Rev Cubana Farm 2002;36(1):56-61

Productos Naturales

Centro de Estudios de Biotecnología Industrial

Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad de Oriente

VALIDACIÓN DE UN MÉTODO POTENCIOMÉTRICO

PARA LA DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO AMÍNICO
EN HIDROLIZADOS PROTEICOS DE MICROALGAS
Humberto Joaquín Morris Quevedo,1 Ángel Almarales Arceo,2 Katherine Romero
Viamonte3 y Milene Vidal Colás3

RESUMEN
El sistema de valoración de aminoácidos o de mezclas de aminoácidos en presencia
de un exceso de formaldehído se utiliza como método analítico, particularmente
para monitorear la formación de aminoácidos libres durante la hidrólisis de las
proteínas. Se realizó la validación del método potenciométrico de valoración
con formaldehído (USP XXIV, 2000) para la determinación cuantitativa de
nitrógeno amínico en hidrolizados proteicos de la microalga Chlorella vulgaris.
Teniendo en cuenta la clasificación del método, se evaluaron los parámetros:
linealidad, precisión, exactitud y especificidad. La técnica es fiable ya que no es
afectada por interferencias provocadas por otras sustancias presentes en el
hidrolizado; además, el procesamiento estadístico de los datos evidenció la
linealidad, precisión y exactitud del método. El procedimiento validado es simple
y rápido, por lo que puede ser aplicado en la cuantificación de nitrógeno amínico
en lotes de hidrolizado proteico obtenidos en nuestros laboratorios.

DeCS: POTENCIOMETRIA; AMINOACIDOS/análisis; NITROGENO/análisis;

ALGAS VERDES; HIDROLISADOS DE PROTEINA/análisis; HIDROLISADOS
DE PROTEINA/uso terapéutico; CHLORELLA; DIETOTERAPIA;
BIOTECNOLOGIA.

1
Master en Bioquímica de la Nutrición. Investigador Agregado. Centro de Estudios de
Biotecnología Industrial, Universidad de Oriente.
2
Licenciado en Química. Aspirante a Investigador. División de Biotecnología Solar. Centro
de Investigaciones de Energía Solar.
3
Licenciada en Farmacia. División de Biotecnología Solar. Centro de Investigaciones de
Energía Solar.

