Guía de Práctica Microbiología 2019-I

UNIDAD ACADÉMICA
DE CIENCIAS BÁSICAS
GUÍA DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA
SEGUNDO AÑO
2019 - I
LIMA – PERÚ
1
PROPIEDAD INTELECTUAL: Unidad Académica de Ciencias Básicas - USMP
RESPONSABLE DE LA ASIGNATURA: Dr. Arturo Pareja Cruz
COORDINADOR DE LA ASIGNATURA: PhD. Edward Valencia Ayala
LIMA - PERÚ
2019-I
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INTRODUCCIÓN
El Manual de Prácticas de Microbiología tiene como objetivo orientar a los alumnos

a un mejor conocimiento y aplicación de los procedimientos de identificación y
aislamiento de la variada flora microbiana de importancia en medicina humana. La
microbiología es una disciplina que estudia la biología de los microorganismos capaces
de producir enfermedad.
Desde que se describiera por primera vez la morfología de las bacterias

(Leeuwenhoek. Siglo XVII), luego el aislamiento y diagnóstico de distintos
microorganismos sobre todo en las dos últimas décadas del Siglo pasado en la que se
inicia la denominada “Época dorada de la bacteriología” esta ha evolucionado
tremendamente. Continuamente se describen procesos infecciosos, así como situaciones
nuevas en los pacientes motivando ello la disponibilidad de información científica
relacionada con la microbiología clínica y la infectología.
Los avances tecnológicos con aumento de la automatización, el desarrollo de la

biología molecular, la química de los ácidos nucleicos, los avances en inmunología
clínica y los conocimientos de la patogenicidad microbiana hacen necesario la revisión
continua de los textos de microbiología.
Tenemos el convencimiento que esta orientación académica proporcionará a los

alumnos de la Asignatura de Microbiología los recursos para preveer el inicio del
padecimiento, así como la base para la orientación terapéutica y la prevención de las
enfermedades infecciosas.
Se da una relación concisa de los métodos de laboratorio empleados en el estudio de

las bacterias, hongos, rickettsias y virus. Con tal motivo serán expuestos conceptos y
ejercicios fundamentales, con lo que esperamos uniformar criterios acordes con la
actualizada tecnología.
Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodológicamente a fin de facilitar la

aplicación de los conceptos básicos y así llegar al diagnóstico de los diferentes procesos
infecciosos en humanos.
El objetivo de estas prácticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las

técnicas más comúnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiología y permitir la
observación experimental de los conceptos aprendidos durante las clases teóricas.
Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prácticas, no es una

compilación amplia del tema, sino un Manual que contiene los requerimientos básicos y
orientación, adecuando los recursos y procedimientos que contribuirán a cimentar la
formación integral del médico humano.
Como docentes, nos sentiremos satisfechos si al final del curso se han cumplido los
objetivos, utilizando los elementos y procedimientos de diagnóstico en el proceso
enseñanza – aprendizaje.
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REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA I
1. El alumno deberá ingresar al laboratorio con equipo de seguridad:

 Bata blanca hasta la rodilla y de manga larga (con su respectivo nombre y el logo de la
universidad bordado).
2. Para tener derecho a ingresar al laboratorio, el alumno debe entregar al inicio de cada
práctica:
 Guía de laboratorio con los aspectos solicitados para la práctica.
 Reporte de la práctica anterior.
El laboratorio inicia puntualmente, no se permitirá el ingreso tarde bajo ninguna excusa.
NO SE REPONDRÁ LABORATORIO POR NINGÚN MOTIVO
3. El alumno no podrá ingresar al laboratorio si:
 Si tiene la guía de laboratorio incompleta o hay evidencia de copia entre dos o más
compañeros de laboratorio, de lo contrario tendrá inasistencia aunque haya firmado la
lista de asistencia.
4. En el laboratorio está prohibido el ingreso de:
 Celulares, localizadores, reproductores de música o cualquier otro artefacto (iPod,
iPad, Laptops, tablets etc.) que pueda interferir con la atención del estudiante.
 Comida y bebidas.
 Gorras, suéteres o chumpas que no sean del uniforme.
 Mochilas, bolsos, u otro accesorio que no sea requerido por el docente.
Todas las pertenencias deberá dejarlas en el los casilleros de la entrada del área de
laboratorio.
5. En las prácticas no se puede ingresar al laboratorio con uñas acrílicas, joyería.
6. Las personas con cabello largo deben recogerlo con una cola o gancho (no fleco).
7. El alumno es responsable del material que recibe, manteniéndolo limpio y en perfecto
estado a lo largo de cada práctica.
8. Los alumnos serán responsables de dejar los reactivos cerrados y sin contaminar por
otros, las mesas limpias y en orden, lo mismo que el equipo que sea utilizado durante la
práctica.
9. Es necesario que cualquier persona que se encuentre dentro de las instalaciones del
laboratorio se comporte de forma adecuada, cumpliendo con el reglamento y las normas
de seguridad requeridas (Práctica No. 1).
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TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................................ 3
REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA ............................................ 4
MATERIAL Y EQUIPO BÁSICO EN LAS PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA .................................. 6
PRÁCTICA Nº 1: NORMAS DE BIOSEGURIDAD .................................................................................. 8
PRÁCTICA Nº 2: OBTENCIÓN Y MANEJO DE MUESTRAS CLÍNICAS........................................... 19
PRÁCTICA N° 3: COLORACIONES MICROBIOLÓGICAS SIMPLES ................................................ 28
COLORACIÓN DE GRAM ............................................................................................................................. 33
PRÁCTICA Nº 4: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLÓGICO ........................ 39
MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO.............................................................. 45
PRÁCTICA Nº 5: ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA .......................... 52
PRÁCTICA Nº 6: CULTIVO DE MUESTRAS CLÍNICAS: UROCULTIVO Y COPROCULTIVO ...... 59
PRÁCTICA Nº 7: IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS ......................................................... 71
PSEUDOMONAS ...................................................................................................................................... 79
PRÁCTICA Nº 8: DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS ............ 82
PRÁCTICA Nº 9: IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE MYCOBACTERIUM ............................ 91
PRÁCTICA Nº 10: DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO DE HONGOS AMBIENTALES ........................ 103
PRÁCTICA Nº 11: DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTÁNEAS............... 110
PRÁCTICA Nº 12: DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTÁNEAS, SISTÉMICAS Y

OPORTUNISTAS .................................................................................................................................... 116
DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS Y OPORTUNISTAS ............................................... 118
PRÁCTICA Nº 13: DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO ............................................................................. 130
FUENTES DE INFORMACIÓN ............................................................................................................. 136
GLOSARIO DE MICROBIOLOGÍA ...................................................................................................... 137
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MATERIAL Y EQUIPO BÁSICO EN LAS PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
En el campo de la microbiología médica se requieren de conocimientos básicos,

indispensables para facilitar el estudio de los diferentes microorganismos; por tal
motivo es necesario que el alumno se familiarice desde el principio con el material y
equipos empleados en el aislamiento e identificación de los microorganismos
(bacterias, hongos y virus) . Ellos deben ser debidamente preparados y posteriormente
esterilizados para asegurar que los ejercicios reúnan los requisitos exigidos para el
trabajo microbiológico. A continuación se describen algunos de ellos:
▪ Asa y aguja de siembra: Muy usada en la práctica microbiológica, hecha de alambre

de platino o de otro material, se inserta en un mango que facilita su manejo. El alambre
puede ser recto o terminar en forma de pequeño anillo.
▪ Autoclave: Aparato para esterilización por vapor bajo presión, provisto de manómetro
y una llave que regula la presión y la temperatura a la que desea esterilizar.
▪ Cabina de Flujo laminar: Equipo que proporciona área estéril, para los trabajos
microbiológicos, en especial en cultivos, evitando la interferencia de los
microorganismos de contaminación ambiental.
▪ Centrífuga: Aparato diseñado para acelerar la separación de partículas sólidas

suspendidas en líquidos.
▪ Contador de colonias: Sirve para contar electrónicamente y de forma exacta las

colonias de microorganismos.
▪ Crioviales: Pequeños tubos cónicos de polipropileno resistentes a muy bajas

temperatura (- 4ºC). Usados para guardar muestras en la congeladora. Ejemplo: suero,
cepas virales.
▪ Estufa: Aparato de dimensiones diversas, donde se incuban los cultivos, generalmente

a 37ºC.
▪ Filtros esterilizantes: Para dejar libre de contenido microbiano a productos en estado

líquido, los que por su naturaleza no pueden ser sometidos a la acción del calor en sus
diferentes modalidades.
▪ Gradilla: Soporte para tubos de ensayo.
▪ Jarra de anaerobiosis: Instrumento útil para el aislamiento de bacterias anaerobias ya

que permite un cierre hermético no dejando ingresar oxígeno.
▪ Lámina portaobjetos: Lámina de vidrio que se utiliza para preparar frotis bacterianos.
▪ Matraces y balones: Recipientes volumétricos de gran utilidad para la preparación y

almacenamiento de soluciones, colorantes , reactivos , medios de cultivo , etc. Los
balones se diferencian de los matraces por tener una base esférica con fondo plano. En
ambos los cuellos terminan en un discreto reborde lo que les confiere resistencia.
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▪ Mechero de Bunsen: Mechero de gas, en el que éste se mezcla con aire antes de
producir la flama. Se utiliza para esterilizar el asa de siembra.
▪ Medios de cultivo: Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de

microorganismos .En su composición se incluye un número balanceado de nutrientes y
un determinado volumen de agua. De acuerdo con su consistencia pueden ser líquidos,
semisólidos y sólidos. Se presentan en forma deshidratada.
▪ Microscopio: Instrumento óptico utilizado para la observación de microorganismos

que no son visibles a simple vista.
▪ Pipetas: Son tubos cilíndricos de diversos materiales, pueden ser graduadas y sirven
para medir volumen conocido de líquido. Otras no son graduadas y se utilizan para la
transferencia de líquidos.
▪ Pipetas Pasteur: Varillas de vidrio de 4 mm de diámetro y de 20 a 30 cm de longitud.

Se les emplea para la toma de pequeños inóculos de siembra.
▪ Pipeteadores automáticos: Pipetas que absorben de forma automática sin necesidad de

uno aspirar, pequeños volúmenes (1µl a 1 000 µl ) de muestras.
▪ Placa de Petri: Recipiente de vidrio o plástico que , en general se usa para contener
medio de cultivo y proporciona una suficiente área para el crecimiento bacteriano.
Autoclave Cabina de Flujo laminar
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PRÁCTICA Nº 1: NORMAS DE BIOSEGURIDAD
OBJETIVOS
 Minimizar los riesgos protegiendo al alumno, profesor, personal administrativo y al

medio ambiente de agentes que pueden ser potencialmente nocivos.
 Determinar la conducta a seguir frente a un accidente con exposición a dichos
elementos.
 Conocer la utilización de materiales y equipo para un buen desarrollo del trabajo en el
laboratorio de microbiología.
INTRODUCCIÓN
¿De dónde surgen los accidentes? Los accidentes dependen de tres factores: de una
condición insegura, que puede ser el ambiente; de una actitud insegura, depende de la
seriedad de la persona; y por ultimo del riesgo. Con esos tres factores en su punto, se
puede producir un accidente, y es por eso que debemos saber las normas de
bioseguridad, para disminuir el riesgo.
¿Qué es bioseguridad? Conjunto de medidas preventivas orientadas a mantener,

controlar y reducir factores de riesgo laborables procedentes de agentes de riesgo
(biológicos, físicos o químicos) con el objetivo de proteger la salud y la seguridad del
personal que labora en un determinado establecimiento de salud, laboratorio de
diagnóstico o de enseñanza universitaria.
El laboratorio de microbiología es un espacio adecuado para realizar los análisis

microbiológicos necesarios para comprender mejor la asignatura, por eso se requiere la
observación de una serie de normas de seguridad que eviten posibles accidentes debido
al desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible negligencia de los
alumnos que estén en un momento dado, trabajando en el laboratorio. Para esto es
necesario conocer los materiales de laboratorio, que son empleados en el análisis
microbiológico.
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Debemos tener bien en claro las medidas de seguridad del laboratorio las cuales son se
encuentran en la guía de laboratorio. Algunas de las principales son:
 No realizar acciones prohibidas en el laboratorio (comer, fumar, beber).
 No ingresar aparatos electrónicos prohibidos.
 Mantener limpio el área de trabajo.
 Usar los recipientes de basura adecuados para los residuos.
 Ingresar con el mandil o guarda polvos cerrado.
 Conocer donde se encuentra el extintor en caso de incendios y el botiquín de
primeros auxilios.
El símbolo de riesgo biológico universal fue dado por Charles Badwin en 1967. Y es el
siguiente:
Además debemos de saber que según la OMS (Organización mundial de la salud),

existen 4 niveles de seguridad según los 4 grupos de riesgos que se clasifican según su
patogenicidad, dosis infectiva, modo de transmisión, rango del hospedero,
disponibilidad de medidas de prevención efectivas y disponibilidad de tratamiento
efectivo.
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MATERIAL y METODOS:
Es necesario el conocimiento de los materiales y los equipos que son esenciales para la
seguridad en el laboratorio:
Materiales:
 Botiquín: Para primeros auxilios debe contener, gasa estéril, algodón absorbente,
vaselina borificada, sol. de ácido acético al 1%, sol. de ácido bórico al 2%, sol de
bórax al 12% tintura de yodo, alcohol, tijeras, etc.
 Extinguidor: Para casos de incendios
 Ventiladores o extractores de aire: mantener renovación del aire
 Cámaras aislantes de Aerosoles y salpicaduras
 Pantalla contra Salpicadura de sustancias: Establece una separación entre el
trabajador y el trabajo.
 Duchas de seguridad: Sirve para lavarse si has tenido contacto con algún químico,
debe ser de fácil acceso.
 Campana: Sirve para extraer los gases contaminantes y llevarlos al exterior, pero
antes pasan por un filtro para no contaminar el ambiente.
Equipo:
 Mascarilla: usar en los procedimientos en los que pueda haber riesgo de
salpicadura de material biológico en la mucosa bucal y nasal.
 Guantes de látex: se deberá usar en todo procedimiento que implique el manejo de
material biológico o donde exista el riesgo de exposición a sangre o fluidos
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corporales, asi mismo deberán usarse en los procesos de descontaminación y
eliminación de residuos contaminados.
 Mandil o bata: será obligatorio en todo momento dentro del laboratorio, la cual
deberá ser retirada antes de salir del laboratorio. Esta deberá ser de manga larga
para protegerse de cualquier reactivo o agente químico, o material biológico
manipulado en el laboratorio.
 Zapatos cerrados: Usarlos dentro del laboratorio para evitar el contacto de la piel
con material contaminado o cualquier producto químico peligroso, por
derramamiento o salpicadura de algún agente tóxico.
 Gorro de tela: para evitar el contacto directo del cabello con material contaminado
o sustancias químicas peligrosas. Gafas de seguridad o gafas de impacto
SEÑALIZACIÓN:
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CALCULOS Y RESULTADOS:
Las normas de bioseguridad son dadas para prevenir accidentes y saber cómo actuar
frente a ellos. Seguir estas normas es indispensable para los laboratorios, ya que nadie
quiere quedarse ciego o tener alguna infección, además según una encuesta el 100% son
por no cumplir con las normas de bioseguridad, ya que el humano no sigue las normas,
el equipamiento no es seguro o se saltan algunos procedimientos.
ACCIDENTES:
Accidentes debido a error humano 65%
Actos inseguros 15%
Problemas de equipamiento 20%
Edad más propensa 20–29 años, Hombres > mujeres
Encuesta de laboratorio y comportamiento (Phillips, 1965)

Entonces podemos darnos cuenta de que es mejor prevenir a lamentar. La edad más
propensa es de 20 a 29 años porque a esa edad todavía no son conscientes de los que le
pueda pasar, más adelante ya adquieren más experiencia.
En el Perú existe un manual de bioseguridad que es NORMA TÉCNICA N° 015 -

MINSA / DGSP - V.01 que tiene por objetivo El cumplimiento de las normas
establecidas en el presente Manual de Normas de Bioseguridad, será obligatorio y de
responsabilidad de todo el personal que labora en los Centros de Hemoterapia y Bancos
de Sangre del Sector Salud.
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RECOMENDACIONES:
 Los avisos deben ser llamativos.

 Mantener el área de trabajo limpio y ordenado
 Usar la campana o cámara de vidrio cuando se realiza experimentos con grandes
desprendimientos de gases.
 El material de vidrio deberá ser limpiado con detergente haciendo uso de la
escobilla y enjuagado varias veces • Tener precaución cuando se utilizan sustancias
inflamables.
 Nunca tener líquidos inflamables como alcohol, cetona, etc cerca de un mechero.
 Obtener las sustancias químicas de los frascos de reactivos, en un vaso de
precipitados o en un tubo de ensayos limpio, cuidando de no usar cantidades
mayores que las necesarias.
 Leer cuidadosamente las etiquetas de los frascos de reactivos y sustancias
peligrosas antes de usarlas, prestar la debida atención.
 Regresar los frascos de reactivos, tapados y colocados correctamente a su lugar.
 Nunca regresar sustancia alguna no utilizada al frasco original ni emplear un
reactivo, sin estar seguro que tal, es el requerido.
 Mantener las llaves de los caños cerrados mientras no se utilizan.
 Al terminar los papeles, materiales desechables sustancias solidas deberán ser
colocados en el tacho de basura, mientras que los líquidos a depósitos rotulados con
este fin. No desechar sustancias directamente al desagüe.
 El material de cristal roto y los productos químicos se recogerán en recipientes o
contenedores especiales destinados a tales fines. No hay que verter directamente a
la pica productos que reaccionen con el agua, inflamables, o difícilmente
biodegradables.
 Productos químicos sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua
abundante, como mínimo durante 15 minutos. Las duchas de seguridad serán
utilizadas cuando la zona afectada sea grande y no resulte suficiente el lavado en
una pica. La rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad y la
extensión de la zona afectada
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FUENTES DE INFORMACIÓN:
 Agapito, F. (2016). Bioseguridad en el laboratorio. Universidad Científica del

sur. Lima, Perú. (p.1 - p.17)
 OMS; 2005. Manual de bioseguridad en el laboratorio, tercera Edición,
Organización mundial de la salud, Ginebra
 Normas de bioseguridad. (1997) recuperado de:
http://www.infecto.edu.uy/prevencion/bioseguridad/bioseguridad.htm
ANEXOS:
1: Imágenes de los materiales y del equipo:
 Materiales:
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 Equipo:
2: Niveles de Bioseguridad
 Nivel 1
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 Nivel 2
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 Nivel 3
17
 Nivel 4
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PRÁCTICA Nº 2: OBTENCIÓN Y MANEJO DE MUESTRAS CLÍNICAS
OBJETIVOS
▪ Realizar los procedimientos adecuados para asegurar las medidas de bioseguridad

apropiadas.
▪ Conocer las técnicas de toma de muestra y manejo de las diferentes muestras clínicas
para su óptimo procesamiento.
▪ Conocer las precauciones para el manejo y transporte de muestras clínicas.
INTRODUCCIÓN
En términos de la efectividad del Laboratorio de Microbiología, nada es más importante

que la apropiada selección, colección y transporte de las muestras clínicas. Estos
procedimientos quedan inutilizados muchas veces por falta de cuidado y métodos
defectuosos usados en la recolección y manejo de las muestras.
Independientemente del hecho que algunos tipos de muestras requieren metodología de
recolecciones muy especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben
ser tenidos en cuenta al coleccionar las muestras clínicas:
▪ La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.
▪ Cuando se va a proceder a tomar un espécimen clínico, es importante evitar la

contaminación con microorganismos saprofitos del área. Esta flora normal puede
interferir con la interpretación del cultivo y enmascarar la presencia del verdadero
agente etiológico de la enfermedad.
▪ Seleccionar el lugar anatómico correcto de donde se obtendrá el espécimen y utilizar

la técnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtención.
Especialmente en el caso de investigar microorganismos anaerobios.
▪ Nunca refrigerar una muestra por anaerobios.
▪ Coleccionar un apropiado volumen de la muestra.

