерным симптомом
депрессии (Willner et al., 1987). В экспериментальных моделях депрессии широко
используемой мерой ангедонии является потеря предпочтения экспериментальными
животными сладкого раствора сахарозы воде.
Было проведено изучение влияния хронического внутрибрюшинного введения
Семакса в дозе 50 мкг/кг массы тела на выраженность ангедонии, вызванной НХС.
Как видно из данных, представленных на Рис. 3А, НХС вызывал существенное
снижение предпочтения сахарозы, что свидетельствует о развитии ангедонии у
хронически стрессированных животных. В то же время, предпочтение сахарозы в
группах «Стресс-Семакс» и «Контроль-Семакс» не отличалось достоверно от
контрольного уровня (Рис. 3А). При этом введение Семакса животным с выраженной
вследствие НХС ангедонией начиная с 15-го дня стрессирования приводило к
нормализации предпочтения сахарозы и отсутствию достоверных отличий этого
параметра между группами «Стресс-Семакс-Отложенное введение» и «Стресс-ФР»
через 2 недели после начала ежедневного введения Семакса на фоне НХС (Рис. 4Б).
Выраженность эффектов Семакса в условиях НХС сходна с действием клинически
применяемого трициклического антидепрессанта имипрамина (Papp et al., 2003).
Влияние хронического введения Семакса на скорость набора массы тела
крыс. Уменьшение массы тела относительно контрольного уровня является одним из
классических параметров-маркеров хронического стресса (Martí et al., 1994). В наших
экспериментах НХС вызывал существенное снижение набора массы тела.
Хроническое внутрибрюшинное введение Семакса в дозе 50 мкг/кг с начала
процедуры НХС приводило к нормализации набора массы тела (Рис. 4А). При этом
средняя масса тела крыс в группе «Контроль-Семакс» достоверно не отличалась от
контрольного уровня (Рис. 4А). Отложенное на 2 недели начало хронического
введения Семакса также существенно корректировало скорость набора массы тела
(Рис. 4Б). Таким образом, Семакс при НХС оказывал нормализующее действие на
скорость набора массы тела, сходное с действием антидепрессантов (Pechlivanova et
al., 2012).
Влияние хронического введения Семакса на относительную массу
надпочечников. Хроническая гиперактивация ГГН оси при хроническом стрессе
может приводить к гипертрофии надпочечников (Ulrich-Lai et al., 2006). Нами
13
обнаружено, что среднее значение относительной массы надпочечников в группе
«Стресс-ФР» (0,176±0,008 мг/г массы тела) было достоверно выше относительной
массы надпочечников в группе «Контроль-ФР» (0,123±0,005 мг/г массы тела) (p <
0,001). Кроме того, средняя относительная масса надпочечников в группе «Стресс-
ФР» достоверно отличалась от всех прочих экспериментальных групп, тогда как
средние относительные массы надпочечников в группах «Стресс-Семакс», «Стресс-
Семакс-Отложенное введение» и «Контроль-Семакс» достоверно не различались
между собой, а также не отличались от контрольного уровня. Таким образом,
хроническое введение Семакса приводило к нормализации относительной массы
надпочечников крыс; тот же эффект оказывает хроническое введение Семакса, на 15
дней отсроченное относительно начала НХС.
Влияние хронического введения Семакса на изменение уровня BDNF в
гиппокампе крыс. В постмортальных образцах гиппокампа больных, страдающих
депрессией, отмечалось снижение уровня BDNF, а лечение антидепрессантами
приводило к увеличению уровня BDNF в плазме и сыворотке крови больных,
страдающих депрессией (Castrén et al., 2007). Нами было проведено изучение влияния
Семакса на уровоень BDNF в гиппокампе крысы в условиях НХС. Как видно из
данных, представленных на Рис. 5, средний уровень BDNF в гиппокампе крыс в
группе «Стресс-ФР» был достоверно ниже соответствующего контрольного уровня.
Средний уровень BDNF в группе «Контроль-Семакс» не отличался от контрольного
уровня. Хроническое введение Семакса в дозе 50 мкг/кг на фоне НХС приводило к
увеличению уровня белка BDNF в гиппокампе крысы по сравнению с уровнем BDNF
у стрессированных крыс как в случае начала введения с первого дня НХС, так и при
отложенном введении. Следует отметить, что влияние Семакса на гиппокампальный
уровень BDNF сонаправлено с действием ряда антидепрессантов, хроническое
введение которых приводит к увеличению экспрессии BDNF в гиппокампе крысы как
на уровне мРНК (Nibuya et al., 1995), так и на уровне белка (Zhang et al., 2010).