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 Diversos han sido los estudios
experimentales y clínicos que han aportado
numerosas evidencias relacionadas con la
utilización de los hidrolizados proteicos
como preparados bioestimulantes en los
sectores médico-farmacéutico, biotecno-
lógico y nutricional. El uso de dietas
basadas en hidrolizados proteicos es muy
útil en la terapia nutricional de enfermedades
de la mucosa gastrointestinal, en pacientes
hipercatabólicos, síndromes de malnu-
trición1 y en la disminución de las reacciones
anafilácticas atribuidas a proteínas y
macropéptidos.2
Otros efectos terapéuticos asociados
con la administración de hidrolizados
proteicos están relacionados con el
incremento de la función destoxificadora del
amonio en el tejido muscular3 y por otra
parte, se ha sugerido que los hidrolizados
de las proteínas influyen en la regulación
endocrina de los procesos metabólicos.4
Entre los principales indicadores de
calidad de estos productos figuran los
parámetros relacionados con el contenido
de nitrógeno. Se destaca el N-amínico como
un indicador de gran utilidad para
monitorear la marcha de la hidrólisis y
establecer la eficiencia final del proceso. En
la literatura aparecen reportados varios
métodos para la determinación del N-amí-
nico en hidrolizados proteicos, como el
método gasométrico de Van-Slyke, por
valoración directa de los grupos amino
liberados en disolución acetónica con HCl
y α-naftol como indicador, o en disolución
de ácido acético glacial con ácido perclórico
y azul cresol como indicador y por
precipitación de las sales cúpricas de los
aminoácidos según el método de Pope y
Stevens.5
Por el alto grado de complejidad de
estos métodos, desde el punto de vista
57
práctico de ejecución, en la USP XXIV se
propone un procedimiento que consiste en
una valoración potenciométrica con
hidróxido de sodio en presencia de un
exceso de formaldehído. 6 El presente
trabajo se propone la validación de este
método potenciométrico para la
determinación de N-amínico en hidrolizados
proteicos de microalgas teniendo en cuenta
las regulaciones establecidas para asegurar
el cumplimiento de las buenas prácticas de
laboratorio (BPL).
MÉTODOS
Se utilizó un lote de hidrolizado proteico
de la microalga Chlorella vulgaris con una
concentración de N-amínico de 0,39 mg/mL
obtenido en el Centro de Investigaciones
de Energía Solar (CIES) con un preparado
de bromelina de producción nacional
(Centro de Bioplantas, Ciego de Ávila).
La determinación de N-amínico se
realizó según el método potenciométrico
descrito en la USP XXIV (2000) 6 en
presencia de un exceso de formaldehído.
Se utilizó como agente valorante una
disolución de hidróxido de sodio 0,1 mol/L.
Las valoraciones se efectuaron en un
potenciómetro digital Pracitronic MV 870
con electrodo combinado de vidrio calomel
y equipo de agitación magnética. Se calibró
de acuerdo con el procedimiento
establecido, midiendo los valores de pH de
las disoluciones tampones utilizadas en la
calibración del equipo después de cada 5 me-
diciones en el potenciómetro.7
Cada mililitro de hidróxido de sodio
0,1 mol/L consumido durante la valoración
equivale a 1,4 mg de N-amínico.
Los parámetros que se tuvieron en
cuenta para la validación del método fueron
linealidad, precisión, exactitud y espe-
cificidad.8
En el ensayo de linealidad se valoraron
hidrolizados de concentraciones compren-
didas entre 40-240 mg%. Se realizó un
análisis de regresión lineal simple y
adicionalmente, se aplicó la prueba de la t
de Student con la finalidad de determinar la
significación de la correlación lineal.9
En el ensayo de precisión se tomaron
en consideración los criterios de
repetibilidad y reproducibilidad. El análisis
de repetibilidad se realizó procesando una
muestra de concentración 125 mg% 20 veces
el mismo día bajo idénticas condiciones
experimentales y para la reproducibilidad se
procesó dicha muestra durante 20 d
consecutivos. Los resultados fueron
evaluados en términos de la desviación
estándar y el coeficiente de variación.
En el estudio de la exactitud del método
fueron analizadas por triplicado 5 muestras
de concentraciones comprendidas en el
rango lineal: 65, 125, 160, 190 y 220 mg%. Se
determinó la correlación entre las cantidades
teóricas con los valores encontrados
experimentalmente y se precisaron los
intervalos de confianza del intercepto y de
la pendiente para los niveles de signi-
ficación de 0,05 y 0,01.10
Con el objetivo de estudiar las posibles
interferencias de otras sustancias diferentes
TABLA 1. Resultados del ensayo de linealidad de la técnica para la determinación potenciométrica de N-amínico
Rango lineal (mg %)
Ecuación de regresión
Coeficiente de correlación (r)
Coeficiente de determinación (r2 )
Desviación típica del coeficiente de regresión (sb)
Coeficiente de variación del coeficiente de regresión (CV b)
Límites de confianza del coeficiente de regresión (b ± ttabsb)
Desviación típica del intercepto (sa )
Límites de confianza del intercepto (a± ttabsb)
Correlación lineal (t1 )
Volumen de NaOH 0,1 N consumido (mL) vs. mg% de N-amínico.
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de los aminoácidos y péptidos presentes
en el hidrolizado proteico, se añadió 1 mL
del hidrolizado de la microalga Chlorella
vulgaris a alícuotas de una solución
estándar de alanina con una concentración
de N-amínico de 2,5 mg/mL. Se compararon
los valores teóricos y experimentales de
N-amínico en las muestras y se realizó un
análisis de regresión lineal simple,
estimando las ecuaciones de regresión y
los coeficientes de determinación.
RESULTADOS
Los valores de pH de las disoluciones
tampones medidos después de cada 5 va-
loraciones realizadas en el potenciómetro
se mantuvieron dentro de los rangos
establecidos7 (7,00 ± 0,02 CV=0,28 % y
9,18 ± 0,04 CV=0,44 %), por lo que los
resultados de las valoraciones aportados
por el equipo se consideran correctos.
El método evaluado presentó una
respuesta lineal en el intervalo comprendido
entre 40 y 240 mg% (tabla 1) y el coeficiente
de correlación mostró un valor cercano a la
unidad. El coeficiente de variación del
coeficiente de regresión (pendiente) fue
menor que el establecido de 5 %11 y el
intervalo de confianza del intercepto incluye
al cero.
40-240
y=35,011x-0,067
0,9999
0,9998
2,09 x 10-4
5,97 x 10-4
35,0110 ± 0,0004
0,00733
(-0,0670) ± 0,0148
158,098
 En el ensayo de precisión (tabla 2), los y reproducibilidad están por debajo del 5 %.
coeficientes de variación de la repetibilidad Las variaciones introducidas en el ensayo
de reproducibilidad no influyeron sobre los
TABLA 2. Resultados del ensayo de precisión de la técnica resultados.
potenciométrica para la determinación de N-amínico
Las evidencias obtenidas en el estudio
de exactitud (tabla 3) demostraron la no
Ensayo
Criterios Repetibilidad Reproducibilidad
existencia de errores sistemáticos cons-
tantes ni proporcionales. En todos los casos
n 20 20
x (mg%) 125,63 132,06
el porcentaje de recobrado estuvo entre 98
S (mg%) 1,97 3,73 y 101 %.
CV (%) 1,60 2,80
En el ensayo de especificidad (tabla 4),
Concentración de N-amínico en la muestra: 125 mg %. el porcentaje de recobrado medio fue del

TABLA 3. Resultados del ensayo de exactitud de la técnica potenciométrica para la determinación de N-amínico