Insuficiente material puede ser causa de resultados falsos negativos.
▪ Junto con la muestra se debe enviar una solicitud de análisis en la que debe figurar el
nombre del paciente, número de identificación personal, procedencia, tipo de muestra,
fecha y hora de colección, especificar región anatómica, diagnóstico clínico, duración
de la enfermedad, terapia antibiótica , prueba requerida e iniciales del funcionario que
tomó la muestra.
▪ El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su grado de

instrucción sobre los procedimientos a realizar.
▪ Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibióticos o agentes

antimicrobianos. Si se han administrado, informar de ello al laboratorio. A menudo un
líquido cefalorraquídeo no revela patógenos bacterianos en frotis ni cultivo, cuando se
ha tomado un antibiótico en las 24 horas anteriores.
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▪ Colocar la muestra en un recipiente estéril y adecuado para su transporte como cajas,
gradillas, bandejas, llevando en la base papel absorbente embebido en desinfectante, con
el fin de asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del
espécimen y mantener medidas de bioseguridad apropiadas.
▪ Ordenar siempre un frotis para tinción o coloración de Gram, para los especímenes
que procedan de cavidades asépticas y anotar su interés en determinado
microorganismo.
CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA
 Hoja de solicitud de análisis no llenada correctamente

 Muestras sin rotular o inadecuadamente rotuladas
 Muestras sin medios de transporte adecuado, en contenedores quebrados, rotos o
con derrames
 Muestras secas o con contaminación obvia
 Muestras sin preservación adecuada
Las muestras más frecuentes en los estudios microbiológicos son:
■ ORINA:
En las muestras de orina se pueden realizar diferentes análisis como: examen

microscópico de orina, urocultivo, determinación de algunos residuos de medicamento
(doping) e investigación de microorganismos especiales como Leptospira. El éxito de
estos exámenes dependerá de la técnica con que se tome la muestra y sobre todo del
tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y el análisis, ya que el proceso de
descomposición que se sucede en la orina por acción de las bacterias allí presentes,
modifica el parámetro de los componentes y muy especialmente altera la carga
microbiana.
Procedimiento
▪ Lavarse las manos

▪ Las pacientes mujeres deben realizar previamente el lavado de los genitales externos
con agua y jabón y de adelante hacia atrás, mientras que los hombres solo lo realizarán
en el caso de solicitarse cultivos.
▪ Secarse con un apósito estéril
▪ Las muestras deben colocarse en un frasco de boca ancha y tapa de rosca estériles,
depositar aproximadamente entre 30 y 40 ml de preferencia la primera muestra de la
mañana a través del chorro medio (miccionar una buena cantidad en el inodoro y luego
en el envase).
▪ En mujeres la micción debe ser separando los labios mayores de la vulva.
En hombres se hace la retracción del prepucio de manera que el chorro de orina salga
directamente.
▪ Tapar el frasco con precaución, evitando contaminar la muestra y/o derramarla.
▪ En casos de niños pequeños utilizar bolsas colectoras adheridas a los genitales.
▪ La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio. En caso de no ser posible
refrigerarla no más de 4 horas.
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■ HECES:
Las muestras de heces se solicitan para examen bacteriológico, virológico, bioquímico y

para la búsqueda de parásitos.
Las muestras de heces de un paciente sospechoso de enfermedades diarreicas deben
colectarse antes de la administración de cualquier antibiótico.
Procedimiento
▪ Muestra evacuada: La persona debe defecar en un recipiente limpio y seco, teniendo

cuidado de no miccionar para que ésta no se mezcle con orina.
▪ Hisopado rectal : La muestra se obtiene con un hisopo de algodón estéril , el cual se
desenvuelve y se lubrica antes de su uso, introduciéndolo en el medio de transporte , de
preferencia Cary Blair, y luego se introduce en el recto , unos 3 cm, mediante
movimientos de rotación.
El hisopo con la muestra se introduce hasta el fondo del tubo que contiene el medio de
transporte (Cary Blair o Amies).
El frasco con la muestra o tubo con el medio de transporte se pueden conservar a
temperatura ambiente hasta su procesamiento o envío al laboratorio, no más de 12
horas.
No se debe refrigerar la muestra.
■ HEMOCULTIVO:
La sangre de los individuos sanos es estéril. Una afluencia repentina de bacterias

habitualmente es eliminada del torrente circulatorio en un período de tiempo corto de
minutos a horas, excepto cuando existe una infección masiva o está presente un foco
intravascular infectado. Básicamente cuando las bacterias se multiplican a tasas que
exceden el sistema retículoendotelial para eliminarlas, se habla de BACTERIEMIA. El
término FUNGEMIA se utilizar para designar la presencia de hogos en sangre.
Siempre que exista una razón para sospechar de una bacteriemia se debe practicar el
cultivo de la sangre o hemocultivo.
Procedimiento
Los hemocultivos se obtendrán antes de iniciar la terapia antibiótica, el incumplimiento

de este punto puede dar lugar a resultados falsamente negativos, pudiendo comprometer
la vida del paciente.
Los microorganismos de la piel pueden contaminar la sangre durante la extracción,
dificultando la interpretación de los resultados. Además algunos contaminantes actúan
como patógenos oportunistas, por lo que se debe ser muy cuidadoso durante la
extracción.
La toma debe realizarse por venopunción y para ello se debe hacerse:
• Lavado de manos y utilización de guantes estériles
• Limpiar con jabón líquido o alcohol el lugar de la punción
• Aplicar durante un minuto povidona yodada, dejar secar
• Desinfectar los tapones de los frascos
• Efectuar la extracción
• No airear los frascos
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• Nunca debe hacerse la extracción a través de catéteres, salvo en aquellas
circunstancias en que se indica específicamente.
• Cuando la extracción se realice con adaptador, se debe esterilizar o ser de un solo
uso.
■ MUESTRAS FARINGEAS Y AMIGDALARES:
Más del 70 % de procesos están ocasionados por virus: rinovirus, coronavirus,

adenovirus (3, 4, 7, 14, 21), parainfluenza, virus de la gripe, virus coxsakie A y otros
enterovirus, virus Epstein-Barr y virus herpes simple tipo I
Entre el 10 y 20 % de la faringitis agudas en niños de 5 a 10 años, están ocasionados por
Streptoccoccus pyogenes. Otras bacterias patógenas son: Streptococcus grupos C o G,
Corynebacterium diphteriae, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae .
Procedimiento
▪ Las muestras de exudado faringo-amigdalar se obtienen con la ayuda de un depresor

lingual, tocando con la torunda todas las partes con exudados, membranas o zonas de
inflamación. Se deben frotar las criptas tonsilares y la faringe posterior.
▪ No se requieren medidas especiales para su transporte y conservación.
▪ La toma de muestra de la epiglotitis , debido al riesgo de complicaciones, se hace por
un especialista en las condiciones adecuadas.
▪ Es recomendable realizar hemocultivos.
■ MUESTRAS NASALES:
Procedimiento
La muestra se obtiene introduciendo una torunda para cultivo, previamente embebida en

suero fisiológico estéril, unos 2 cm en la nariz y girando suavemente contra la mucosa
de la superficie nasal.
■ CATÉTERES:
El estudio bacteriológico de los catéteres, nos va a permitir en ocasiones conocer el

agente causal de una bacteriemia relacionada con el catéter y prevenir que aparezca
dicha bacteriemia. Para valorar su importancia podemos decir que de una u otra forma
el 82 % de las bacteriemias nosocomiales se relacionan con la presencia de catéteres.
Vías de infección: a. Piel y catéter: en los catéteres periféricos y de corta duración. b.
Endoluminal: en las vías centrales tunelizadas.
Procedimiento
▪ Desinfectar con alcohol al 70 % una zona de la piel de unos 10 cm correspondientes a

la zona de entrada del catéter
▪ Retirar el catéter con la máxima asepsia, con la ayuda de pinzas y tijeras estériles,
cortar los 5 cm distales del catéter que corresponde a la porción intravascular.
▪ Introducir el segmento del catéter en un recipiente estéril correctamente identificado
▪ La muestra debe ser enviada al laboratorio en un período de tiempo menor de 30
minutos. Cuando no sea posible deberá ser guardada en refrigeración a 4º C
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■ LÍQUIDOS ESTÉRILES:
El fundamento es la búsqueda de agentes patógenos u oportunistas, que pueden estar

presentes en los líquidos o fluidos orgánicos. En este grupo incluimos líquidos
producidos, ya sea de forma espontánea o bien provocada a nivel de las serosas, en las
que habitualmente no existen microorganismos y son presumiblemente estériles. Su
buen manejo presenta un triple interés por:
• La trascendencia de esta patología por su elevada morbilidad o mortalidad
• Dificultad de diferenciar patógenos y oportunistas como consecuencia de cuidados
terapéuticos instaurados o prótesis aplicadas previamente.
• Posibilidad de contaminación exógena, sea en la obtención o en su manipulación,
siendo por ello muy importante extremar las medidas de asepsia, de recogida y
procesamiento.
Muestras
• Líquido ascítico o peritoneal
• Líquido articular o sinovial
• Líquido pericárdico
• Líquido pleural
Procedimiento
▪ La obtención de estos líquidos es un procedimiento médico

▪ La toma se realiza por punción percutánea (toracocentesis, paracentesis, punción
pericárdica o punción articular)
▪ Para el estudio bacteriano se requerirá de 1 a 10 ml; para líquido de diálisis peritoneal
se requerirá de un volumen superior a 100 ml.
▪ Para evitar la coagulación de algunos líquidos se utilizará heparina sin conservantes,
ya que otros anticoagulantes podrían tener acción antibacteriana.
▪ Los recipientes idóneos son los viales de transporte para anaerobios
▪ Los frascos de hemocultivo también son útiles para cultivar líquidos biológicos
estériles. Si se sospecha de anaerobios colocar la muestra luego de ser extraída en un
frasco para anaerobios.
■ LÍQUIDO CÉFALORRAQUIDEO (LCR)
La meningitis es un proceso inflamatorio del Sistema Nervioso Central, que afecta a las
leptomeninges y al líquido cefalorraquídeo. Se trata de una urgencia médica y requiere
un diagnóstico y tratamiento precoz. Su morbimortalidad, en meningitis agudas
bacterianas, se relaciona directamente con el retraso en el inicio de la terapéutica.
Los casos esporádicos de meningitis agudas bacterianas, se relacionan directamente con
el retraso en el inicio de la terapéutica, aparecen en edades extremas de la vida,
ocurriendo el 75 % de los casos en menores de 1 año.
Muestra
• La toma de la muestra la realiza el médico tratante o el patólogo clínico del

laboratorio.
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• Se obtendrá antes de instaurar cualquier terapia antimicrobiana, siempre que las
condiciones lo permitan.
• LCR se obtiene por punción lumbar
• Generalmente se obtendrán dos tubos, el primero se enviará para el estudio
bioquímico, el segundo para el estudio microbiológico con el mayor volumen
posible.
• El tubo más turbio se enviará a Microbiología.
• Se debe solicitar simultáneamente hemocultivos, porque las meninges suelen ir
acompañadas de un proceso bacteriémico.
• El volumen mínimo para el estudio bacteriológico rutinario es 1 ml, aunque es
preferible disponer de volúmenes superiores. Para hongos o micobacterias se
necesitarán al menos 2 ml adicionales por cada uno de los estudios, siendo
deseable llegar a los 10 ml.
• La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues algunos agentes
etiológicos como Streptococcus pneumoniae pueden lisarse rápidamente a partir
de la primera hora de su recogida
• Si no fuera posible se mantendrá en estufa entre 35 a 37ºC y una parte se incubará
• en frasco de hemocultivo, que se mantendrá en idénticas condiciones.
• Si no se dispone de estufa se mantendrá a temperatura ambiente. Nunca se
refrigerará pues se afectará la viabilidad de Neisseria meningitidis y H. influenzae.
Procesamiento del líquido cefalorraquídeo
• Centrifugar a 1 500 hasta 3 000 revoluciones durante 15 a 20 minutos.

• En caso de líquidos muy purulentos no será necesario centrifugar.
• Recoger el sobrenadante con pipeta de Pasteur estéril y conservarlo a 4ºC en
frigorífico.
• Sembrar el sedimento con pipeta de Pasteur en : agar Sangre a 35 - 37ºC,
atmósfera de CO2 ,agar Chocolate a 35 - 37ºC atmósfera de CO2 ,caldo
Tioglicolato o caldo Infusión Cerebro Corazón BHI a 35 - 37ºC por 72 horas.
• Se realizarán tres extensiones para tinción : tinción de Gram, Azul de metileno,
Wright.
■ EXTRACCIÓN DE SANGRE PERIFÉRICA:
1. Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesitará para ejecutar la
obtención de la muestra.
2. Lavarse las manos previamente a la extracción de la sangre y si es preciso colocarse
guantes.
3. El paciente deberá sentarse cómodamente de manera que el brazo quede colocado
paralelamente a la mesa de trabajo , donde se realizará la extracción de sangre.
4. Apoyar el brazo del paciente sobre un pequeño cojín bajo el codo. Con la palma de la
mano hacia arriba.
5. Con la mano izquierda tirar del extremo de la ligadura, cruzándolo y a continuación
introducir este extremo por debajo de la parte principal de la ligadura aproximadamente
dos dedos por encima de la flexión del codo. Ésta se deberá ajustar solo lo suficiente
para aminorar la corriente sanguínea y dilatar la vena, sin apretar tanto que reduzca el
paso de la sangre por las arterias.
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6. Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatación
de las venas.
7. Con el dedo índice de la mano izquierda palpar la vena en la que se introducirá la
aguja.
8. Desinfectar la zona de la piel donde se realizará la punción con un pedazo de algodón
embebido en alcohol yodado.
9. Tomar la jeringa con la mano derecha, colocar la yema del dedo índice sobre la base
de la aguja.
10. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba, introducir la aguja en el
centro de la vena sin titubeos., de 1 a 1,5 cm aproximadamente.
11. Luego de extraer la sangre por punción venosa, retirar la aguja de la jeringa y
colocarla en un depósito de metal ( para autoclavar o incinerar); verter lentamente la
sangre en un tubo o en el caldo de cultivo.
EVALUACIÓN
1. ¿Por qué una muestra de líquido cefalorraquídeo no debe ser refrigerada , si no se

envía de inmediato al laboratorio?
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2. ¿Cuáles son los agentes etiológicos de la meningitis aguda en neonatos, niños y

adultos?
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3. ¿En qué casos se debe tomar una muestra de aspirado bronquial?
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4. ¿Cuál es el volumen se sangre requerido para realizar un hemocultivo en un neonato,

niño y en un adulto?, ¿cuáles son los agentes etiológicos más frecuentes de una
septicemia en cada caso?
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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PRÁCTICA N° 3: COLORACIONES MICROBIOLÓGICAS SIMPLES
OBJETIVOS
▪ Explicar la coloración Azul de metileno.

▪ Identificar la diferencia entre coloración simple y coloración diferencial
INTRODUCCIÓN
Debido al pequeño tamaño de los microorganismos , se requiere de un microscopio

óptico, ya sea de campo claro (lo más usado) o de campo oscuro, para hacer la
descripción morfológica de estos. La observación de los frotis teñidos es lo más
recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensión de los microorganismos
sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y se tiñen los microorganismos.
Las coloraciones son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la

capacidad de los mismos para retener (o no), determinadas sustancias colorantes, lo que
depende de la carga de la célula y del colorante. Estos colorantes pueden ser de distintos
tipos:
▪ Catiónicos : sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células
y las tiñen. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.
▪ Aniónicos : Con carga negativa, no penetran en el interior de la célula, de modo que
no tiñen las células sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos:
Eosina, Nigrosina.
▪ Liposolubles: se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: Negro sudán.
Los colorantes aumentan el contraste combinándose químicamente con el protoplasma

microbiano y permiten localizar estructuras específicas del microorganismo y
diferenciarlos en su forma, tamaño, agrupación y afinidad a ciertos colorantes . Las
bacterias pueden presentar las siguientes formas esféricas (cocos), estos a su vez
disponerse en cadenas (estreptococos) , en pares (diplococos), o en racimos
(estafilococos), sarcinas, en forma alargadas cilíndricas (bacilos) y espirales
(espiroquetas y espirilos).
De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden
realizar diferentes tipos de tinciones como son :
▪ Simples : Utilizan un solo colorante. Las células presentan una composición química
diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma distinta frente a
un colorante . El colorante tiñe las células como en el caso de : Azul de metileno,
Safranina o no la tiñe : Nigrosina.
▪ Diferenciales : Los diferentes tipos de células presentan distinta composición química
y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite
clasificar a los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción.
Ejemplos: tinción de Gram y Ziehl-Neelsen, ambas utilizan más de un
colorante.
▪ Selectivas: Distintas estructuras celulares tienen diferente composición química de
modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ejemplos: tinción de esporas,
28
de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizar uno o
más colorantes.
■ COLORACIÓN AZUL DE METILENO
Es una coloración simple que permite observar presencia o ausencia de

microorganismos y distinguir algunas formas bacterianas : cocos, bacilos , espirilos.
Se utiliza el Azul de metileno, el cual se agrega sobre la extensión por un minuto , luego
del cual se enjuaga , se deja secar a temperatura ambiente y se observa al microscopio
con la lente de mayor aumento.
MATERIALES
▪ Guantes quirúrgicos estériles

▪ Hisopos estériles
▪ Láminas portaobjetos
▪ Mechero de alcohol
▪ Jeringa de 10 cc
▪ Algodón y alcohol yodado
▪ Ligadura
METODOLOGÍA
■ HISOPADO FARÍNGEO
1. El profesor, con la colaboración de un alumno, enseñará a tomar una muestra de

exudado faríngeo. El paciente ( en este caso el alumno), se sentará cómodamente de
frente al profesor , el área debe tener buena iluminación para que permita visualizar
adecuadamente el sitio anatómico a examinar.
2. Indicar abrir la boca y con ayuda del bajalengua deprimir la lengua para favorecer
que la faringe quede expuesta, con un hisopo estéril frotar firmemente la pared posterior
de la faringe y las amígdalas, particularmente en donde existan puntos blancos o áreas
que presenten signos de inflamación o sangrado.
3. Cuando el paciente no tenga amígdalas, la muestra se obtendrá del fondo de las fosas
amigdalinas. Al retirar el hisopo tener la precaución de no hacer contacto con ninguna
otra área de la boca.
4. A partir de la muestra tomada, se realizará el aislamiento por el método de
aislamiento en estría en placa, se utilizarán placas de agar sangre , agar chocolate y
agar manitol salado.
5. Antes de eliminar el hisopo , realizar una extensión para preparar un frotis, fijar la
muestra y teñir con una tinción simple (Azul de metileno) para observar:
• Morfología de la bacteria
• Agregación o tipo de distribución bacteriana.
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RESULTADOS
■ Frotis de hisopado faríngeo :
Hisopo
Lámina
portaobjeto
Aislamiento en estría
■ Coloración simple : Azul de Metileno
• Cubrir el frotis con colorante Azul de metileno por un minuto

• Lavar con agua corriente
• Dejar secar a temperatura ambiente
1. Cubrir con 2. Lavar con

Azul de metileno agua
Graficar lo observado al microscopio
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EVALUACIÓN
1. ¿Cuáles son las estructuras celulares o moléculas que pueden ser observadas cuando
se emplea la tinción simple?. Ejemplos de dos (2) colorantes que podrían utilizarse para
realizar una tinción simple.
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2. ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple ?
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COLORACIÓN DE GRAM
OBJETIVOS
▪ Explicar el fundamento de la coloración de Gram.

