DILUCIONES

En la mayoría de los ambientes, la densidad microbiana suele ser demasiado

elevada o baja para poder realizar una siembra directa de la muestra que de
buenos resultados en la enumeración de microorganismos. Esta situación hace
necesaria la dilución o la concentración de la muestra previa a la realización de
cualquier estudio. Además, las muestras sólidas requieren su dilución para facilitar
la manipulación y permitir trabajar con ellas como si fueran muestras líquidas.

En la mayoría de los casos, se trabaja con diluciones decimales. El caso más sencillo
es la preparación de 10 ml de la dilución 1/10 de la muestra. Para ello, se añade 1
ml de muestra a 9 ml de diluyente; es decir de cada 10 ml de esta dilución 1/10, 1
ml corresponde a la muestra. Expresándolo mediante una ecuación:

Se pueden preparar diluciones sucesivas. Por ejemplo, si se requiere la dilución

1/100, ó expresado de otro modo la dilución 10-2, a partir de esta dilución 1/10, se
elaboraría de acuerdo con la ecuación siguiente:

O bien directamente,

1
Como ya se ha indicado, en ocasiones, debido a la baja densidad de
microorganismos, es preciso concentrar la muestra mediante filtración o
centrifugación. Este hecho requiere que, para su manipulación posterior, los filtros
o los pellets obtenidos se re suspendan en un volumen determinado de diluyente.
En este caso es preciso determinar el factor de concentración con el que se
trabaja. Por ejemplo:

No sólo es necesario saber diluir o concentrar una muestra, también se debe

entender cómo aplicar correctamente los factores de dilución o de concentración
para establecer la densidad microbiana de una muestra. A continuación, se
plantean algunos problemas basados en la enumeración de microorganismos
mediante el método de contaje de Unidades Formadoras de Colonias (UFC).

**Cuando una solución es de uso corriente en un laboratorio, se suele preparar una

solución madre o stock, que se encuentra en una concentración mayor de la que
se utiliza. A partir de ésta, se realiza una dilución para preparar la solución a la
concentración de uso.

Vi = Volumen de la disolución madre = Volumen de la disolución madre necesario.

Ci = Concentración de la disolución madre.

Vf = Volumen que se desea preparar de la disolución final o diluida.

Cf = Concentración de la disolución final o diluida.

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Preparación de diluciones /Preparación de diluciones
seriadas
Hay veces que se necesitan cantidades muy pequeñas de una sustancia (por
ejemplo, un medicamento para un niño prematuro un inoculo de bacterias para
hacer siembras prematuro, un inoculo de bacterias para hacer siembras en
microbiología, etc.) y no se pueden medir o pesar esas cantidades por ser tan
pequeñas.

En estos casos se recurre a preparar una disolución de concentración elevada

(solución madre) y luego ir diluyendo progresivamente. Las diluciones más utilizadas
son al medio (1/2), al décimo (1/10) o al centésimo (1/100), pero se pueden
preparar cualquier dilución (1/3, 1/4, etc).

En las diluciones seriadas se prepara una prepara una serie o batería de o batería
de tubos en la cual cada tubo actúa como disolución madre del siguiente.

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CUENTA EN PLACA VERTIDO
Cuenta en placa

Se determina el número de microorganismos en una muestra en relación a las

colonias que forman, las UFC (Unidades Formadoras de Colonias). Se emplean
soluciones diluidas o diluciones de una muestra concentrada para que cada
colonia formada provenga de un solo microorganismo, aunque algunas
agrupaciones no pueden ser separadas por las diluciones. Se utilizan
principalmente para la cuantificación de bacterias, levaduras y hongos
filamentosos. Se reporta como: •UFC ****/unidad de volumen o peso.

2. Técnica de vertido en placa.

1. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación
y la adición de medio de cultivo se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar
las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular.

2. Inocular por duplicado, 1 mL de la dilución correspondiente en cada caja,

mediante pipeta estéril. Agregar de 18 a 20 mL del medio fundido y mantenido a
45 °C. Para homogenizar, mezclar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda,
6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a
adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr la completa
incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de
las cajas. Dejar solidificar. El tiempo transcurrido desde el momento en que la
muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de
cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

3. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como
testigo de esterilidad.

4. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo y a la temperatura que

se requiera, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, como se
indica en el cuadro 1.

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3. TÉCNICA DE EXTENSIÓN SUPERFICIAL EN PLACA.
1. Distribuir las cajas con el medio estéril en la mesa de trabajo de manera que la
inoculación se pueda realizar cómoda y libremente. Marcar las bases de las cajas
con los datos pertinentes antes de inocular.

2. Inocular por duplicado, 0.1 mL de la dilución correspondiente en cada caja,

mediante pipeta estéril. Para distribuir de manera homogénea, extender el inóculo
utilizando una varilla de vidrio estéril (en forma de escuadra o “L”) haciendo
movimientos giratorios de manera perpendicular al medio de cultivo, hasta lograr
la completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el inóculo se
absorba antes de incubar (se recomienda un tiempo de espera aproximado de 10
minutos). El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora
al diluyente hasta que finalmente se inocula en el medio de cultivo a las cajas, no
debe exceder de 20 minutos.

3. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como
testigo de esterilidad.

4. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo y a la temperatura que

se requiera, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, como se
indica a continuación.

5. Después de la incubación, contar todas las colonias desarrolladas en las placas

seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras; si se sospecha que es una
colonia de este grupo de microorganismos, se recomienda confirmar por
microscopía), incluyendo las colonias puntiformes. Si hay desarrollo extendido o un
número de colonias superior al del rango de sensibilidad del método, aplicar las
reglas indicadas en RESULTADOS. Realizar microscopía para resolver los casos en los
que no se puedan distinguir las colonias de las partículas pequeñas de alimento.
Utilizar el registrador para contar las colonias.