Ecuación de regresión y=(-2,9797) + 1,0247 x

Coeficiente de correlación (r) 0,9996
Coeficiente de determinación (r2) 0,9993
Desviación típica de la pendiente (sb) 0,0155
Desviación típica del intercepto (sa) 1,2801
Nivel de significación 0,05 0,01
Intervalo de confianza de la pendiente (b ± sb) 1,0247 ± 0,0365 1,0247 ± 0,0905
Intervalo de confianza del intercepto (a ± sa) -2,9797 ± 3,0121 -2,9797 ± 7,4771

TABLA 4. Análisis de la especificidad del método potenciométrico para la determinación de N-amínico (I). Estudio de recobrado

Solución mg de N-amínico mg de N-amínico Cantidad calculada Cantidad encontrada Recobrado

patrón (mL) añadidos del hidrolizado (mg de N-amínico) ( mg de N-amínico) (%)

1,0 2,50 0,39 2,89 2,95 102,1

2,0 5,00 0,39 5,39 5,35 99,2
2,5 6,25 0,39 6,64 6,65 100,1
3,0 7,50 0,39 7,89 7,84 99,4

TABLA 5. Análisis de la especificidad del método potenciométrico para la determinación de N-amínico (II). Ecuaciones de
regresión y parámetros asociados

Solución patrón + 1 mL
Solución patrón del hidrolizado

Ecuación de regresión y=62,857x + 1,428 y=61,280x + 12,23

Coeficiente de determinación (r2) 0,9992 0,9998
Desviación típica del coeficiente de regresión (sb) 1,350 3,920
Coeficiente de variación del coeficiente de regresión (CVb) 2,15 6,397
Límites de confianza del coeficiente de regresión (b ± ttab sb) 62,857± 3,942 61,280 ± 11,446

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100,2 % y la desviación estándar del 1,32 %.
Al aplicar el test t no se encontraron
diferencias significativas entre las
cantidades teóricas y las detectadas
experimentalmente con un grado de
probabilidad superior al 99 %. Por otra parte,
las ecuaciones de regresión (tabla 5) mostra-
ron que los valores de los coeficientes de
regresión (pendientes) correspondientes a
la solución patrón y a la solución patrón
más 1 mL del hidrolizado son muy similares.
DISCUSIÓN
La linealidad del método evaluado en
el intervalo comprendido entre 40 y 240 mg %
(coeficiente de correlación cercano a la
unidad) indica la existencia de una
proporcionalidad entre las concentraciones
de N-amínico y el volumen de NaOH 0,1 mol/L
consumido en las valoraciones, con un grado
de probabilidad superior al 99,9 %.
Los coeficientes de variación tanto de
la repetibilidad como de la reproducibilidad,
inferiores al 5 %, se consideran aceptables
para este tipo de análisis.
En el estudio de exactitud se excluyó la
existencia de errores sistemáticos constantes
y proporcionales al cumplirse los requisitos10
de que para ambos niveles de significación el
intervalo de confianza de la pendiente debe
incluir al 1 y el del intercepto al 0.
Los resultados del ensayo de especifici-
dad demostraron la no existencia de sustan-
cias que puedan interferir en el procedimiento.
El método de valoración potencio-
métrica validado para la determinación
cuantitativa de N-amínico en hidrolizados
proteicos de microalgas resultó lineal en la
región estudiada, es exacto, preciso y
específico, lo que garantiza la obtención de
resultados fiables. A diferencia de los otros
métodos citados en la introducción, la
técnica es simple y rápida y no requiere de
grandes cantidades de reactivos y
muestras, por lo que puede ser aplicado en
el control de la calidad de los lotes hidro-
lizados proteicos obtenidos en nuestros
laboratorios.

SUMMARY
The system of assessment of amino acids or of amino acid mixtures in the
presence of an excess of formaldehyde is used as an analytical method to monitor
the formation of free amino acids during protein hydrolysis. The potentiometric
method of assessment with formaldehyde (USP XXIV, 2000) was validated for
the quantitative determination of aminic nitrogen in protein hydrolysates from
Chlorella vulgaris microalga. The following parameters were evaluated taking
into account the classification of the method: lineality, accuracy, exactitude and
specificity. The technique is reliable, since it is not affected by interferences
caused by other substances present in the hydrolysate. Besides, the statistical
processing of the data proved the lineality, accuracy and exactitude of the
method. As the validated procedure is simple and rapid, it may be applied to the
quantification of aminic nitrogen in batches of protein hydrolysate obtained in
our laboratories.

Subject headings: POTENTIOMETRY; AMINO ACIDS/analysis; NITROGEN/

/analysis; ALGAE, GREEN; PROTEIN HYDROLYSATES/analysis; PROTEIN
HYDROLYSATES/therapeutic use; CHLORELLA; DIET THERAPY;
BIOTECHNOLOGY.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Recibido: 2 de octubre del 2001. Aprobado: 14 de noviembre del 2001.

M.Sc. Humberto Joaquín Morris Quevedo. Agramonte No. 58, entre Veteranos y Correoso, El Cristo,
Santiago de Cuba, CP 94310, Cuba.

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