▪ Ejecutar la técnica de coloración más usada en bacteriología : coloración de Gram.
▪ Establecer la diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
INTRODUCCIÓN
Descrita por Christian Gram en 1884, permitiendo dividir a las bacterias en dos grupos
taxonómicos : Gram positivas y Gram negativas.
En esta técnica se deben tener en cuenta tres aspectos fundamentales :
• Las bacteria Gram positivas retienen firmemente el colorante inicial
• Al añadir el mordiente se forma un complejo molecular de gran tamaño
• La penetración está condicionada por la permeabilidad de la pared celular.
Los mecanismos antes mencionados se relacionan con la composición química de la

pared de las bacterias. Las bacterias Gram positivas contienen una mayor cantidad de
mureína, ácido teicoico, pocas proteínas y algunas contienen polisacáridos.
Las bacterias Gram negativas poseen poca mureína, una elevada cantidad de lípidos,
proteínas y polisacáridos y no contienen ácido teicoico.
La mureína en las bacterias Gram positivas impide que el complejo cristal violeta-yodo
sea eliminado por el decolorante alcohol–acetona, ya que es insoluble en alcohol. El alto
contenido de lípidos en la pared de las bacterias Gram negativas ocasiona que el
complejo cristal violeta – yodo sea eliminado o disuelto por el decolorante.
Al finalizar la coloración las bacterias Gram positivas quedan teñidas con el cristal
violeta : morado y la bacterias Gram negativas quedan teñidas con el colorante de
contraste : safranina : rojo.
MATERIALES
▪ Cultivos en medio líquido de Escherichia coli y Staphylococcus sp.
▪ Asa bacteriológica
▪ Equipos de coloración para tinción de Gram
▪ Mechero, portaobjetos y puentes para tinción
▪ Microscopio
METODOLOGÍA
Preparar un frotis de cada uno de los cultivos de Escherichia coli y Staphylococcus sp
Preparación del frotis para la tinción

▪ Trabajar en un área aproximadamente de 10 cm de distancia de la llama del
mechero ( zona considerada estéril ), flamear el asa, hasta el rojo vivo y dejarla enfriar
por 30 segundos
▪ Con un lápiz graso identificar cada una de las láminas portaobjetos donde se van a
realizar las preparaciones.
33
▪ Destapar el tubo con el cultivo, empleando para el propósito los dedos anular y
meñique , introducir el asa, tomar una pequeña muestra de cultivo.
▪ Depositar el material en el centro de una lámina portaobjetos y extenderlo en un área
aproximadamente de 0,5 cm.
▪ Cuando se trata de cultivos de medio sólido , colocar una gota de agua destilada sobre
la superficie , descargar la muestra y homogeneizar. Dejar que la preparación seque
espontáneamente al aire libre.
▪ Fijar la preparación pasándola rápidamente sobre la llama del mechero , evitando un
calentamiento excesivo para evitar que el material se carbonice.
▪ Con un lápiz graso identificar cada una de las preparaciones.
♦ Para la realización de un buen frotis se deben cumplir las siguientes condiciones :

▪ Utilizar láminas limpias y en perfecto estado, libre de rayones y de manchas, deben ser
previamente pasadas por la llama del mechero para eliminar trazas de grasa y no se
deben tocar con las yemas de los dedos .
▪ Debe ser delgado, translúcido y homogéneo para que, durante el proceso de tinción,
reciba en toda su superficie el mismo tratamiento con las diferentes sustancias químicas
y se debe usar para la preparación la técnica aséptica.
▪ Utilizar un mínimo de cultivo cuando es un medio sólido.
▪ Cuando se trabaja a partir de un medio líquido debe tomarse suficiente cantidad : una
muestra con el asa de siembra.
Técnica de coloración de Gram :

• Cubrir las preparaciones con cristal violeta , durante un minuto, lavar ligeramente con
agua corriente.
• Cubrir con lugol durante un minuto, lavar ligeramente con agua corriente.
• Decolorar con la mezcla alcohol – acetona , escurrir de 5 a 6 gotas y lavar con agua
corriente
• Cubrir con safranina durante 30 segundos , lavar con agua corriente y dejar secar.
• Colocar sobre la coloración una gota de aceite de inmersión .
• Observar al microscopio con la lente de mayor aumento.
1. Cubrir con
cristal violeta 2. Lavar con
(1 minuto) agua corriente
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3. Cubrir con lugol 4. Lavar con
(1 minuto) agua corriente
5. Decolorar con 6. Lavar con agua

alcohol acetona corriente
(5 a 6 gotas)
7. Cubrir con
safranina 8. Lavar con
(30 segundos) agua corriente
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Bacteria Gram
positiva
Bacteria Gram
negativa
RESULTADOS
Graficar lo observado al microscopio
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EVALUACIÓN
1. ¿Cuáles son las principales precauciones del manejo del microscopio y por qué se
debe utilizar el aceite de inmersión al hacer el estudio microscópico de las bacterias ?
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2. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación de un frotis?
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PRÁCTICA Nº 4: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLÓGICO
OBJETIVOS
▪ Comprender la utilidad de los medios de cultivo en el trabajo microbiológico.

▪ Diferenciar los distintos medios de cultivo de acuerdo a su consistencia y función.
INTRODUCCIÓN
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes, que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Debido a que la diversidad metabólica de los microorganismos es
muy amplia, la variedad de los medios de cultivo también lo es. La mayoría de los
medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados , que es preciso rehidratar
La preparación de un medio de cultivo se reduce a pesar la cantidad del medio y
disolverlo en agua destilada ( libre de inhibidores de crecimiento), siguiendo las
instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se
añaden al resto de los componentes previamente esterilizados en la autoclave.
CONDICIONES GENERALES
▪ Presentar todos los elementos necesarios, en sus proporciones y/o cantidades

necesarias.
▪ pH adecuado
▪ Condiciones osmóticas adecuadas
▪ Estéril y preservado de cualquier contaminación.
▪ Medio fresco ya que se desecan y pierden humedad, concentrándose el resto de los
componentes.
COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CUTIVO
▪ Agua : destilada o desionizada

▪ Agar : se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas
algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.
▪ Azúcares : son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más
empleados son : glucosa, lactosa y sacarosa.
▪ Extractos : son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales,
obtenidos con agua y calor. Ejemplo : extracto de carne , de levadura, de
malta.
▪ Peptonas : son proteínas hidrolizadas , se obtienen por digestión química o
enzimática de proteínas animales o vegetales.
▪ Fluidos corporales : sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguíneo, son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos
microorganismos patógenos.
▪ Sistemas amortiguadores : son sales que se añaden al medio para mantener el pH
dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ejemplo : fosfatos bisódicos o
bipotásicos.
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▪ Indicadores de pH : son indicadores ácido-base que se añaden para detectar
cambios de pH en el medio.
▪ Agentes reductores : sustancias que se añaden al medio para crear condiciones que
permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ejemplo : cisteína,
tioglicolato.
CLASIFICACIÓN
▪ Por su consistencia
• Medio de cultivo líquido: caldo Nutritivo, caldo Selenito, caldo Peptonado

• Medio de cultivo semisólido: agar Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM), agar Movilidad,
Indol y Ornitina (MIO)
• Medio de cultivo sólido: agar Sangre, agar Mac Conkey, agar Manitol salado.
▪ Por su función o fines especiales
• Medios nutritivos (simples): con nutrientes mínimos para que las bacterias poco
exigentes desarrollen . Ejemplo: caldo y agar Nutritivo.
• Medios nutritivos enriquecidos: son medios simples a los que se añaden ciertos
productos a manera de suplemento nutritivo que permiten el aporte de factores de
crecimiento. Ejemplo: agar Sangre, agar Chocolate.
• Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que por su composición química

favorecen o permiten la multiplicación de unos microorganismos, inhibiendo
parcialmente la de otros. Ejemplo: caldo Selenito, caldo Peptonado alcalino.
• Medios selectivos: permiten el crecimiento sólo de la especie que se desea aislar, para
lo cual se les agrega colorantes bacteriostáticos: Azul de metileno, Verde de malaquita,
Verde brillante. Ejemplos: agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella (SS), agar
Manitol salado.
• Medios diferenciales: contienen sustancias nutritivas y un indicador de pH que

permite detectar las reacciones bioquímicas específicas de los microorganismos.
Ejemplo: agar Triple azúcar (TSI),agar Úrea, agar Citrato de Simmons.
• Medios de transporte: permite mantener viables a los microorganismos durante el

traslado al laboratorio. Ejemplo: caldo Hafna, Cary Blair, Stuard.
MATERIALES
▪ Caldo nutritivo : en matraz y tubos

▪ Agar nutritivo en matraz ,placas y tubos
▪ Agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella, agar Manitol salado, agar Chocolate,
agar Triple azúcar (TSI), agar Úrea, agar Citrato de Simmons, agar SIM.
METODOLOGÍA
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Observar y diferenciar los medios de cultivo proporcionados en la práctica.
■ Medios Simples:
■ Medios Enriquecidos:
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■ Medios Selectivos:
■ Medios Selectivos:
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EVALUACIÓN
1. ¿Qué medios de cultivo utilizaría para cultivar una secreción abdominal en la que se
sospecha de bacterias anaerobias?
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2. ¿Qué medios de cultivo se utilizan cuando se sospecha de:
▪ Vibrio cholerae :
▪ Clostridium botulinum :
▪ Brucella spp :
▪ Campylobacter jejuni :
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3. ¿Qué precauciones se deben tener antes de sembrar en medios para anaerobios?
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MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO
OBJETIVOS
▪ Conocer y realizar las diferentes técnicas de siembra y aislamiento bacteriano.

▪ Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo puro.
INTRODUCCIÓN
En Microbiología se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una

porción de una población de microorganismos (inóculo), de un cultivo crecido a un
medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con
instrumentos y medios previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los
profesores de práctica. La principal advertencia consiste en trabajar siempre próximos a
la llama del mechero que , debido a las corrientes de convección verticales que genera
es capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de
la llama.
Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el número de células

bacterianas (inóculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo estéril. Al querer
aislar una especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos deben
emplearse técnicas de aislamiento lo que permite, obtenerlas en forma pura. Esto
implica la utilización de medios tanto simples como especiales , mayormente sólidos de
acuerdo a la naturaleza del microorganismo.
Las técnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas :
▪ Por siembra : es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo

con un medio de cultivo, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de
incubación , pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. La finalidad es el
aislamiento para tener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra
problema (orina, heces, secreciones, agua servida).
La siembra puede ser :

▪ Por inoculación
▪ Por estrías simples
▪ Por dispersión o agotamiento
▪ Por puntura
▪ Por diluciones sucesivas : consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del

inóculo, ésta se utiliza cuando se tienen muestras líquidas ( orina, agua ) , se realiza
haciendo diluciones a las muestras : 1 :100, 1:1 000, 1:10 000 etc. Luego se
siembra cada dilución en placas de Petri con medios de cultivo.
Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al examen macroscópico :
morfología de las colonias, actividades bioquímicas o características inmunológicas
de los microorganismos aislados.
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Tomado de Microbiología Tomo II de Granados 2ª edición
Técnica de siembra por diluciones sucesivas
MATERIALES
▪ Asa de siembra en aro y en punta

▪ Tubos de vidrio de 16 x150mm
▪ Tubos de caldo Nutritivo con cultivo mixto bacteriano : Staphylococcus aureus y
Escherichia coli
▪ Placas con agar Nutritivo, agar Sangre y agar Manitol salado
▪ Tubos con caldo y agar Nutritivo
▪ Suero fisiológico estéril
▪ Mechero de Bunsen
METODOLOGÍA
■ Manejo del asa bacteriológica o de siembra :

El profesor demostrará el manejo adecuado del asa y explicará las precauciones que se
deben tener en la toma de la muestra :
▪ Esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar quemar a las bacterias
▪ Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo líquido, ya que en este lugar se encuentra
una mayor concentración de microorganismos.
46
▪ Observar que al retirar el asa del tubo esté cubierta por una película líquida.
El asa de siembra se
toma del
mango como si fuera un
lápiz
El tapón del tubo se

toma
con el dedo meñique
de la mano derecha
La boca del tubo se

flamea después de
abrirlo
y antes de cerrarlo
■ Método de siembra por agotamiento : aislamiento a partir de un cultivo mixto
▪ Con un lápiz graso marcar por detrás de la placa que contiene el agar , las líneas como
está indicado en la figura Nº 1, por lo que quedarán tres sectores : el sector uno (1) el
más pequeño de los otros dos , servirá para descargar el asa.
▪ Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio líquido , cerrar el tubo y
colocarlo en la gradilla.
▪ Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y sembrar
trazando una serie de líneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector uno (1) .
Esto mismo se puede hacer colocando la placa de Petri sobre la mesa y con la palma de
la mano , hacer un movimiento rápido para levantar el fondo que contiene el medio de
cultivo, como lo indicará el profesor.
▪ Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados , hasta que el sector uno (1)
quede a la izquierda y el sector dos (2) hacia arriba. Sin volver a tomar el inóculo, trazar
un zigzag un poco más abierto en el sector dos (2), invadiendo el sector uno (1) en las
primeras líneas del zigzag , pero no en las últimas.
▪ Girar nuevamente la placa 90 grados , ahora el sector dos (2) estará a la izquierda y el
sector tres (3) hacia la derecha.
▪ Hacer un nuevo zigzag en el sector tres (3), invadiendo el sector dos (2) . Este paso
puede repetirse sembrando un cuarto sector.
▪ Incubar las placas a 37º C durante 24 horas. Las placas ya sembradas deberán
colocarse con la tapa hacia abajo y la parte que contiene el agar sembrado hacia arriba.
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1 1
2
2 3
3
Figura Nº 1 Figura Nº 2
■ Método de siembra en caldo de cultivo
▪ Coger el asa de siembra en aro , esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar
por unos segundos.
▪ Abrir la placa que contiene el agar con el crecimiento bacteriano y con la ayuda del
asa de siembra coger una colonia bien aislada (figura Nº 1) .
▪ Luego destapar un tubo con caldo de cultivo (figura Nº 2), coger la torunda, que está
dentro de este con el dedo meñique de la mano con que se está cogiendo el asa de
siembra con la colonia
▪ Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se desprenda la
colonia del asa de siembra.
▪ Introducir la torunda, tapar el tubo, llevar a esterilizar el asa de siembra y
homogeneizar bien el caldo.
▪ Llevar a incubar a 37º C por 12 horas.
Figura Nº1 Figura Nº2
Transcurrido el tiempo de incubación, observar el desarrollo bacteriano en los medios

de cultivo líquido y sólido
▪ Medio líquido : la turbidez indica desarrollo

▪ Medio sólido : presencia de colonias
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RESULTADOS
Realizar la lectura, observar y graficar los resultados.
▪ Staphylococcus aureus
Agar Nutritivo Agar Sangre Agar Manitol

Salado
▪ Escherichia coli
Agar Nutritivo Agar Sangre Agar Manitol

Salado
EVALUACIÓN
1. ¿Qué método de siembra usaría en cada uno de los casos siguientes?
• Cultivo de heces :
• Cultivo de líquido cefalorraquídeo :
• Contaje de colonias en urocultivo :
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2. ¿Por qué el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo bacteriano?
¿Qué sustancias se le pueden agregar para hacerlo enriquecido para bacterias Gram
positivas?
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3. ¿Cuál es la importancia de un cultivo puro?
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PRÁCTICA Nº 5: ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS
 Entender el fundamento del antibiograma, el modo en que se realiza y las principales

fuentes de error.
 Conocer los principales métodos de susceptibilidad a un antimicrobiano.
 Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibióticos de una bacteria de
crecimiento rápido aislada en prácticas anteriores. El método utilizado es el de
difusión en agar o de Kirby-Bauer.
INTRODUCCIÓN
La actividad de los antimicrobianos (antibióticos y quimioterápicos) debe ser evaluada

“in vitro” para obtener la información que permitirá decir si un microorganismo es
susceptible o resistente a determinado producto.
Los antimicrobianos actúan produciendo toxicidad selectiva, no actúan directamente
sobre el huésped, sino que se combinan químicamente con determinados sistemas de los
microorganismos , enfocando así la acción sobre los microorganismos más que sobre el
huésped.
La determinación de la mínima concentración inhibitoria (MIC) nos proporciona la
dosis mínima necesaria del quimioterápico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que
permite hacer estudios de uso clínico y detectar mutantes resistentes.
Dos son los procedimientos empleados para conocer ésta información, el método del
tubo dilución y el del disco difusión en agar, a éste último se le denomina :
antibiograma.
■ Acción de los antibióticos