Нами было проведено исследование влияния хронического введения Семакса
на уровни GDNF в гиппокампе крысы в условиях НХС, однако не было выявлено
достоверного изменения уровней GDNF под действием НХС и Семакса (данные в
автореферате не приведены).
14
110
Предпочтение сахарозы, %
100
90
80
70
60 * *** ***
50 Стресс-ФР
Стресс-Семакс
40 Контроль-ФР
Контроль-Семакс
30
-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35
День эксперимента
Стресс-ФР
Стресс-Семакс
110
Стресс-Семакс-Отложенное введение
Предпочтение сахарозы, %
## ##
100 Контроль-ФР # ##
90
*
80
*
70 *
60
50
40 * ** ** **
30
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40
День эксперимента
15
Рис. 4А. Влияние НХС и
500
хронического
Стресс-ФР
475 Стресс-Семакс внутрибрюшинного
450 Контроль-ФР
Контроль-Семакс
* * введения Семакса (50
* ###
Масса тела крысы, г.
425
400
* * ###### мкг/кг) на изменение массы
* * ######
375
350
тела крысы. Введение
** препаратов начинали в день
*********
325
300
* ** *** 1 (начало НХС). Mean+SEM,
275
250 ****** *** n=8-11. Уровни значимости
225
200
отличий от «Контроль-ФР»:
175 * - p < 0,05, ** - p < 0,005,
150
-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 *** - p < 0,001; от «Стресс-
День эксперимента ФР»: ### - p < 0,001.
140
Рис. 5. Влияние НХС и
120
### * хронического внутрибрюшинного
% от контроля
100
###
16
Влияние хронического внутрибрюшинного введения АКТГ (4-10) на
выраженность эффектов непредсказуемого хронического стресса. Семакс
является стабилизированным аналогом фрагмента АКТГ (4-10), и существует
значительное функциональное сходство между АКТГ (4-10) и Семаксом. Так, было
показано, что АКТГ (4-10) влияет на поведение (Isaacson et al.,1986) и обучаемость
крыс (Gaillard, Sanders, 1975), а также оказывает нейропротекторное действие и
способствует нейропластичности (Strand et al., 1993). Исходя из этого, нами была
изучена способность эндогенного меланокортина АКТГ (4-10) влиять на
выраженность эффектов НХС.
Влияние хронического введения АКТГ (4-10) на предпочтение раствора сахарозы
крысами. Согласно данным, представленным на Рис. 7, НХС вызывал существенное
снижение предпочтения сахарозы, что свидетельствует о развитии ангедонии у
хронически стрессированных животных. Хроническое введение АКТГ (4-10) в дозе
58 мкг/кг веса на фоне НХС приводило к нормализации уровня предпочтения
сахарозы, то есть предотвращало развитие ангедонии, вызванной НХС. Хроническое
введение АКТГ (4-10) в нестрессовой обстановке не приводило к достоверному
изменению предпочтения сахарозы относительно контрольного уровня. При этом
введение АКТГ (4-10) животным с выраженной вследствие НХС ангедонией начиная
с 15-го дня стрессирования приводило к нормализации предпочтения сахарозы и
отсутствию достоверных отличий этого параметра между группами «Стресс-Семакс-
Отложенное введение» и «Стресс-ФР» через 24 дня после начала ежедневного
введения АКТГ (4-10) на фоне НХС.
Влияние хронического введения АКТГ (4-10) на скорость набора массы тела крыс.
В данном эксперименте НХС вызывал снижение набора массы тела. Хроническое
внутрибрюшинное введение АКТГ (4-10) в дозе 58 мкг/кг с начала процедуры НХС
приводило к нормализации набора массы тела (Рис. 8). При этом средняя масса тела в
группе «Контроль-АКТГ» достоверно не отличалась от контрольного уровня. АКТГ
(4-10) существенно корректировал скорость набора массы тела и при отложенном на
2 недели начале хронического введения. Итак, хроническое введение АКТГ (4-10) на
фоне НХС приводило к нормализации скорости набора массы тела крыс как при
немедленном, так и при отложенном введении.