▪ La actividad antimicrobiana in vitro determina:
a. La potencia de un agente antibacteriano en solución
b. Su concentración en los líquidos del cuerpo o en los tejidos
c. La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas del
medicamento.
▪ Inhibición de síntesis de pared celular: Penicilina, Cefalosporinas, Bacitracina,
Vancomicina, Novobiocina.
▪ Alteración de la permeabilidad de la membrana celular: Anfotericina B, Colistina,
Nistatina, Polimixina.
▪ Inhibición de la síntesis proteica : Aminoglucósidos ( Kanamicina, Amikacina ,
Estreptomicina ), Tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrólidos ( Eritromicina ),
Lincomicinas.
▪ Inhibición de síntesis de ácidos nucleicos : Ácido Nalidíxico, Novobiocina,
Sulfonamidas, Trimetropin, Rifampicina.
■ Medición de la actividad antimicrobiana

Esta se determina mediante los métodos de dilución o difusión, utilizando un
microorganismo standard y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se
utilizan las pruebas de dilución en tubos y el método de difusión.
52
■ Prueba de dilución
En éste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medios

líquidos, se inoculan después con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se
toma cuando la cantidad de sustancias antimicrobiana es capaz de inhibir el crecimiento
o de matar a las bacterias en prueba.
■ Método de difusión
▪ Preparación del inóculo

La técnica del antibiograma sólo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por
ello previamente se procederá, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa.
Cultivar la bacteria aislada en un tubo con medio líquido apropiado (caldo Nutritivo,
Infusión cerebro corazón) o preparar una suspensión directa a partir del cultivo en placa
usando el siguiente método:
a. Tomar una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solución salina
frotando en la pared del tubo.
b. Homogeneizar bien y ajustar la densidad óptica con un patrón de turbidez Nº 0,5 de
Mac Farland : 0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M a 99,5 ml de ácido sulfúrico 0,36 N
0,18 M. Esto equivale a 108 células/ml . Diluir si es necesario la suspensión o añadir
más inóculo.
c. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez, sumergir una torunda
estéril en la suspensión, rotar la torunda estéril varias veces. Presionando firmemente
sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del líquido, para remover el exceso
de inóculo.
d. Inocular la superficie seca de la placa con agar Mueller Hinton estriando con una
torunda en tres direcciones mediante rotación de la placa, para asegurar una distribución
uniforme del inóculo, dejar secar la placa a temperatura ambiente por 3 a 5 minutos para
que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido.
e. Colocar los discos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estéril (o con
un aplicador automático) presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un
contacto completo son la superficie del agar.
Distribuir los discos uniformemente de modo que estén a una distancia de 15 mm del
borde de la placa y a 25 mm uno del otro (el diámetro de los discos según las normas
de la Organización Mundial de la Salud debe ser de 6 mm), no deben colocarse más de
6 discos en una placa.
La dificultad de éste método está en las diferentes velocidades de crecimiento para los
diversos microorganismos.
El uso de un disco para cada antibiótico estandarizado , permite dar el informe de S
(sensible), I (intermedio) y R (resistente)
■ Factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro :

▪ El pH del medio, ya que algunos antibióticos son más activos a pH ácido
(Nitrofurantoína), otros a pH alcalino (Aminoglucósidos , Sulfonamidas)
▪ Los componentes del medio, en este caso las proteínas séricas fijan a las penicilinas
desde 40 % para la Meticilina y 98 % para la Dicloxacilina.
▪ Estabilidad de los medicamentos , a la temperatura de la incubadora varios agentes
antimicrobianos pierden su actividad.
▪ Cuanto más grande sea el inóculo bacteriano, más baja será la sensibilidad del
microorganismo.
53
▪ Cuanto más tiempo se prolonga la incubación, mayor es la oportunidad de presentarse
las mutantes resistentes , igualmente los microorganismos que crecen rápido y
activamente son más sensibles a la acción de los antibacterianos que aquellos que se
encuentran en fase de reposo.
■ Dilución en tubo
▪ Se obtiene un resultado cuantitativo , destacando dos características importantes :
▪ Concentración mínima inhibitoria (CMI) : es la concentración mínima de

antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo.
▪ Concentración mínima bactericida (CMB) : es la concentración que mata a los
microorganismos.
Normalmente la CMI es suficiente para combatir una determinada infección, ya que los
mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar al microorganismo.
MATERIALES
▪ Caldo de cultivo con suspensión bacteriana a la escala de turbidez de Nº 0,5 de Mc

Farland
▪ Placas de Petri con agar Mueller Hinton
▪ Torundas estériles
▪ Discos impregnados con diferentes antibióticos
▪ Pinzas estériles.
METODOLOGÍA
▪ Sumergir la torunda en caldo tripticasa de soya con cepa bacteriana , presionar firme
sobre las paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de la placa de agar
Mueller Hinton.
▪ Colocar con la ayuda de pinzas, los discos impregnados con diferentes antibiótico
sobre la superficie del agar.
▪ Los discos deben quedar a una distancia de 25 mm entre ellos.
▪ Incubar a 37°C durante 24 horas.
Realizar la lectura, observar y anotar los resultados.
■ Lectura de los discos de sensibilidad: El diámetro de la zona de inhibición se mide

con una regla milimetrada, colocada debajo de la placas de Petri.
54
El límite del área de inhibición está dado por la inhibición completa del desarrollo, tal
como se puede apreciar a simple vista.Los milímetros de la lectura serán llevados a la
tabla correspondiente para traducir su interpretación en los términos : Sensible (S),
Intermedio (I) ,Resistente (R).
Tomado del Manual de laboratorio

para la identificación y prueba de
susceptibilidad a los antimicrobianos
de patógenos bacterianos de
importancia para la salud pública en
el mundo en desarrollo. Organización
Mundial de la Salud 2004.
Sensible
Resistente
Lectura de lo halos de Inhibición de los discos de sensibilidad
Quimioterápico Concentración del Halo de Inhibición

Disco mcg Sensible Intermedio
Resistente
Ampicilina AM 10 ug +17 14-16 -13
Amikacina AK 30 ug +17 -15
Ac. Nalidíxico AN 30 ug +19 14-18 -13
Cefalotina CF 30 ug +18 15-17 -14
Cefoxitina CTX 30 ug +21 16-10 -15
Ceftriaxona CRO 30 ug +21 14-20 -13
Cloranfenicol C 30 ug +18 15-18 -14
Kanamicina K 30 ug +18 14-17 -13
Nitrofurantoina FD 300 ug +17 15-16 -14
Sulfatrimetoprim 231,2 ug +16 11-15 -10
SXT 5 ug +21 16-20 -15
Ciprofloxacino CIP
55
Antibiótico S I R
Antibiótico S I R
EVALUACIÓN
1. ¿Qué importancia clínica tiene el antibiograma?
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2. Mencione cuatro (4) posibles causas de error en el procesamiento o lectura del

antibiograma.
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3.. ¿En qué casos es necesario realizar la concentración mínima inhibitoria?
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PRÁCTICA Nº 6: CULTIVO DE MUESTRAS CLÍNICAS: UROCULTIVO Y
COPROCULTIVO
OBJETIVOS
▪ Conocer el procedimiento para el cultivo de una muestra clínica.
▪ Identificar los microorganismos más frecuentes causantes de patologías clínicas.
▪ Conocer las condiciones para una adecuada toma de muestra para cultivo de una
muestra clínica.
■ CULTIVO DE ORINA: UROCULTIVO
La infección del tracto urinario (ITU) , se define como la presencia y multiplicación de

microorganismos en el tracto urinario con invasión de tejidos adyacentes. La presencia
de leucocitos en la orina , indica una respuesta inflamatoria del tracto urinario, la
mayoría de las veces debido a una invasión tisular por bacterias. Por lo general la piuria,
está presente en las ITU , por lo que se le considera un criterio diagnóstico para ésta
enfermedad.
La mayoría de las ITU son causadas por bacilos Gram negativos de las enterobacterias ,
siendo la Escherichia coli y Klebsiella sp, los más frecuentemente aislados , en
infecciones no complicadas. También pueden ser causa de ITU otros bacilos Gram
negativos como Proteus sp , Enterobacter sp y Pseudomona aeruginosa sobre todo en
pacientes sometidos a instrumentación, portadores de catéteres urinarios, con anomalías
anatómicas o funcionales del tracto urinario y en pacientes hospitalizados.
Entre las bacterias Gram positivas pueden estar Staphylococcus epidermidis y

Enterococcus sp. En la mayoría de las ITU , se recupera un único microorganismo en la
orina. La presencia de más de una especie bacteriana puede deberse a una
contaminación de la muestra o pacientes con infecciones complicadas como por
ejemplo litiasis , abscesos renales o sondaje prolongado.
El diagnóstico definitivo de la ITU se hace mediante el cultivo de orina : urocultivo .

Hay que considerar que por cuidadosa que sea la técnica de toma de muestra ( salvo
punción suprapúbica) , es difícil excluir la contaminación de la orina con las bacterias
del tramo distal de la uretra , lo que puede causar interpretaciones erradas.
La orina de micción media es la más recomendable para el urocultivo. En pacientes

femeninas es recomendable el lavado de genitales externos, en el paciente masculino
retraer la piel del prepucio. La primera parte de la micción casi siempre estás
contaminada con la flora bacteriana uretral, por lo cual se debe descartar . La micción
media debe recogerse en un envase estéril. Se recomienda obtener la primera muestra de
orina de la mañana , donde se encuentra mayor número de bacterias.
El cultivo de orina se realizará para identificar y cuantificar el número de bacterias

presentes por mililitro en la orina, lo que se expresa en unidades formadoras de colonias
(UFC) . La muestra de orina debe enviarse el laboratorio en el plazo máximo de 2 horas
a temperatura ambiente, puesto que la orina es un buen medio de cultivo para muchas
59
bacterias y la multiplicación de los gérmenes entre el momento de la toma de muestra y
el cultivo, alterará los resultados.
Es recomendable que en todas las muestras de orina para urocultivo , se realice un

examen microscópico cuantitativo , para determinar el número de leucocitos por
milímetro cúbico.
MATERIALES
▪ Frasco estéril de 100 ml

▪ Asa de siembra calibrada 0,01ml
▪ Pipetas graduadas de 1ml estériles
▪ Placas con agar Mac Conkey y Eosina azul de metileno
▪ Láminas portaobjetos , laminilla
▪ Equipos de coloración para tinción de Gram
▪ Centrífuga y microscopio
METODOLOGÍA
▪ Evitar la contaminación de la muestra, utilizando equipos estériles: frascos, pipetas,

placas de Petri, tubos de pruebas estériles.
▪ Examen directo:
• Centrifugar aproximadamente 10 ml de orina por tres (3) minutos a 3 000 rpm y
luego decantar el sobrenadante y observar el sedimento al microscopio a lente de 40X
▪ Cultivo
▪ Con el asa de siembra calibrada : 0,01 ml, previa agitación de la muestra , tomar una
muestra con el asa y sembrar por estrías en agar Mac Conkey, previamente dividida en
cuatro cuadrantes , empezando las estrías por el primer cuadrante y sin esterilizar el asa
continuar la siembra en el segundo, tercer y cuarto cuadrante.
▪ Rotular la placa e incubar 24 horas a 37º C.
60
RESULTADOS
Realizar la lectura de la placa y a partir de una colonia bien aislada realizar las pruebas
bioquímicas para la diferenciación.
Realizar el contaje de colonias para obtener el recuento total de UFC/ml.
Sedimento urinario Agar Mac Conkey
TSI Citrato LIA SIM
61
■ CULTIVO DE HECES: COPROCULTIVO
La diarrea puede definirse como el proceso de eliminación frecuente de heces,

disminución de su consistencia o ambas cosas. El diagnóstico etiológico se realiza
mediante el cultivo de los microorganismos presentes en la materia fecal : Coprocultivo
, realizándose primero el aislamiento y luego la identificación de las bacteria presentes
en las heces.
Las bacterias causantes de diarreas más frecuentes son : Salmonella, Shigella y

Escherichia coli enteropatógena .También puede producirse cuadros diarreicos por :
Campylobacter sp, Yersinia enterocolítica ,Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus y
Clostridium difficile.
Para realizar este procedimiento se requiere que la muestra se colecte en el curso de la

enfermedad, antes de iniciar tratamiento y que se deposite en un frasco estéril,
procurando no mezclarla con la orina. Si esto no es posible es conveniente conservar la
muestra en un medio de transporte adecuado manteniendo en refrigeración hasta su
siembra.
Muestras inaceptables:
▪ Muestras no conservadas de más de 4 a 6 horas.
▪ Muestras múltiples el mismo día
▪ Muestras contaminadas con orina.
METODOLOGÍA
▪ Examen Directo
El examen microscópico directo de las heces permite la observación de
polimorfonucleares, lo que sugiere la infección de por un patógeno invasivo.
Examen en fresco y/o tinción de Azul de metileno de Loeffler.
Tinción de Gram : permite observar polimorfonucleares y flora predominante.
▪ Inoculación
El coprocultivo se realiza a partir de muestras recién emitidas de preferencia, de las
cuales se inoculan los medios de cultivo.
• Medios diferenciales
Para diferenciar a los bacilos entéricos fermentadores de lactosa (L+) de los no
fermentadores de lactosa (L -), e inhibir el crecimiento de la flora Gram positiva
aerobia: agar Mac Conkey, agar Eosina azul de metileno, agar Endo.
• Medios selectivos
Para inhibir el crecimiento de la mayoría de las enterobacterias y permitir el crecimiento
de Salmonella spp y Shigella spp : agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) y agar
Salmonella – Shigella (SS)
• Medio líquido
Utilizar medio Selenito F para suprimir el crecimiento de la flora normal durante las
horas iniciales de incubación. Se resiembran en medio sólido a partir de las 6 horas.
Este medio de cultivo es fundamental para el estudio de portadores asintomáticos.
62
• Medios especiales
Vibrio spp
Medio de enriquecimiento: agua peptonada alcalina a partir de 6 horas , subcultivar en
agar Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sucrosa (TCBS)
Medio selectivo :TCBS
Campylobacter medio selectivo : medio CAMP
MATERIALES
• Muestra de heces
• Placas de Petri con agar SS, EMB
• Tubos con caldo Selenito
• Láminas portaobjetos y laminillas
• Asas de siembra
• Tubos con medios diferenciales o bioquímicos.
RESULTADOS
Realizar la lectura de los medios de cultivo y las colonias sospechosas , realizar las
pruebas bioquímicas para diferenciar las especies de enterobacterias.
Agar XLD Agar SS
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TSI Citrato LIA SIM
■ CULTIVO DE SANGRE: HEMOCULTIVO
La detección de microorganismos viales en muestras de sangre tiene gran importancia

diagnóstica. Cuando bacterias u hongos se multiplican a una razón que supera la
capacidad del sistema retículoendotelial del torrente sanguíneo , se produce bacteriemia
y fungemia. Bacteriemia persistente o crónica ocurre cuando no se ha podido localizar o
drenar adecuadamente, el foco de la infección.
La entrada directa de bacteria al torrente sanguíneo ocurre en infecciones

intravasculares como : endocarditis, fístulas arteriovenosas, aneurismas micóticos,
flebitis supurativas, catéteres intravenosos infectados y arteriales permanentes. Es
importante comprender las circunstancias en que puede desarrollar una bacteriemia para
planificar los métodos de diagnóstico así como la interpretación de los resultados. Las
fuentes de bacteriemias son : sistema genitourinario 25 %, sistema respiratorio 20 % ,
abscesos 10%, heridas quirúrgicas 5 % , otros sitios conocidos 10 % y sitios
desconocidos 25 %.
Siempre que exista una razón para sospechar de bacteriemia se debe practicar el cultivo
de la sangre, periférica o medular. Ya que en muchas ocasiones solo se puede establecer
el diagnóstico mediante este procedimiento. El aislamiento de un microorganismo de
los hemocultivos es transcendente porque establece el diagnóstico etiológico de la
bacteriemia y permite la elección del tratamiento.
Sepsis agudas, osteomielitis, meningitis , neumonía , pielonefritis: en estos casos el

hemocultivo debe considerarse un procedimiento de urgencia.
Bacteriemia continua de origen intravascular como endocarditis, infecciones asociadas a
catéteres , de origen desconocido, con sospecha de fungemia e inmunodeprimidos, la
muestra se puede tomar en cualquier momento.
Bacteriemias intermitentes: lo ideal es realizar la prueba cuando el paciente presenta
escalofríos o poco después o durante del pico febril. Entre el 14 y 25 % de los pacientes
64
hospitalizados, tienen sospecha de bacteriemia y en un 14 % de los casos esta prueba
establece el diagnóstico.
INDICACIONES
• Fiebre alta aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar con
hipotermia y deterioro general, shock no explicado, infecciones localizadas,
leucopenia, leucocitosis o trombopenia no relacionada con procesos hematológicos .
• Siempre se deben realizar en un mínimo de dos (2) horas.
• Nunca debe refrigerarse antes de su envío , puede conservarse en estufa.
MATERIALES
Cultivos en medios Ruíz -Castañeda
METODOLOGÍA
Se observarán los medios usados para hemocultivo.
RESULTADOS
Grafique lo observado en la práctica.
65
■ EXUDADOS VAGINALES (exocervicales)
La mucosa vaginal tiene una flora microbiana normal , cuyo crecimiento y
consideración son importantes para el estudio microbiológico de las infecciones
vaginales. Se pueden considerar tres situaciones :
• Conocer cuando se altera el equilibrio de esta flora colonizante
• Búsqueda de agentes exógenos , trasmitidos normalmente por vía sexual
• Detección de portadoras de determinados microorganismos
La mayoría de las situaciones clínicas que pueden ser objeto de estudios

microbiológicos para el aislamiento o visualización del agente etiológico son :
• Vulvovaginitis : agentes etiológicos más frecuentes : Cándida spp , principalmente C.

albicans; Trichomonas vaginalis y virus Herpes simple.
La presencia de un cultivo puro de otros microorganismos observados en tinción de
Gram con leucocitos , puede tener significación.
• Vaginosis : desde el punto de vista microbiológico se caracteriza por la ausencia o

disminución de la flora mixta compuesta por Gardnerella vaginalis, anaerobios
(Mobilluncus, Bacteroides, cocos anaerobios) y Mycoplasma hominis.
• Infección gonocócica : la endocervicitis gonocócica cursa con leucorrea , el exudado

vaginal no es la muestra adecuada para el diagnóstico por lo que se recomienda la
obtención de exudado endocervical.
Tipos de estudios microbiológicos

• Cultivo bacteriano
• Cultivo de levaduras
• Despistaje de Streptococcus agalactiae
• Cultivo de virus Herpes simple ya que requiere de toma de muestra y medio de
transporte y cultivos especiales, se realiza por petición expresa del clínico.
Toma de muestra
• No debe usarse antiséptico previo a la toma de la muestra . Si se utiliza espéculo,

lubricar con agua caliente.
• Se recomienda tomar dos (2) hisopados .
• Se introduce un hisopo estéril en la vagina y se recoge la muestra de la zona de mayor
exudado o en su defecto del fondo del saco vaginal posterior. Se introduce el hisopo en
el medio de transporte.
• El envío de la muestra al laboratorio debe de ser de inmediato siempre que sea
posible. Cuando no se pueda procesar la muestra de inmediato, se mantendrá en
refrigeración o a temperatura ambiente.
• Si se sospecha de infección gonocócica, no refrigerar la muestra.
• Tiempo máximo de procesamiento con medio de transporte : 24 horas.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Uno de los hisopos se empleará para el examen microscópico y el otro para el cultivo.
66
Examen microscópico : es el único método aceptado para el diagnóstico microbiológico
de la vaginosis bacteriana. Se hará una extensión del hisopo en lámina y tinción de
Gram.
Cultivo : se pueden establecer diferentes combinaciones de medios en función de la

orientación diagnóstica : agar Sangre en atmósfera de CO2 , agar Chocolate en
atmósfera de CO2, Mac Conkey, agar Thayer Martin en atmósfera de CO2, medio para
Gardnerella en atmósfera de CO2 , Sabouraud con antibiótico u otro medio para
Cándida, caldo para cultivo de Trichomona vaginalis.
Examen de la muestra
Examen microscópico : en el exudado vaginal normal se observará flora regional con

predominio de morfotipo Lactobacillus sp y células epiteliales
Presencia de leucocitos
Presencia de levaduras o pseudohifas
Presencia única o abundante , de cualquier otro microorganismo
Exudado característico de vaginosis bacteriana

Presencia de células clue : células epiteliales recubiertas por bacilos o cocobacilos Gram
variables.
Ausencia o escasos leucocitos.
Flora mixta alterada.
Examen en medios de cultivo
El examen en medios de cultivo : examinar todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no

hay crecimiento de patógenos , incubar hasta la 48 horas , a excepción del cultivo en
agar Mac Conkey que se descarta a las 18 horas. El agar Thayer Martin se incubará
hasta 72 horas si es negativo.
• Agar Sangre : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial

Streptococcus pyogenes o Streptococcus pneumoniae.
• Agar Chocolate : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial
Haemophilus sp.
• Agar Mac Conkey : presencia de enterobacterias.
• Agar Thayer Martin : presencia de colonias grises brillantes de distintos tamaños,
oxidasa positivo, compatibles con gonococo.
• Medio Gardnerella : presencia de colonias β hemolíticas puntiformes en gran
cantidad posiblemente Gardnerella vaginalis.
• Agar Sabouraud : presencia de levaduras.
■ SECRECIÓN URETRAL
La uretritis es el síndrome más común dentro de las Enfermedades de Transmisión

Sexual (ETS), aunque muestra un claro descenso en las últimas décadas en relación con
otras ETS, tanto en España como en otros países desarrollados. Atendiendo a su
etiología se clasifican en uretritis gonocócica y no gonocócica (UNG) , siendo estas
últimas las más frecuentes en países desarrollados.
67
N. gonorrhoeae es responsable en nuestro medio de menos del 25 % de todos los
episodios de uretritis. Los restantes son causados por C. trachomatis, Ureaplasma
urealyticum y por un número variable de otros potenciales patógenos en los que la
asociación causa-efecto con la uretritis está menos aclarada . La asociación de más de
un patógeno como causa de la uretritis es más que anecdótica y la más frecuente de ellas
es la asociación de C. trachomatis y N. gonorrhoeae. Un dato significativo es la
presencia de T. vaginales como único agente encontrado hasta en un 4 % de las
uretritis no gonocócicas. Cuadros de uretritis pueden estar causados por la presencia de
condilomas intrauretrales.
La gonorrea usualmente se desarrolla a los 2 a 6 días tras la exposición, en tanto que la

UNG es variable, desde 1 a 5 semanas. Tanto las uretritis gonocócicas como las no
gonocócicas producen supuración uretral, disuria y escozor.
El diagnóstico de uretritis se establece si al menos se dan de los siguientes supuestos
▪ Síntomas : historia de secreción uretral y/o disuria
▪ Demostración con tinción Gram : más de 5 leucocitos polimorfonucleares por campo
de 1 000 aumentos en el examen directo de la secreción uretral.
Los pacientes con síntomas de uretritis, sin secreción, visible, deben ser
examinados, pidiéndoles que no miccionen en las 4 a 8 horas previas a la toma de
muestra . Se obtienen los 5 a 10 primeros ml de orina y tras la centrifugación a 400 rpm
se examinan al microscopio de 400 aumentos. La presencia de más de 15 leucocitos
polimorfonucleares por campo confirma el diagnóstico de uretritis.
Los síntomas de la uretritis gonocócica puede permanecer hasta más de 7 días, por ello
la uretritis postgonocócica se suele diagnosticar después de transcurrido este período.
En el examen con tinción de Gram, la presencia de diplococos Gram negativos (DGN)
intracelulares , establece el diagnóstico de uretritis gonocócica. La presencia de células
inflamatorias en el exudado uretral en ausencia de diplococos Gram negativos y cultivo
negativo para establecer el diagnóstico de UNG.
El éxito del diagnóstico microbiológico de la uretritis gonocócica depende de la correcta

obtención, transporte y procesamiento de muestras. En cada muestra deben emplearse
dos hisopos, uno para el cultivo y otro para la extensión del exudado uretral para
realizar la tinción de Gram. Las muestra para cultivo deberán inocularse en medios
selectivos (Thayer Martin modificado, Martin- Lewis ) e incubarse de modo inmediato a
35 a 37ºC durante 72 horas en una atmósfera de 3 a 10 % de CO2 y humedad. Cuando
esto no sea posible , es necesario inocular las muestras en medio de transporte (Stuart o
Amies ) .
Examen microscópico : en la secreción uretral se debe observar presencia de células y

bacterias, en especial diplococos Gram negativos intra y extracelulares.
Evaluar : presencia de leucocitos polimorfonucleares.
Examen en medios de cultivo : examinar, todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no

hay crecimiento de patógenos , incubar hasta la 48 horas. El agar Thayer Martin se
incubará hasta 72 horas si es negativo.
Agar Sangre : Streptococus pyogenes o Streptococus pneumoniae
Agar Chocolate : Haemophilus sp, Thayer Martin ,gonococo.
68
Pruebas bioquímicas : a las colonias sospechosas realizar las pruebas bioquímicas :
Prueba de oxidasa y fermentación de carbohidrato para Neisseria.
EVALUACIÓN
1. Esquematizar un flujograma de urocultivo
2 .¿Cuáles son los agentes bacterianos más frecuentes, que se aislan en los cultivos de
catéteres intravenosos?
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69
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3. Esquematizar un flujograma de secreción de herida.
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS
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70
PRÁCTICA Nº 7: IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
OBJETIVOS
▪ Conocer los procedimientos de identificación bioquímica de las principales bacteria

Gram negativas.
▪ Interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas y correlacionarlas con la
diferentes especies de bacterias Gram negativas.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias Gram negativas pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los
primeros los más abundantes tanto en el hombre como en los animales. Varios de estos
microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal , algunos están asociados a
infecciones entéricas y a procesos infecciosos (especialmente cuando éstas bacterias
invaden otros órganos o sistemas).
Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal , de un portador sano o
de la diseminación endógena de la bacteria en una persona susceptible, pudiéndose ver
afectado cualquier órgano del cuerpo.
Familia de bacilos entéricos
Esta familia Enterobacteriaceae, incluye a varios patógenos que causan síndromes

diarreicos . Un gran número de ensayos han sido desarrollados a manera de identificar
rápidamente al patógeno, para que posteriormente el médico, con base en el reporte,
indique el tratamiento adecuado o para que los epidemiólogos puedan localizar la fuente
de infección. Dentro de los bacilos Gram negativos , las enterobacterias son
responsables del 30 a 35 % de todas las septicemias, más del
70 % de todas las infecciones del tracto urinario y muchas infecciones intestinales.
Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiológicos de infecciones
entéricas tenemos : Salmonella , Shigella, y Escherichia coli. Estas pueden producir
cuadros diarreicos e infección sistémica , que son procesos infecciosos que se diseminan
generalmente por vía sanguínea o linfática.
MEDIOS DE AISLAMIENTO PRIMARIO
Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el

desarrollo de otras. Esta capacidad puede ser moderada (agar Eosina azul de metileno
(EMB) y Mac Conkey) y alta (agar Salmonella-Shigella, Desoxicolato y Citrato) o
completamente específica (Sulfato de bismuto y Verde brillante).
Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que
permite desde el principio tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como
Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa : Salmonella, Shigella.
MEDIOS DIFERENCIALES : PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Son aquellos en los que se pone de manifiesto las propiedades metabólicas de los
microorganismos frente a diferentes sustratos. Existen medios que permiten observar
71
una, dos o más características metabólicas de la bacteria inoculada . Entre los más
utilizados están :
▪ Agar Triple Azúcar (TSI): medio sólido que contiene glucosa, sales de hierro
y un indicador de pH. Permite conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los
carbohidratos. Se detecta la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S), así como de gas.
El tubo se siembra por picadura y en estría por lo que se debe observar tanto el fondo
como la superficie del medio
▪ Agar Lisina Hierro (LIA) : medio sólido que contiene lisina, sales de hierro, glucosa
y un indicador de pH. Se determina la descarboxilación y desaminación oxidativa de la
lisina, la producción de ácido sulfhídrico o sulfuro de hidrógeno (H2S) y la
fermentación de glucosa. Se siembra por picadura y estría.
▪ Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM) : medio semisólido, se utiliza en la

producción de sulfuro de hidrógeno, la formación de Indol y movilidad. Se inocula con
una única punción con asa de siembra recta a través del centro, hasta una profundidad
de unos dos tercios del medio.
▪ Agar Citrato de Simmons : medio sólido que contiene citrato de sodio, compuesto
que puede ser utilizado como única fuente de carbono, por algunas bacterias. Se siembra
por picadura y estría
• Agar Úrea (Método de Christensen) : medio sólido, se utiliza para determinar la

capacidad de un organismo para producir la enzima ureasa, que hidroliza la úrea . La
hidrólisis de la úrea produce amoníaco y anhídrido carbónico. La formación de
amoníaco alcaliniza el medio y el cambio de pH se detecta por el cambio de color del
rojo fenol de naranja pálido a magenta.
Existen más pruebas bioquímicas que pueden utilizarse como complemento a las ya
descritas como son : rojo de metilo, Voges Proskawer, utilización de malonato, las
cuales ayudan a determinar la especie del microorganismo aislado. En ocasiones a pesar
de recurrir a diversas pruebas metabólicas, no se consigue la identificación , siendo
necesario realizar reacciones inmunológicas para llegar al diagnóstico definitivo.
BACTERIAS PIÓGENAS GRAM NEGATIVAS
Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clínica son las
bacterias piógenas Gram negativas, que pueden ser cocos o cocobacilos . Las
enfermedades que producen por lo general incluyen la acumulación de abundantes
cantidades de pus y afectan frecuentemente el aparato genital o respiratorio. Dichas
enfermedades comprenden : uretritis purulenta (gonococo) , meningitis , neumonías ,
bronquitis, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, epiglotitis etc.
Las bacterias piógenas Gram negativas patógenas en humanos son : Neisseria,
Haemophilus, Bordetella, Moraxella.
Las bacterias del género Neisseria son diplococos Gram negativos inmóviles, cuyos
lados adyacentes son aplanados y ligeramente cóncavos. Sólo dos especies de este
género son patógenas exclusivamente de humanos : Neisseria gonorroheae o gonococo,
agente causal de la enfermedad de transmisión sexual, la gonorrea y la
N .meningitidis o meningococo productos comensales para el hombre y que habitan
principalmente el tracto respiratorio superior.
72
Esporádicamente se pueden comportar como patógenos oportunistas N. sicca y N.
mucosa.
El diagnóstico definitivo de una infección gonocócica se hace por el aislamiento en

cultivo de N. gonorrhoeae.
Para el diagnóstico del gonococo, el lugar de la toma de la muestra dependerá de la
edad, sexo y de las características de la infección.
La tinción de Gram es el método de elección para el examen directo de las muestras.
Son oxidasa positiva.
Para los cultivos , el medio debe ser de preparación reciente, bien hidratado y
precalentados. Se utilizan medios selectivos como agar Thayer Martin modificado. Se
debe utilizar un medio no selectivo ya que algunas cepas pueden inhibirse por los
antimicrobianos contenidos en los medios selectivos. Debe estar además en una
atmósfera que contenga de 3 a 5 % de CO2.
El diagnóstico de la infección meningocócica, se hace con el aislamiento de N.
meningitidis a partir de líquido cefalorraquídeo, sangre, líquido sinovial, pleural o
pericárdico. Las más utilizadas son las dos primeras.
Con la tinción de Gram se observan como diplococos Gram negativos, crecen en los
medios de cultivo enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmósfera de CO2.
Son oxidasa positivo y fermentan los carbohidratos.
MATERIALES
▪ Placas con agar Eosina azul de metileno sembradas con cepas problemas.
▪ Placas con medio Mac Conkey, Eosina azul de metileno (EMB) y Salmonella-Shigella
▪ Tubos con medio TSI, Citrato de Simmons, LIA, ÚREA, SIM, sin sembrar y
sembrados con cepa problema
▪ Asas de siembra
▪ Reactivo de Kovacs
▪ Láminas fijadas con frotis de líquido cefalorraquídeo con tinción de Gram.
▪ Microscopio
▪ Aceite de inmersión
▪ Placas de cultivo con agar Chocolate.
METODOLOGÍA
■ Enterobacterias
▪ En las prácticas se harán los trabajos de laboratorio que nos permitan observar las
características de cultivo y con ello su identificación
▪ A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa de siembra previamente
esterilizada una muestra y sembrar por estrías en los medios Eosina azul de metileno y
Salmonella – Shigella. Incubar a 37ºC por 24 horas.
▪ Transcurrido el tiempo de incubación , observar la morfología de las colonias de las
placas sembradas (Mac Conkey, EMB y S-S).
▪ Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato de Simmons,
LIA y SIM. Esto se hace por puntura en los medios y luego en estrías en la parte de
inclinación (pico de flauta) como lo indicará el profesor en cada medio. Llevar a incubar
a 37ºC por 18 a 24 horas.
73
▪ Hacer la lectura de las pruebas bioquímicas, interpretar y realizar la identificación del
microorganismo proporcionado.
■ Interpretación Bioquímica
Agar Triple Azúcar (TSI):

▪ Fermentación de glucosa : en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a color
amarillo. Es una reacción débil.
▪ Fermentación de sacarosa : en todo el tubo el medio cambia a amarillo,
principalmente en el fondo, donde se intensifica el color debido a la reacción de la
glucosa.
▪ Fermentación de lactosa : en la superficie el medio vira a amarillo.
Debido a la fermentación puede hacer producción de gas, lo que se manifiesta por la
presencia de burbujas en el medio.
▪ Producción de ácido sulfhídrico o sulfuro de hidrógeno (H2S): por degradación
enzimática de aminoácidos que contienen azufre originan un precipitado de color negro.
La producción de H2S tiene lugar en ambiente ácido, de ahí que el precipitado negro se
concentre en el fondo del tubo, donde se generan ácidos a partir de la glucosa. Así , un
fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se
haya enmascarado con el precipitado negro.
Agar Lisina Hierro (LIA) :

▪ Descarboxilación de lisina : el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramente
morado en la superficie.
▪ Fermentación de la glucosa : en el fondo del tubo el medio vira a amarillo.
▪ Desaminación de la lisina : vira a color rojizo en la superficie del medio. Es
característico de Proteus y Providencia.
▪ Producción de H2S : precipitado de color negro ( por el mecanismo citado
anteriormente).
Agar Citrato de Simmons :

▪ Utilización de citrato como fuente de carbono : el medio vira a color azul.
Agar Úrea :
▪ Los microorganismos que hidrolizan la úrea producen un cambio de color en el pico
de flauta de naranja pálido a magenta.
Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM) :

▪ Motilidad: Los cultivos móviles muestran un crecimiento difuso o turbidez lejos de la
línea de inoculación , por lo que observando si el crecimiento está solo en la picadura o
se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el microorganismo es inmóvil o
móvil.
▪ Indol : la aparición transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la
interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por lo tanto , la
prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehído del
reactivo originando un complejo de color rojo.
▪ Producción de H2S: precipitado de color negro ( por el mecanismo citado
anteriormente).
74
Escherichia
coli
Klebsiella
Salmonella
75
Shigella
76
RESULTADOS
Realizar la lectura e identificación de los microorganismos, observar y anotar los

resultados.
• Escherichia coli :
TSI LIA Citrato de Úrea SIM

Simmons
• Klebsiella sp

Simmons
77
• Proteus sp
TSI LIA Citrato de SIM

Simmons Úrea
• Salmonella sp

Simmons
• Shigella sp

Simmons
78
PSEUDOMONAS
Las especies pertenecientes al género Pseudomonas son ubicuos, se encuentran en

la tierra, materia orgánica en descomposición, en la vegetación, en el agua. También
podemos encontrar estos microorganismos en el ambiente hospitalario, en lugares
húmedos, como comida, baños, respiradores. No forman parte de la flora normal del ser
humano con excepción de los pacientes hospitalizados y en pacientes ambulatorios
inmunodeprimidos. Debido a
las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad nutricional , se logra su
amplia distribución ambiental, siendo capaces de utilizar un gran número de
compuestos orgánicos como fuentes de carbono y nitrógeno.
Son bacilos Gram negativos móviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios
estrictos, la mayoría de las cepas son móviles por medio de uno o más flagelos polares;
utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera oxidativa; y suelen ser
citocromo oxidasa positivos
El género Pseudomonas se divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente, Grupo
Stutzeri, Grupo Alcalígenes y Grupo con pigmento amarillo.
Grupo fluorescente : Pertenecen a este grupo las especies : Pseudomona aeruginosa,
Pseudomona fluorescens y Pseudomona putida , las cuales se caracterizan por la
producción de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da fluorescencia blanca a verde
azulada bajo luz ultravioleta de longitud de onda larga (400 nm). Sólo una especie,
Pseudomona aeruginosa , produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina.
Pseudomona aeruginosa produce un aspecto característico cuando crece en una
placa de agar sangre , se pueden observar grandes colonias grises y presenta beta
hemólisis. Las colonias tienen un aspecto de piel de caimán y con brillo metálico.
La exudación de pus azulado, con olor similar a las uvas , por la producción de
piocianina es característico en las heridas infectadas por este microorganismo. La
piocianina es un antibiótico que puede permitir que la Pseudomona aeruginosa exista
en la naturaleza, también puede desempeñar un papel en la nutrición , al funcionar como
una forma de adquirir fosfatos inorgánicos. Se puede realizar una identificación rápida
de Pseudomona aeruginosa si se observan las siguientes características : morfología
típica de las colonias, producción de pigmentos difusibles, olor a fruta y positividad en
la prueba de oxidasa.
CARACTERÍSTICAS DEL GRUPO FLUORESCENTE :
PRUEBA Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas

aeruginosa fluorescens putida
PIOVERDINA + + +
PIOCIANINA + - -
MATERIALES
▪ Placas con agar Nutritivo sembrada con cepa problema.