Влияние хронического введения АКТГ (4-10) на относительную массу
надпочечников. Средняя относительная масса надпочечников в группе «Стресс-ФР»
17
(0,142±0,007 мг/г массы тела) в данном эксперименте была достоверно больше (p <
0,001) массы надпочечников в группе «Контроль-ФР» (0,101±0,005 мг/г массы тела).
При этом средняя относительная масса надпочечников в группах «Стресс-АКТГ (4-
10)» (0,109±0,009 мг/г массы тела) и «Стресс-АКТГ (4-10)-Отложенное введение»
(0,108±0,006 мг/г массы тела) были достоверно меньше, чем средняя относительная
масса надпочечников в группе «Стресс-ФР» (p = 0,001 и p < 0,001, соответственно),
однако достоверно не отличались от контрольного уровня. В группе «Контроль-АКТГ
(4-10)» средняя относительная масса надпочечников составляла 0,114±0,005 мг/г
массы тела и статистически не отличалась от контрольного значения.
Таким образом, хроническое внутрибрюшинное введение АКТГ (4-10) в дозе,
эквимолярной дозе Семакса, способствует ослаблению эффектов НХС,
заключающихся в развитии ангедонии, уменьшении скорости набора массы тела и
увеличению относительной массы надпочечников. В исследуемой экспериментальной
модели депрессии АКТГ (4-10) проявлял подобное антидепрессантам действие как
при немедленном, так и при отложенном введении. Следовательно,
антидепрессантоподобное действие Семакса, выявленное в настоящей работе,
является не уникальной характеристикой данного пептида, а свойством, присущим и
эндогенному природному прототипу Семакса, фрагменту АКТГ (4-10).
110
100
# # ### ###
Предпочтение сахарозы, %
90
Контроль-ФР
80 Контроль-АКТГ (4-10)
Стресс-ФР
70 Стресс-АКТГ (4-10)-Отложенное
Стресс-АКТГ (4-10)
60
50 *
**
*** ***
40
30
-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
День эксперимента
425
### ###
тела крысы. Группы
400 ## «Контроль-АКТГ (4-10)» и
375
«Стресс-АКТГ (4-10)» -
350
#
введение АКТГ (4-10)
325
300
начинали в день 1 (начало
275 НХС); «Стресс-АКТГ (4-10)-
Отложенное введение»
*****
250
0 5 10 15 20 25 30 35 40
введение начинали в день 15
День эксперимента НХС (указано стрелкой).
Mean+SEM, n=8. Уровни
значимости отличий от «Контроль-ФР»: ** - p < 0,005, *** - p < 0,001; от «Стресс-ФР»: # - p
< 0,05, ## - p < 0,005, ### - p < 0,001. Уровни значимости указаны для первых по времени
экспериментальных точек при последующих достоверных отличиях.
110
Рис. 8. Влияние НХС и
100
хронического
Предпочтение сахарозы, %
90 внутрибрюшинного введения
α-МСГ (100 мкг/кг) на
80
предпочтение сахарозы
70
крысами. Введение α-МСГ
*** *** начинали в день 1 (начало
60 *
Стресс-ФР НХС). Mean+SEM, n=8-11.
50 стресс-МСГ
Стресс-Семакс Уровни значимости отличий
Контроль-ФР
40
контроль-МСГ от «Контроль-ФР»: * - p <
30 0,05, *** - p < 0,001.
-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35
День эксперимента
20
МСГ в нестрессовой обстановке не приводило к достоверному изменению уровня
BDNF относительно контроля.
Рис. 9. Влияние НХС и
хронического
500
475
внутрибрюшинного
450 введения α-МСГ (100
425 мкг/кг) на изменение
400
массы тела крысы.
Масса тела, г.
375
350 *# Введение α-МСГ
325
* #
начинали в день 1
****** ***
300
*** *** (начало НХС).
275
** *** *** Mean+SEM, n=8-11.
* **
Стресс-ФР
250
Стресс-МСГ
225 Стресс-Семакс Уровни значимости
Контроль-ФР
200
Контроль-МСГ отличий от «Контроль-
175
150
ФР»: * - p < 0,05, ** - p
-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 < 0,005, *** - p < 0,001;
День эксперимента от «Стресс»: # - p < 0,05.