▪ Asas de siembra
79
Pseudomonas
aeruginosa
piocianina
RESULTADOS
EVALUACIÓN
1.¿Cuáles son las principales enterobacterias causantes de cuadros diarreico?
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2. Realizar un flujograma para la identificación de bacterias Gram negativas.
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81
PRÁCTICA Nº 8: DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS GRAM
POSITIVAS
OBJETIVOS
▪ Reconocer las características morfológicas y en los cultivos de las bacterias Gram

positivas
▪ Identificar bioquímicamente las diferentes bacterias Gram positivas de importancia
clínica.
INTRODUCCIÓN
Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clínica con forma
de cocos como Staphylococcus aureus, especies de Streptococcus , principalmente S.
pneumoniae y cocos anaerobios : Peptostreptococcus.
Entre los bacilos Gram positivos patógenos más comunes tenemos Bacillus anthracis,
Clostridium, Gardnerella, Listeria , Corynebacterium.
Todas esta bacterias se encuentran causando procesos infecciosos en los seres humanos
y en algunos casos estas se encuentran colonizando alguna parte del cuerpo junto con
bacterias de la flora normal. Por eso se hace necesario para su aislamiento e
identificación realizar toma de muestras y procesamiento bacteriológicos correctos.
Dentro de los Gram positivos, los cocos y en especial las especies de Streptococcus y
los Staphylococcus son los más fáciles de aislar e identificar mediante observación de
hemólisis, pruebas bioquímicas o diferenciales específicas como la prueba de catalasa
para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus , la prueba de coagulasa para
diferenciar Staphylococcus patógenos de los no patógenos, la reacción de Quellung para
distinguir neumococos etc.
MATERIALES
▪ Cultivos de Streptococcus pneumoniae en agar Sangre

▪ Cultivo de Staphylococcus aureus en agar Manitol salado y agar Sangre
▪ Tubos con plasma (1ml ) y pipetas graduadas de 1 ml estériles
▪ Reactivo de peróxido de hidrógeno
▪ Equipo para la coloración de Gram
▪ Asas bacteriológicas
▪ Mecheros
▪ Microscopios
METODOLOGÍA
Pruebas bioquímicas para Staphylococcus y Streptococcus

▪ Observar el tipo de hemólisis que presentan las placas de agar Sangre
▪ Realizar la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar Sangre y con una de
Manitol salado.
82
▪ Para la prueba de coagulasa , en dos tubos con un ml de plasma cada uno, depositar
en uno 0,5 ml del cultivo de Staphylococcus aureus y en otro un ml de Streptococcus
epidermidis . Incubar 30 minutos a 37º C.
▪ Preparar un frotis con las colonias que han desarrollado en el agar Sangre y en agar
Manitol salado.
Preparación de Frotis :
1. Con el asa de siembra

tomar una colonia de la
placa de Petri
2. Extender la muestra sobre la

lámina portaobjetos
3. Fijar el extendido con la

llama del mechero
83
METODOLOGÍA
La identificación de Staphylococcus y Streptococcus, se basa en la morfología de las
colonias que se observan en los cultivos primarios y en el tipo de hemólisis en agar
Sangre. Sin embargo para evitar errores de interpretación , se emplean pruebas
bioquímicas como :
■ Prueba de Catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición de peróxido de hidrógeno en

agua y oxígeno. Se encuentra presente en la mayoría de los microorganismos aerobios y
anaerobios facultativos excluyendo los estreptococos.
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rápida con
desprendimiento de burbujas : la enzima catalasa convierte el peróxido de hidrógeno ,
en agua y oxígeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar los géneros
Micrococcus y Staphylococcus : catalasa positivo del género Streptococcus : catalasa
negativo.
negativo.
Con el asa de siembra se toma
una colonia del cultivo del
microorganismo y se coloca en la
lámina
Peróxido de
hidrógeno
Figura Nº 1
Figura Nº 2
(+) BURBUJEO: Staphylococcus
(-) NO BURBUJEO: Streptococcus
Figura Nº 3
84
Tomado de Diagnóstico Microbiológico de Bailey y Scott 11ª edición
POSITIVO NEGATIVO
■ Fermentación del manitol
El agar Manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de

Staphylococcus patógenos en cultivos mixtos, ya que se aprovecha la capacidad de los
Staphylococcus de desarrollar en presencia de Cloruro de sodio (Na Cl) al 7,5 % y la de
fermentar manitol, en este caso se observará la formación de un halo amarillo en el agar
circundante a las colonias.
■ Coagulación del plasma
Staphylococcus aureus produce una proteína llamada coagulasa , capaz de aglutinar el

plasma tratado con oxalato, citrato o heparina en presencia de un factor contenido en el
suero.
Este factor sérico reacciona con la coagulasa , activando el fibrinógeno y produciendo
un coágulo o trombo de fibrina. La coagulasa se presenta en forma unida (adherida a la
célula) y en forma libre. El estudio de la actividad coagulasa se puede llevar a cabo en
un tubo de ensayo (para coagulasa libre) y en portaobjetos (coagulasa nido), también
llamado factor de agregación , la prueba en tubo se hace poniendo un ml de plasma al
que se le agrega una asada de un cultivo nocturno de S. aureus. Se incuba la mezcla a
37º C durante 4 horas y se considera positivo ante cualquier grado de
coagulación.
85
(+) PRUEBA POSITIVA (-) PRUEBA NEGATIVA
Formación de coágulo No hay formación de coágulo
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis
Coágulo No se forma
coágulo
POSITIVO NEGATIVO
86
RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS
• Streptococcus
Hemólisis Fermentación del manitol
Prueba de catalasa
87
• Staphylococcus aureus
Fermentación del manitol Prueba de coagulasa
Prueba de catalasa
• Staphylococcus epidermidis
Fermentación del manitol Prueba de coagulasa
88
Prueba de catalasa
EVALUACIÓN
1. Mencione dos (2) pruebas bioquímicas que permitan diferenciar:
• Streptococcus pneumoniae :
• Streptococcus pyogenes :
2. Realice un flujograma para la identificación de bacteria Gram positivas
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90
PRÁCTICA Nº 9: IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE MYCOBACTERIUM
OBJETIVOS
▪ Conocer los riesgo y precauciones durante el procesamiento de muestras con

micobacterias.
▪ Conocer el procesamiento de las muestra para el estudio de micobacterias.
▪ Explicar el fundamento de la coloración de Ziehl-Neelsen.
▪ Ejecutar la técnica de coloración de Ziehl-Neelsen.
INTRODUCCIÓN
El género Mycobacterium está integrado por más de 100 especies, presentan alto
contenido de ácidos micólicos en su pared que retienen las anilinas utilizadas como
colorantes : fucsina , auramina, aun después de ser tratadas con alcohol-ácido de modo
que todas las especies se presentan como ácido-alcohol resistentes (BAAR).
El complejo Mycobacterium tuberculosis comprende varios agentes etiológicos de
tuberculosis M.tuberculosis , M.africanum y M.canetti , los cuales son primariamente
patógenos en el hombre.
M. tuberculosis y M.africanum son las especies de micobacterias más importantes por
ser altamente patógenas para el hombre y muy transmisibles de persona a persona por
aerosoles expulsados por la tos de pacientes con lesión pulmonar.
La muestra más examinada en la investigación de Mycobacterium tuberculosis es la de

esputo debido a que la tuberculosis pulmonar es la más frecuente, sin embargo dado que
la enfermedad puede manifestarse en cualquier órgano , con menor frecuencia puede
requerirse la investigación de muestras como orina, líquido cefalorraquídeo, líquido
pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias, las cuales deben
procesarse también para cultivo.
La muestra de esputo mucopurulenta proveniente del árbol bronquial que se obtiene

después de un esfuerzo de tos, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan
observar bacilos, debe tener un volumen aproximado de 3 a 5 ml .Se recomienda
analizar 2 ó 3 muestras de cada sintomático respiratorio. La primera muestra debe
obtenerse en el momento de la consulta y la segunda al día siguiente al despertar por la
mañana. Puede obtenerse una tercera muestra al momento de entregar al laboratorio la
segunda muestra. El envase debe ser de boca ancha y con tapa de rosca.
Si la muestra de esputo no va a ser procesada el mismo día, se debe introducir cada

envase en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa por encima de la tapa , se
conservarán en refrigeración a 4º C, para impedir la proliferación de la flora secundaria,
preferentemente dentro de una caja de plástico.
Para manipular las muestras y sobre todo los pasajes a otros medios de cultivo es
importante hacerlos en la cabina de seguridad.
Para que la baciloscopía sea positiva es preciso que la muestra contenga entre 5 000 y
10 000 bacilos por ml de muestra.
Las micobacterias se multiplican con más lentitud que otras bacterias patógenas para el
hombre a causa de su pared celular hidrófoba, que las hace agruparse e inhibe la
permeabilidad celular a los nutrientes
91
El medio de cultivo más conocido es el Löwenstein-Jensen. La temperatura óptima de
crecimiento es de 37ºC. Los cultivos se revisarán diariamente hasta un total de 60 días ,
pasados los cuales si no hay crecimiento se considerarán negativos.
Lectura de los extendidos

Observar cada campo microscópico en superficie y profundidad , moviendo el tornillo
micrométrico antes de desplazarse al siguiente campo; seguir un recorrido en líneas
rectas, para recorrer el extendido evitando repetir la lectura de los campos , ejemplo : de
izquierda a derecha. El número mínimo de campos a examinar es de 100 , los cuales
pueden ser leídos por un microscopista experimentado en cinco .
Los bacilos se observarán como bastoncillo delgados , ligeramente curvos, rojo fucsia,
destacándose claramente contra en fondo azul. Pueden presentarse aislados, apareados o
agrupados.
Escala semicuantitativa para los extendidos examinados por tinción Ziehl-Neelsen
Resultado del examen microscópico Informe

No se encuentran BAAR en 100 campos No se observan bacilos ácido-alcohol
observados resistentes
Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos Nº exacto de bacilos en 100 campos
observados
Se observan entre 10 y 99 BAAR en 100 campos Positivo (+)
observados
Se observan de 1 a 10 BAAR en 50 campos Positivo (++)
observados
Se observan más de 10 BAAR en 20 campos Positivo (+++)
observados
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
La ácido-alcohol resistencia es la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su

pared fucsina fenicada y retenerla aun con la acción de los decolorantes como la mezcla
de ácido y alcohol . Esta característica se debe al alto contenido lipídico
fundamentalmente fosfolípidos, ceras y ácidos micólicos.
MATERIALES
▪ Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos
▪ Frotis fijos de Mycobacterium tuberculosis a partir de esputos
▪ Tubos con medios de cultivo Löwestein-Jensen mostrando colonias de micobacterias
▪ Equipo de coloración para tinción de Ziehl-Neelsen
▪ Mecheros
▪ Microscopios
METODOLOGÍA
Preparación y fijación del extendido
92
1. Ordenar las muestras
2. Numerar las láminas portaobjetos
3. Tomar la muestra y la lámina portaobjetos y colocarlas por detrás del mechero, de
manera que la llama quede entre el operador y el frasco
4. Destapar con cuidado el envase
5. Partir un aplicador en dos. Tomar una parte del aplicador con la mano izquierda y la
otra con la mano derecha entre el pulgar y el índice y con los extremos irregulares
seleccionar la partícula más densa o purulenta de la muestra
6. Colocar las partículas seleccionadas sobre la lámina portaobjetos y extenderla con
movimientos suaves . Dejar secar el extendido a temperatura ambiente
7. Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solución de hipoclorito de sodio
al 1 %.
8. Cerrar el envase de la muestra
9. Cuando el extendido haya secado, pasarlo sobre la llama del mechero por tres (3) o
cuatro (4) veces para fijarlo.
Tinción de Ziehl-Neelsen
1. Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada

2. Con la llama de un hisopo embebido de alcohol calentar suavemente por debajo de
los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta observar que se desprenden los
primeros vapores blancos
3. En el término de 5 minutos calentar tres veces hasta la emisión de vapores.
No dejar hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y
colorearse mal.
4. Dejar enfriar y enjuagar con abundante agua
5. Cubrir todo el extendido con la solución decolorante y dejar actuar por tres
minutos. Enjuagar con abundante agua
6. Cubrir todo el extendido con solución de Azul de metileno, dejar actuar por un
minuto
7. Enjuagar con abundante agua
8. Dejar secar al medio ambiente
1. Cubrir con fucsina 2. Calentar suavemente con

básica fenicada ayuda del hisopo (5 minutos)
93
4. Cubrir con solución
3. Enjuagar con decolorante (3 minutos)
abundante agua
5. Enjuagar con 6. Cubrir con Azul de

abundante agua metileno (1 minuto)
7. Enjuagar con
abundante agua
94
Bacilos ácido-alcohol
resistentes
Medio de cultivo
Löwenstein-
Jensen
Crecimiento de
Mycobacterium tuberculosis
RESULTADOS
Realizar la observación microscópica de las láminas y graficar los resultados.
95
BACTERIAS ANAEROBIAS
Las bacterias anaerobias han sido encontradas en infecciones que comprometen

todos los órganos y regiones anatómicas del cuerpo. Los abscesos más profundos y las
lesiones necrosantes que involucran anaerobios son polimicrobianos y pueden incluir
aerobios obligados, anaerobios facultativos, microaerófilos como microorganismos
acompañantes. Estos microorganismos, de forma conjunta con el trauma, la éstasis
vascular o la necrosis tisular, reducen la tensión de oxígeno y el potencial de
oxidoreducción en los tejidos y proveen las condiciones favorables para la
multiplicación de los anaerobios obligados.
En las últimas décadas , las infecciones anaerobias se han vuelto más comunes, para lo
cual existen dos probables explicaciones : a) el aislamiento por parte del laboratorio de
las bacterias anaerobias ha mejorado de modo que las infecciones endógenas no son
más mal diagnosticadas o pasan inadvertidas , b) una proporción mayor de pacientes
está recibiendo fármacos inmunosupresores por neoplasias u otras enfermedades , lo que
deriva en la resistencia del huésped inmunodeprimido. Las infecciones anaerobias
primarias se establecen fácilmente en áreas de tejido dañado y la bacteriemia,
diseminación metastásica de las bacterias con formación de abscesos distantes y una
cadena progresiva de eventos , pueden suceder a veces con un desenlace mortal. Es
importante el aislamiento e identificación de las bacterias anaerobias debido a que estas
se asocian a una elevada morbimortalidad y a que el tratamiento varía según la especie
implicada.
AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS
Debido a que los anaerobios residentes a menudo están presentes en grandes

cantidades como flora normal en las superficies de las mucosas , incluso la
contaminación mínima de una muestra puede dar resultados erróneos. Todos los
96
materiales recogidos de lugares que carecen de flora natural como líquidos corporales
que no sea orina, exudados de abscesos profundos, aspirados con aguja fina y biopsias
de tejidos pueden ser cultivados para bacterias anaerobias.
Recolección y transporte de las muestras:
Al tomar muestras de piel o mucosas, se debe se descontaminar la superficie,
para lo cual se debe utilizar jabón, alcohol etílico al 70 % y tintura de yodo por un
minuto ( en círculos concéntricos comenzando por el centro), también se puede utilizar
yodopovidona al 10 % , luego de lo cual se espera al menos 2 minutos antes de la
extracción de la muestra . El material para el cultivo anaerobio se obtiene mejor por
biopsia de tejidos o por punción y aspiración . El empleo de hisopos no es una
alternativa adecuada debido a la exposición excesiva de la muestra a los efectos de la
desecación , la posibilidad de contaminación durante la recolección y a que los
microorganismos pueden quedar retenidos dentro de las fibras del hisopo. Si se utiliza
un hisopo, este debe provenir de un sistema de transporte exento de oxígeno.
Un factor crucial para la viabilidad de los cultivos anaerobios es el transporte de
las muestras; el efecto letal del oxígeno atmosférico debe ser nulo hasta que la muestra
pueda procesarse en el laboratorio. Ya no se acepta tapar de nuevo una jeringa ni el
transporte de la aguja y la jeringa al laboratorio debido a los problemas secundarios a
lesiones por punción . Por lo tanto incluso los aspirados deben inocularse en el mismo
tipo de tubo o frasco ampolla libre de oxígeno. La muestra (pus,líquidos corporales u
otro material líquido) se inocula a través del tapón de goma después de extraer todo el
aire de la jeringa y la aguja. Si sólo se puede obtener una muestra con hisopo, se
requiere de un dispositivo especial para la recolección con una atmósfera libre de
oxígeno. Cuando se reinserta el hisopo, debe de tenerse cuidado de no inclinar el
recipiente , lo que provocaría la salida y el desplazamiento del anhídrido carbónico o el
nitrógeno libre de oxígeno al aire ambiental.
El tejido puede colocarse en una pequeña cantidad de líquido para preservarlo de
la desecación y luego colocarlo en una bolsa para anaerobiosis. Todas las muestras
deben mantenerse a temperatura ambiente hasta su procesamiento en el laboratorio,
dado a que la refrigeración puede oxigenar la muestra. Todas las muestras deben ser
remitidas al laboratorio lo antes posible.
Examen directo de los materiales clínicos:
El análisis macroscópico de las muestras es importante para establecer la

presencia de anaerobios, datos orientadores serán el hallazgo de un olor fétido, el
aspecto purulento de muestras líquidas, así como el hallazgo de tejido necrótico y gas.
En los portaobjetos preparados para la tinción de Gram, es más útil la fijación con
metanol que el calor; se deben observar características celulares y el fondo del frotis y
en la tinción de Gram , observar la forma, tamaño, disposición de las bacterias y
registrar el número de microorganismos presentes . Observar características
morfológicas distintivas como : presencia de esporas, ramificaciones, filamentos con
corpúsculos esféricos, formas granulares. La tinción de Gram permite determinar
características celulares, las tinciones de Wright y Giemsa a veces pueden revelar
información adicional. Las tinciones de naranja de acridina son las más útiles para
detectar bacterias en hemocultivos, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido
articular y exudados.
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS:
97
Las muestras para cultivos anaerobios pueden procesarse en la mesa de trabajo
común con incubación en jarras o bolsas para anaerobiosis o en una cámara anaerobia.
Jarras para anaerobiosis: El sistema que más se utiliza para crear una atmósfera
anaerobia es la jarra para anaerobiosis; para lo cual se utiliza una jarra plástica
transparente ( disponible en el comercio) con una tapa que se cierra para hacerla
hermética. Las condiciones de anaerobiosis pueden obtenerse mediante el uso de un
sobre que se adquiere en el comercio, generador de hidrógeno y CO2, que se activa con
el agregado de agua o con la humedad proveniente de las placas de agar. La
anaerobiosis se alcanza luego de 1 a 2 horas.
Bolsas plásticas anaerobias: Es una bolsa de plástico transparente , de varios tamaños,

con capacidad para una a tres placas de Petri de 100 mm de diámetro, un generador de
gas H2-CO2 que produce una atmósfera cuando se le agrega agua, partículas de
catalizador de paladio frío y resazurina como indicador. La bolsa se sella con calor
luego de la activación del generador para permitir el mantenimiento de las condiciones
anaerobias.
Incubación de los cultivos: En la mayoría de los casos, la temperatura adecuada es de 35

a 37°C, para el aislamiento primario de bacterias anaerobias a partir de muestras
clínicas. Las placas inoculadas en las mesas de trabajo y colocadas en las jarras de
anaerobiosis deben incubarse al menos 48 horas y reincubarse por otros 2 a 4 días para
permitir que los microorganismos de crecimiento lento formen colonias; algunos
anaerobios como ciertas especies de Actinomyces y Eubacterium, crecen más
lentamente y las colonias no pueden detectarse si las jarras se abren antes. Si las jarras
se abren pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento lento pueden morir
debido a la exposición de oxígeno. Debe evitarse la exposición prolongada de las placas
recién inoculadas al aire ambiental, ciertos anaerobios encontrados en muestras clínicas
como Peptostreptococcus anaerobius , pueden no crecer o mostrar un retraso
prolongado en el desarrollo cuando las placas recién inoculadas se mantienen en el aire
ambiental.
98
CUADRO N°1: Incidencia de anaerobios como flora normal de los seres humanos
GÉNERO Piel Tracto Intestino Genitales Uretra Vagina

Respiratorio externos
Superior
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Bacteroides 0 +/- 2 +/- +/- +/-
Prevotella 0 2 2 1 +/- 1
Porphyromonas 0 1 1 D D +/-
Fusobacterium 0 2 1 D D +/-
Veillonella 0 2 1 0 D 1
BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Finegoldia magna 1 2 2 1 +/- 1
Micromonas 1 2 2 1 +/- 1
micros
Clostridium +/- +/- 2 +/- +/- +/-
Actinomices 0 1 1 0 0 +/-
Bifidobacterium 0 1 2 0 0 +/-
Eubacterium 0 1 2 D D 1
Lactobacillus 0 1 1 0 +/- 2
Propionibacterium 2 1 +/- +/- +/- 1
D:Desconocido; 0: No se encuentra o raro; +/-: irregular; 1: por lo común presente; 2 :
Presente en grandes cantidades
CUADRO N°2: Muestras que no deben cultivarse en medios para anaerobios
HISOPADOS FARÍNGEOS O NASOFARÍNGEOS

Hisopados gingivales
Muestras broncoscópicas o esputo
Contenido gástrico, contenido de intestino delgado, heces, hisopados rectales, fístulas
colonocutáneas
Superficies de úlceras por decúbito, hisopados de muestras de costras de abscesos,
revestimientos mucosos
Materiales adyacentes a la piel o las mucosas
Orina de micción espontánea
Hisopados cervicales o vaginales
99
MATERIALES
▪ Placas con agar Chocolate
▪ Jarra anaerobia
RESULTADOS
EVALUACIÓN
1. ¿Qué personas son más susceptibles a la contaminación con Mycobacterium

tuberculosis?
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100
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2. ¿A quiénes se les llama multidrogorresistentes?
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3. ¿En qué casos se hace necesario realizar una prueba de susceptibilidad antibiótica a
los pacientes con tuberculosis?
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PRÁCTICA Nº 10: DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO DE HONGOS AMBIENTALES
OBJETIVOS
▪ Conocer las técnicas para la toma de muestra en el diagnóstico micológico.

▪ Identificar los productos patológicos de donde se pueden aislar los agentes
etiológicos de las micosis humanas.
▪ Conocer las características de los exámenes directos, como de los cultivos de
hongos.
INTRODUCCIÓN
La mayoría de los hongos tienen un hábitat saprofítico, presentan una variedad de

morfología, desde las levaduras hasta los hongos filamentosos. Los hay comestibles, de
interés para la industria alimentaria, química farmacéutica y los venenosos. Del gran
número de especies estudiadas hasta la fecha (más de 250 000) muy pocas son capaces
de colonizar al ser humano inmunocompetente, produciendo en éstos casos las
enfermedades denominadas micosis.
Los hongos que producen micosis en el ser humano se encuentran en dos estados
morfológicos básicos: levaduras y mohos.
▪ Levadura
Puede definirse como un hongo unicelular, redondo u ovalado que se reproduce por
gemación o fisión binaria. Una levadura también puede ser el estadio morfológico en el
ciclo biológico de una especie filamentosa se denomina a esto dimorfismo.
▪ Mohos
Son hongos multicelulares cuya estructura filamentosa se forma por el crecimiento
continuo a partir de una espora .El elemento tubular que emerge de denomina “hifa”, el
que sigue creciendo y ramificándose llegando a formar un conjunto entrelazado al que
se denomina “micelio” o “talo”. Parte de las hifas se introducen en el sustrato y forman
el “micelio vegetativo” y las que se proyectan hacia el exterior constituyen el micelio
aéreo, muchas levaduras en determinadas circunstancias y dependiendo de la especie ,
pueden producir “pseudohifas”.
El micelio aéreo muestra macroscópicamente diferentes características, lo cual

contribuye a la identificación primaria; puede ser algodonoso, velloso, arrugado,
polvoriento, cerebriforme, pigmentado o no, etc. En él se producen los elementos de
propagación, las esporas y los conidios. Los micelios tienen la capacidad de germinar
un nuevo sustrato y así producir un nuevo elemento. Este conjunto de características
observadas sobre el medio de cultivo se denomina “colonia”.
Los hongos como células eucarióticas poseen núcleo, nucleolo, retículo endoplasmático,
ribosomas, mitocondrias, vacuolas, cuerpos lipídicos y otras inclusiones. Rodeando el
citoplasma existe una membrana y una pared celular con características muy definidas.
Se multiplican a través de estructuras
103
que pueden ser asexuales o sexuales previa fusión del protoplasma y núcleo de células
distintas. También lo hacen mediante crecimiento vegetativo expansivo como ocurre de
rutina en el laboratorio con levaduras o fragmentos de micelio.
Como en otras enfermedades infecciosas , las micosis se diagnostican en el laboratorio

siguiendo el esquema clásico : examen directo, cultivos e inmunodiagnóstico.
▪ Examen directo
El examen microscópico de la muestra patológica, escamas de piel, pelos, fragmentos
de uñas, exudado purulento, LCR o biopsias, permite observar las características hifas,
esporas , levaduras ,etc.
Se hace una preparación en la lámina portaobjetos con una gota de hidróxido de potasio
al 10% (KOH al 10 %). Para la cápsula de Criptococcus neoformans (LCR), se adiciona
una gota de tinta china para visualizar la cápsula. En los exudados purulentos se
recomienda realizar una tinción de Gram, Giemsa, y también Wright. Si se trata de
cortes histológicos hacer una preparación con hematoxilina y eosina.
▪ Cultivos
El medio más utilizado en micología clínica es el descrito por Sabouraud. A este medio
base se le añade una cantidad superior de glucosa (40 X 100), denominándose así agar
glucosado de Sabouraud (SGA) , al cual posteriormente se le han adicionado
antibióticos con el fin de evitar la contaminación bacteriana y cicloheximida (actidiona)
, para inhibir los hongos saprofitos.
La incubación en micología médica es siempre en aerobiosis, oscilando el tiempo desde

2 a 3 días para levaduras y especies saprofitas. La temperatura de incubación es 32º C ;
los dermatofitos y otros causantes de micosis cutáneas a 25 a 30 grados centígrados
(temperatura ambiental)
El producto patológico y la técnica de toma de muestra se elegirá de acuerdo con el tipo

de micosis por investigar.
MATERIALES
▪ Tubos de prueba conteniendo agar glucosado de Sabouraud (SGA)
▪ Cultivos de especies ambientales : Penicillum , Alternaria , Aspergillus,
Hormodendrum
▪ Frasco con KOH al 10 %
▪ Asa de siembra
METODOLOGÍA
Observar macroscópicamente y realizar preparaciones con Azul de lactofenol para su
observación microscópica.
104
Penicillum
Aspergillus
fumigatus
Aspergillus
niger
Rhizopus
105
RESULTADOS
Observar al microscopio (10X y 40X) las muestras directas.
106
107
EVALUACIÓN
1. Elaborar un cuadro comparativo de características morfológicas , nutricionales y

sensibilidad a antibióticos de hongos y bacterias.
108
2. Mencionar y explicar brevemente las técnicas de diagnóstico directas e indirectas
para hongos.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
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PRÁCTICA Nº 11: DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTÁNEAS
OBJETIVOS
▪ Describir las características de las colonias de hongos causantes de las micosis
superficiales y cutáneas en cultivos con agar glucosado de Sabouraud y
microscópicamente.
INTRODUCCIÓN
La colonización e invasión en mayor o menor grado de una especie fúngica se denomina

“micosis”. Dentro de las micosis superficiales se incluyen las causadas por hongos que
colonizan la superficie queratinizada de la piel o pelo. Varios son los agentes
etiológicos que pueden colonizar la piel.
Las infecciones cutáneas incluyen una variedad de procesos en los que se encuentran
afectados piel y anexos (pelo y uñas). La infección puede estar limitado a la capa córnea
o llegar a los estratos más profundos , sin invasión linfática. Producidos por los hongos
denominados dermatofitos y las enfermedades por ellos producidas dermatofitosis. La
dermatomicosis incluye a cualquier proceso micótico de la piel y el de dermatofitosis se
reserva para los producidos por hongos dermatofitos.
MICOSIS SUPERFICALES
▪ Piedra Negra
Se caracteriza por la presencia de nódulos en la porción extrafolicular del pelo, pétreos
y de color negro. El agente causal es Piedra hortae
▪ Piedra blanca
Muestra nódulos blanco-grisáceos , que son masas agrupadas de hifas y pueden
encontrarse en la parte distal o central de pelo axilar , pubiano y crural. Agente causal :
Trichosporum cutaneo o T. beigelii.
▪ Tiña negra
Es una infección superficial de la piel debido a la colonización de Hortaea werneckii.
Se caracteriza por la presencia de manchas negro-marronáceas, no descamativas e
indoloras , frecuente en las palmas , dedos y plantas , que en otro lugar de la piel.
▪ Pitiriasis versicolor
Caracteriza lesiones furfuráceas a veces papulomatosas o eritematosas, confluentes con
pigmento variable (hipo o hiperpigmentadas). Tiene como agente causal a Malassezia
furfur, se localiza preferente en el tronco sobre todo hombros y espalda . Al examen
microscópico detectan los grupos de levaduras con hifas
MICOSIS CUTÁNEAS
Dermatomicosis
Micosis producida por Cándida albicans, hongo oportunista. Agente causal de
intertrigos (submamario o inguinal) , eczema de pañales, onicomicosis con paroniquia y
110
granuloma candidiásico., Además de C. albicans también pueden presentar
onicomicosis Cándida stellatoidea, C.tropicalis, C. guillermondi y C parapsilosis.
Las preparaciones teñidas con Gram , muestran levaduras Gram positivas redondas u
ovales , con brotes de blastosporas de 3 a 4 μm acompañadas de pseudohifas de 3 a 10
micras de longitud.
La mayoría de los medios de cultivo bacterianos son satisfactorios para el aislamiento

de Cándida; de todas las formas se recomienda efectuar la siembra en medio de
Sabouraud con antibióticos (cloranfenicol).Los medios que contienen actidiona
(cicloheximida) inhiben el crecimiento de algunas especies .
La incubación se realiza a temperatura ambiente (25 a 30º C) cuando se trata de medios

con inhibidores y a 37ºC en el caso de medios enriquecidos exentos de sustancias
inhibidoras. Al cabo de 24 a 48 horas se puede observar las colonias
características de color blanco o crema, opacas, elevadas, lisas, brillantes o mates de 1 a
3 mm de diámetro. La prueba de filamentación y producción de clamidosporas
características , son muy sencillas y útiles para la identificación de C. albicans.
Dermatofitosis
Es una infección fúngica de los tejidos queratinizados (piel, pelo, uñas) que ocurre en
los seres humanos y animales producida por un grupo de hongos estrechamente
relacionados denominados “dermatofitos”.
Los agentes etiológicos de las dermatofitosis se clasifican en tres géneros :

Epidermophyton , Microsporum y Trichophyton. El diagnóstico se puede hacer
mediante :
▪ Examen directo
Para el estudio micológico se procede a tomar la muestra, que en este caso sería , pelos,
escamas de la piel o muestras ungueales que se toman con pinzas o bisturí estéril del
centro o borde de la lesión y se colocan en una lámina. Se transportan entre dos láminas
portaobjetos limpias y se observan directamente al microscopio, con una gota de
hidróxido de potasio al 10 % (KOH ) cubierto con una laminilla.
Al microscopio se pueden observar las artroconidias dentro del pelo (endotrix) o en
forma de vaina alrededor del pelo (ectotrix).
▪ Cultivo
Las muestras se siembran en SGA adicionando cicloheximida, que inhiben los hongos
saprofitos. La identificación se hace sobre la base del aspecto macroscópico de las
colonias entre ellos la producción de pigmento. Luego las características microscópicas
, observación de macroconidias y microconidias y elementos accesorios sirven para
definir cada género y especie.
Observar el desarrollo de los hongos en estudio y anotar las características de sus
colonias desarrolladas en SGA.
MATERIALES
Tubos sellados de SGA con cultivos de :
Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans
Microsporum gypseum, Microsporum canis
111
Preparaciones en láminas portaobjetos coloreadas con azul de lactofenol.
Cándida
albicans
Trichophyton
mentagrophytes
Trichophyton
rubrum
Trichophyton
tonsurans
112
Microsporum
gypseum
METODOLOGÍA
Examinar al microscopio las láminas preparadas y esquematizar sus observaciones.
113
EVALUACIÓN
1. ¿Qué características morfológicas en los cultivos presentan los siguientes hongos?
• Epidermophyton flocosum :
• Trichoporum cutaneum :
2. ¿Cuáles son las manifestaciones clínicas de las micosis producidas por :
• Malassezia furfur :
• Piedra hortae :
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
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PRÁCTICA Nº 12: DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTÁNEAS, SISTÉMICAS
Y OPORTUNISTAS
OBJETIVOS
▪ Identificar microscópicamente los agentes etiológicos de las micosis subcutáneas

▪ Describir las características morfológicas de las colonias de los hongos causantes de
las micosis subcutáneas.
INTRODUCCIÓN
Se consideran en este grupo las infecciones fúngicas que afectan el tejido subcutáneo,
dermis y epidermis, causadas por hongos exógenos, saprofitos , cuyo hábitat es el suelo
y las plantas. Las infecciones más frecuentes son :
▪ La esporotricosis debida al Sporotrix schencki, que se produce habitualmente por la

penetración en la piel de astillas, espinas o tierra contaminada; una vez establecida la
infección tiende a permanecer localizada en el tejido subcutáneo y a ser muy persistente.
Se caracteriza por una lesión ulcerada en el punto de inoculación , que va seguida de la
formación de nódulos y abscesos múltiples que siguen las vías de drenaje de los
linfáticos superficiales.
▪ La cromomicosis (cromoblastomicosis), debido a Fonsecaea pedrosoi, Cladosporium

carrionii y Phialophora verrucosum, que se caracteriza por el desarrollo de una pápula
en el sitio de la inoculación, que más tarde se extiende formando lesiones verrugosas o
tumorales , semejantes a una coliflor, puede haber infección secundaria y ulceración .
Las lesiones , por lo general, están limitadas a los pies y las piernas, pero pueden afectar
la cabeza, la cara, el cuello y otras superficies del cuerpo; también puede haber abscesos
cerebrales.
▪ El micetoma (maduromicosis), debido a Nocardia y Streptomyces, que se caracteriza

por lesiones destructivas localizadas, granulomatosas y supuradas, que habitualmente se
localizan en los pies y las manos. Las lesiones se caracterizan por edema, coloració n
purpúrea y deformación tumoral del tejido subcutáneo, con la presencia de surcos
sinusales que drenan pus, que contiene gránulos amarillentos o negros. La infección
progresa gradualmente, atacando los huesos , los músculos y otros tejidos adyacentes,
hasta que por último obliga a la amputación, a veces se produce la invasión más extensa
afectando el cerebro y otros órganos internos .
MATERIALES
▪ Tubos sellados de SGA con cultivos de:
Sporotrix schenki
Phialophora verrucosum
▪ Preparaciones en láminas coloreadas con azul de lactofenol.
▪ Microscopio
METODOLOGÍA
116
Examinar al microscopio las láminas preparadas y esquematizar sus observaciones.
117
DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS Y OPORTUNISTAS
OBJETIVOS
▪ Identificar microscópicamente los agentes etiológicos de las micosis subcutáneas
▪ Describir las características morfológicas de las colonias de los hongos causantes de
las micosis subcutáneas
INTRODUCCIÓN
Las micosis sistémicas, son infecciones fúngicas que afectan varios órganos y tejidos.
Se dividen en dos grupos:
Las producidas por especies consideradas patógenas con carácter endémico, este tipo de
micosis se transmite por inhalación, ingesta o traumatismos. Blastomicosis y
Paracoccidioidomicosis.
Las producidas por especies oportunistas. Estas patologías se dan en huéspedes

inmunodeprimidos (con transtornos endocrinos, inmunodefiencias, enfermedades
oncohematológicas, alteraciones metabólicas y anatómicas,
drogadictos endovenosos, pacientes bajo tratamiento prolongado con corticoides o
citostáticos , sometidos a cirugía, dializados , quemados transplantados y cateterizados)
, son causadas por hongos saprofitos del ambiente o comensales del cuerpo humano. Por
ejemplo Cándida y Criptococcus.
La infección se adquiere por inhalación de conidios en la fase micelial , desarrollándose

en el huésped un foco pulmonar primario. En caso del que paciente presente
inmunodeficiencia puede producirse una diseminación sistémica.
El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante la observación de la fase

levaduriforme en los siguientes productos: expectoración, secreción de lesiones
mucocutáneas y material de biopsia. La fase levaduriforme se puede obtener en cultivos
enriquecidos, incubados a 37ºC. Estas pueden ser:
▪ Blastomicosis: Blastomyces dermatitidis