160
140
100
***
80
гиппокампе крысы. Уровень BDNF в
60
«Контроль-ФР» - 16,4±0,4 пг/мг ткани
40
20
(100%). Уровни значимости отличий
0 от «Контроль-ФР»: * - p < 0,05, *** - p
Р Г
ь-Ф
Р
-М
СГ с-Ф - МС акс < 0,001; от «Стресс-ФР»: ### - p <
ол ль рес
есс -Сем
р ро Ст р сс
нт нт Ст ре 0,001.
Ко Ко Ст
21
10), развиваться при введении стабильного синтетического агониста MC3R/MC4
меланотана II (Hruby et al., 1995).
Влияние хронического введения меланотана II на предпочтение раствора
сахарозы крысами. Согласно представленным на Рис. 11 данным, НХС приводил к
достоверному уменьшению предпочтения сахарозы. При этом предпочтение сахарозы
в группах «Стресс-МТ2» и «Контроль-МТ2» не отличалось от контрольного уровня.
Таким образом, хроническое введение меланотана II в дозе 62 мкг/кг нормализовало
уровень предпочтения сахарозы на фоне НХС, что указывает на ослабление
выраженности ангедонии у крыс.
22
в группе «Контроль-МТ2». Таким образом, хроническое введение меланотана II в
дозе 62 мкг/кг на фоне НХС приводило к нормализации относительной массы
надпочечников.
Влияние хронического введения меланотана II на уровень BDNF в гиппокампе
крысы. Данные представлены на Рис. 13. НХС приводил к достоверному
уменьшению уровня BDNF в гиппокампе крысы, тогда как хроническое введение
меланотана II на фоне НХС приводило к нормализации уровня BDNF, причем эффект
меланотана II был сравним с эффектом эквимолярной дозы Семакса.
160
Рис. 13. Влияние НХС и хронического
140
внутрибрюшинного введения
120
меланотана-II (МТ2, 62 мкг/кг) на
в % от контроля
# ###
100
** уровни BDNF в гиппокампе крысы.
80
Уровень BDNF в «Контроль-ФР» -
60
11,3±0,8 пг/мг ткани (100%).
40
Mean+SEM, n=6-10.Уровни значимости
20
отличий от «Контроль-ФР»: ** - p <
0
Р 2 Р 2 м
-Ф -МТ -Ф МТ Се 0,005; от «Стресс-ФР»: # - p < 0,05, ### -
ол ь
ль е сс сс- сс-
нт
р ро Ст
р ре ре p < 0,001.
Ко нт Ст Ст
Ко
23
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В представленной работе впервые показана способность клинически
применяемого ноотропного и нейропротекторного пептида Семакс стимулировать
продукцию глиального нейротрофического фактора (GDNF) в культивируемых
астроглиальных клетках крысы линии С6. Обнаружено, что Семакс при однократном
внутрибрюшинном введении повышает уровень GDNF в гиппокампе крысы. Эти
результаты, в совокупности с ранее полученными данными о стимуляции Семаксом
системы нейротрофического фактора мозга и его рецептора (BDNF-trkB) в
гиппокампе крысы и свидетельствами вовлеченности нейротрофических факторов в
развитие депрессии и терапевтические эффекты антидепрессантов, позволили
выдвинуть гипотезу о возможной антидепрессантноподобной активности Семакса
при периферическом введении. Для проверки этой гипотезы нами была выбрана
широко используемая и хорошо охарактеризованная экспериментальная модель
вызванной стрессом депрессии — непредсказуемый хронический стресс (НХС).
Проведенное изучение влияния хронического внутрибрюшинного введения Семакса
на эффекты НХС у крыс выявили способность данного пептида существенно
ослаблять развитие ангедонии (одного из двух ядерных симптомов депрессии) и ряда
других последствий хронического стресса. Более того, аналогичная защитная
активность обнаружена как у родственных Семаксу эндогенных меланокортинов (α-
МСГ и АКТГ (4-10), так и у меланотана II, синтетического агониста
меланокортиновых рецепторов 3 и 4 типа. Таким образом, в данной работе впервые
показана антидепрессантноподобная активность в экспериментальной модели
депрессии природных и синтетических представителей пептидного семейства
меланокортинов. Полученные результаты расширяют представления о биологической
роли, возможных механизмах действия и терапевтическом потенциале
меланокортинов.
24
ВЫВОДЫ
26