La infección comienza habitualmente en los pulmones y se difunde por vía hematógena
causando lesiones destructivas focales en los huesos, piel, próstata y vísceras, en general
no se afecta el tubo digestivo. Las lesiones cutáneas son particularmente manifiestas,
parecen originarse como metástasis a partir de las lesiones pulmonares primarias que se
abren a la superficie cutánea causando lesiones ulceradas y encostradas. Las lesiones se
caracterizan por inflamación granulomatosa, microabcesos y progresiva destrucción de
los tejidos, las calcificaciones son raras.
▪ Paracoccidioidomicosis o blastomicosis sudamericana (Paracoccidioides brasiliensis)

Las primeras lesiones aparecen en las mucosa de la boca, o de la nariz y se difunden por
expansión directa, es decir a través de los límites cutáneo-mucosos, afectan la cara, en
ocasiones , la diseminación se produce a través de los tejidos linfáticos incluyendo el
bazo.
118
En el tubo digestivo las lesiones comienza en el tejido linfoide submucoso y puede
originar formación de úlceras e incluso perforaciones; pueden formarse abscesos
subcutáneos que por extensión a la superficie cutánea, puede producir lesiones
deformantes de gran tamaño, encrostadas o ulceradas. Las lesiones cutáneas constituyen
abscesos piógenos y lesiones inflamatorias granulomatosas.
▪ Histoplasmosis: Histoplasma capsulatum

Causada por la inhalación de esporas que lo conduce a una infección pulmonar,
aparecen lesiones miliares distribuidas por todo el parénquima pulmonar y aumento de
tamaño de los ganglios linfáticos. La infección inicial es benigna puede pasar
completamente inadvertida o manifestarse como un infección respiratoria autolimitada.
En un pequeño número de individuos la enfermedad progresa se disemina y causa
lesiones en prácticamente todos los tejidos y órganos, aparece fiebre y postración, así
como el aumento del tamaño de hígado , bazo y ganglios linfáticos simulando
tuberculosis miliar ; en ocasiones puede evolucionar como una enfermedad pulmonar
crónica con cavitación, simulando la tuberculosis pulmonar crónica. Las lesiones de los
tejidos se caracterizan por la existencia de una inflamación granulomatosa.
▪ Coccidiomicosis: Coccidioides immitis

La infección se establece por inhalación de esporas transmitidas por el aire
aproximadamente el 60 % se pone de manifiesto únicamente por la adquisición de una
hipersensibilidad de tipo retardado frente a los antígenos del hongo, en un 40 % se
produce neumonitis aguda, acompañada con frecuencia de pleuresía y varias erupciones
cutáneas, alrededor del 5 % desarrollan una enfermedad pulmonar crónica con
cavitación que se asemeja a la tuberculosis pulmonar y conduce ocasionalmente a la
calcificación; en menos del 1 % aparece una diseminación con lesiones granulomatosas
asépticas en muchos órganos y tejidos, entre ellos, la piel, huesos articulaciones y
meninges.
Las lesiones de la neumonitis aguda son histológicamente semejantes a las causadas por
bacterias piógenas, pero en la enfermedad pulmonar crónica y en las formas
diseminadas , la inflamación es granulomatosa.
▪ Criptococosis
Esto ocurre en particular en sujetos con inmunodeficiencia de las células T y se debe a
Criptococus neoformans , este hongo se caracteriza por ser una levadura encapsulada.
Su hábitat es el suelo contaminado con materia fecal de aves. La criptococosis es una de
las enfermedades que sirve para definir el estadio SIDA en la enfermedad del virus de
Inmunodeficiencia Humana. Dentro de las formas clínicas existe: Criptococosis
pulmonar, del SNC, diseminada, cutánea y mucocutánea. El producto más frecuente de
analizar es el LCR, en el que se observan las típicas levaduras capsuladas que se
destacan por contraste negativo mediante emulsión con tinta china.
▪ Candidiasis: Cándida spp

Las infecciones caudadas por Cándida son muy variadas, este hongo de tipo
levaduriforme puede llegar a ser patógeno en humanos y animales en los cuales vive en
estado saprofítico . La cavidad bucal y es resto del tracto gastrointestinal son los
territorios preferentes donde C. albicans se encuentra en el 20 % de las personas y en
menor proporción otras especies de Cándida.
119
Por lo menos cinco condiciones favorecen el surgimiento de candidiasis:
▪ Cambios fisiológicos como diabetes y embarazo

▪ Uso prolongado de antibióticos o fármacos antitumorales e inmunosupresores
▪ Maniobras diagnósticas y terapéuticas agresivas : cateterismo, sondajes
▪ Debilidad general y/o desnutrición
▪ Infección por el virus de la Inmunodeficiencia Humana y drogodependencia.
El diagnóstico de la Candidiasis en el laboratorio incluye la demostración directa de

Cándida mediante coloraciones Giemsa ,Gram en muestras clínicas y cultivo
MATERIALES
▪ Tubos de SGA con cultivos de :

▪ Histoplasma capsulatum
▪ Cándida albicans
▪ Preparaciones en láminas con azul de lactofenol
▪ Microscopio
METODOLOGÍA
Observar de las muestras macroscópicamente

Realizar preparaciones en láminas con azul de lactofenol y observar al microscopio
(10x y 40x)
120
A) Estructura de un talo o micelio de mohos y levaduras. B) En la parte inferior se
aprecian dos formas poco frecuentes.
Fase micelial y de levadura con talo reproductor y vegetativo.
121
Modalidades de las hifas.
122
Género Trichophyton, esporas asexuadas.
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Género Microsporum, esporas asexuadas
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129
PRÁCTICA Nº 13: DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO
OBJETIVOS
▪ Familiarizar al estudiante con las diferentes técnicas de aislamiento de virus

aprovechando las propiedades que presentan
▪ Observar y caracteriza morfológicamente células cultivadas
▪ Explicar la importancia de las técnicas de cultivo de tejidos en virología y en otras
disciplinas científicas.
La demanda de los servicios de los laboratorios de virología clínica, han aumentado

en las últimas dos décadas debido a la disponibilidad comercial de reactivos de alta
calidad, el uso por parte de los médicos de fármacos antivirales específicos, el
desarrollo de técnicas de diagnóstico rápido y la aplicación de los procedimientos de
cultivo celular para virología al diagnóstico de otras enfermedades como infección
genital por Chlamydia.
Las enfermedades virales que requieren diagnóstico de laboratorio son las
enfermedades de transmisión sexual, las diarreas, las enfermedades respiratorias en
niños y adultos, las meningitis asépticas, las enfermedades congénitas y las infecciones
en huéspedes inmunodeprimidos.
CULTIVO CELULAR
Los cultivos celulares comenzaron a principio del siglo XX, con cultivos de
órganos completos y luego con métodos de células individualizadas : cultivos de células
primarias (células somáticas de un animal de experimentación o tomadas de un paciente
humano (que pueden mantenerse en cultivo durante un período breve de tiempo) o
líneas celulares inmortalizadas, las cuales en condiciones adecuadas pueden continuar
creciendo en cultivo indefinidamente.
En 1952 Renato Dulbecco fue el primero que cuantificó virus animales, utilizando un
ensayo de placas de lisis, técnica para la cual se preparan diluciones del virus con las
que se infectan células crecidas en monocapas, que luego se recubren con agar blando
para impedir la difusión del virus. Éste destruye las células en focos localizados que se
observan al teñirse la monocapa.
MECANISMOS DE LESIÓN CELULAR
La infección viral origina una variedad de cambios que se detectan mediante el

examen visual o bioquímico de las células infectadas, estos cambios se deben a la
producción de proteínas y ácidos nucleicos víricos, y a las alteraciones biosintéticas de
las células. En las células infectadas por virus se reconocen cambios fenotípicos
comunes, denominados efectos citopáticos del virus , los cuales son :
● Forma alterada : las células adherentes que normalmente están pegadas a otras células
( in vivo ) o a un sustrato artificial ( in vitro ) pueden adoptar una morfología
redondeada diferente de su apariencia aplanada normal . Se eliminan de la células los
procesos de ampliación implicados en la adhesión y la movilidad.
130
● Despegamiento del sustrato: para las células adherentes , esta fase de daño celular
sigue de la anterior. Ambos efectos son causados por la degradación parcial o la
disrupción del citoesqueleto, el cual se encarga de mantener la forma de la célula.
● Lisis : es el caso más extremo, la célula entera se rompe, se pierde la integridad de la

membrana y la célula se puede hinchar por la absorción de líquidos extracelulares y
finalmente estalla. Éste es un caso extremo de daño celular, no todos los virus causan
este efecto, aunque pueden causar otros efectos citopáticos.
La lisis es beneficiosa para un virus ya que constituye un método para liberar nuevas
partículas víricas de una célula infectada.
● Fusión de membranas: las membranas de las células adyacentes se fusionan

originando una masa de citoplasma que contiene más de un núcleo : sincitio, o
dependiendo del número de células que se fusionan : célula gigante. Las células
fusionadas tienen vida corta y luego se lisan.
●Permeabilidad de membranas: diversos virus causan un aumento en la permeabilidad

de membranas, permitiendo la entrada de iones extracelulares como el sodio. La
traducción de algunos ARNm víricos es resístente a altas concentraciones de iones de
sodio , permitiendo la expresión de genes víricos a expensas de mensajeros celulares.
● Cuerpos de inclusión: son áreas de la células en las que se han acumulado

componentes víricos. Se trata frecuentemente de sitios de ensamblaje de viriones y
algunas inclusiones celulares consisten en acúmulos cristalinos de partículas víricas. No
está claro si estas estructuras dañan a la célula, pero frecuentemente están asociadas a
virus que causan lisis celular, como los herpesvirus.
● Apoptosis: la infección vírica puede activar la apoptosis ( muerte célular programada

), mecanismo implicado en el crecimiento normal y el desarrollo de los organismos.
INMUNODIAGNÓSTICO
■ ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO
La prueba de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) o inmunoensayos ligados

a enzimas (EIAs) en la cual el antígeno o anticuerpo está adsorbido a una fase sólida ,
constituye uno de los primeros inmunoensayos enzimáticos primeramente descritos por
Engvall y Perlmann en 1971 y luego aplicados al diagnóstico microbiológico por Voller
y colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre las técnicas de inmunofluorescencia (IF)
de su mayor sensibilidad ya que , la enzima actúa catalíticamente y de forma objetivable
, por lo que es posible medir la densidad óptica de la coloración final. Las enzimas son
seguras, de bajo costo y estables, si se comparan con los radio-isótopos utilizados en
radioinmunoensayo (RIA).
En la actualidad estas pruebas están tomando un rol importante en los laboratorios
médicos y de investigación, porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es
posible realizar la identificación de muchos virus a nivel de género. Están reemplazando
a los RIA en muchos laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los problemas de
manejo, eliminación y corto tiempo de vida de los materiales radioactivos .
131
Debido a su objetividad, facilidad de automatización y posibilidad de trabajar con un
gran número de muestras, estos ensayos inmunoenzimáticos están reemplazando
parcialmente a técnicas en el laboratorio como : inmunofluorescencia y aglutinación.
Estos ensayos presentan tres piezas constantes que originan distintos tipos de EIA
en función de cómo se combinen: el analito (antígeno {Ag} o anticuerpo {Ac} ), el
conjugado (de antígeno o de anticuerpo) y el sustrato. Utilizan enzimas como
marcadores inmunoquímicos que permiten valorar las uniones antígeno-anticuerpo que
se producen tras un periodo de incubación, con la adición posterior de un sustrato.
● Fundamento
La prueba de ELISA se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, uno de los cuales debe
ser de reactividad conocida. El color se genera por la interacción de un sustrato
cromogénico y una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse
el anticuerpo, se coloca el antígeno en la fase sólida, como una capa de captura.
Después de la reacción del antígeno con el suero del paciente, la capa de detección
puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase específica (IgM o IgG) para detectar
respuesta de anticuerpos clase específicos
Dentro de los parámetros fisicoquímicos que intervienen en la unión del antígeno con el
anticuerpo tenemos:
▪ Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de átomos en la

superficie de las moléculas generado por un cambio eléctrico. Son fuerzas débiles
presentes cuando la proximidad del Ag y el Ac es grande.
▪ Fuerzas electrostáticas originadas por la fuerza de atracción entre moléculas de

carga iónica opuesta, como sucede con los grupos NH3+ (amoníaco)que reaccionan
ávidamente con el grupo COOH- (grupo carboxilo).
▪ Uniones por puentes de hidrógeno son de carga energética baja entre átomos
electropositivos de hidrógeno y átomos electronegativos de oxígeno o nitrógeno.
● METODOLOGÍA
Los métodos de ELISA se dividen en:
ELISA directo:
Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se
sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados e indican la
presencia de antígeno en la solución analizada. Se debe incluir controles negativos que
serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga
la certeza de la ausencia del antígeno buscado y controles positivos (soluciones donde
se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).
ELISA indirecto
Las placas ELISA se preparan de igual forma que en el método directo, los controles
positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos :
uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La
132
detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la
unión de dos o más anticuerpo secundarios por cada primario.
ELISA sándwich:
Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos. Se trata de un

ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la
que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el
primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se
aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada
molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un
segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
 Fijación del Antígeno a la fase sólida:
La reacción inmunológica tiene lugar en la fase sólida, ésta puede ser de plástico, vidrio
o nitrocelulosa. Los más usados son los de plástico, dentro de éstos los de poliestireno
gammairradiados y los de cloruro de polivinilo ya que tienen mayor capacidad para
formar enlaces estables que los de poliestireno no tratados. El antígeno diluido en buffer
es adherido a la fase sólida por enlaces electrostáticos entre los sitios activos del plástico
y regiones de la proteína responsables de esta interacción. El buffer puede ser carbonato
a pH 9,6 o buffer fosfato salino ( PBS 1X ) a pH 7,4. La estabilidad de los enlaces
electrostáticos, el tiempo de incubación y la temperatura son factores importantes a
tener en cuenta para evitar pérdidas de las proteínas y que pueden afectar la sensibilidad
del ensayo.
 Reacción con anticuerpo:
La reacción del antígeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a

las fisiológicas : pH 7,4, temperatura de 37ºC y concentración salina equivalente a
0.15M de cloruro de sodio (NaCl). El tiempo puede variar entre 1 a 3 horas. Moléculas
no específicas en solución pueden adherirse a la fase sólida afectando el resultado final
del ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reacción un exceso
(0,1% a 1%) de una proteína inerte para que compita eficientemente por los sitios de
unión inespecíficos en la fase sólida. Esta proteína puede ser seroalbúmina bovina,
caseína, suero entero, gelatina u otros. También es necesario añadir al medio Tween 20
(Monolaurato de polioxietileno sorbitán { surfactante } )para evitar uniones
inespecíficas de macromolécula. Por este motivo es agregado en los tampones de
dilución y de lavado.
 Adición del conjugado enzimático:
El conjugado enzimático se prepara por unión covalente de una enzima con el

anticuerpo; esta enzima puede ser peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase { HRP
} ), fosfatasa alcalina (Alcaline Phosphatase { AP } ) o beta-galactosidasa. Los criterios
a tomar en cuenta en la selección de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad,
disponibilidad, viabilidad de conjugarla eficazmente con el anticuerpo elegido,
sensibilidad y costo. Las condiciones de reacción entre el conjugado y el complejo
133
formado por la unión antígeno-anticuerpo son similares a las descritas en la etapa
anterior.
 Adición del sustrato:
La elección del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado.

El sistema AP hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto
soluble de color amarillo. El sistema HRP reduce al sustrato peróxido de hidrógeno
produciendo oxígeno que oxida a otros compuestos cromógenos tales como:
♦ Tetrametilbenzidina (TMB) : la oxidación genera un producto de color azul oscuro.
♦ o-phenylene diamine (OPD): es oxidado a un producto coloreado que puede variar de

color naranja a pardo oscuro.
♦ Ácido azino-(3-etil)-benzo-sulfónico (ABTS) : la oxidación genera un producto que

puede variar del color al azul. La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la
cantidad de enzima presente en la reacción.
 La lectura se realiza en un espectrofotómetro a 405 nanómetros
PRUEBA RÁPIDA PARA VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA
Uno de los pilares básicos de la lucha contra el Síndrome de Inmunodeficiencia

Adquirida (SIDA) es la detección precoz de las personas infectadas por el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH). El diagnóstico precoz ofrece la posibilidad de
beneficiarse de la terapia antirretroviral en las etapas precoces de la infección, así como
intentar modificar las conductas que favorecen la transmisión del virus a otras personas.
Son ensayos de lectura visual que pueden realizarse con equipamiento mínimo y
generan un resultado en menos de 15 minutos en comparación con la prueba estándar de
cribado con técnicas de EIA, de las cuales no se dispone del resultado hasta al cabo de
unas horas o días. Tanto la prueba de detección rápida como el EIA detectan
anticuerpos específicos del VIH.
Se han establecido los diferentes criterios que debería cumplir una prueba de detección
rápida del VIH:
▪ Presentar alta sensibilidad y especificidad (>99%)

▪ Ser reproducible
▪ Ser fácil de aprender, realizar e interpretar
▪ Ser precisa
▪ Ser de fácil almacenamiento
▪ No requerir equipamiento adicional
▪ No tener carácter invasivo
134
Durante la realización de las pruebas de detección rápida, se recomienda que los
pacientes reciban información y asesoramiento sobre la enfermedad y la infección. Si la
prueba es negativa, se considera un negativo definitivo a no ser que haya posibilidades
de que se encuentre en el período ventana de exposición (primeros 3 a 6 meses de post
exposición) . Si el resultado es positivo, se considera un resultado preliminar que debe
confirmarse con técnicas de EIA y con la prueba Western blot. Los resultados
indeterminados se deberían repetir en un mes. La mayoría de las pruebas de detección
rápida del VIH se comercializan con un equipo o kit que incluye todo lo necesario para
realizar la prueba y no requiere un equipamiento especializado. En general, disponen de
un control de procedimiento incorporado en el equipo o kit. Para la muestra, se puede
utilizar sangre entera (más fácil de realizar), plasma o suero, y los resultados se
interpretan visualmente.
CAPACIDAD DIAGNÓSTICA DE LAS PRUEBAS DE DETECCIÓN RÁPIDA DEL

VIH
Es difícil realizar una comparación de la capacidad diagnóstica de las numerosas

pruebas de detección rápida comercializadas ya que son, muy distintas entre ellas. Los
principios de acción más frecuentes en estas pruebas son la aglutinación, la
inmunoconcentración (flow through), la inmunocromatografía (lateral flow) y la fase
sólida (solid phase). El método de producción y de combinación específica de los
antígenos varía entre las distintas pruebas de detección. La mayoría incluye uno o más
antígenos del virus VIH-1 (gp41, gp120, gp160) y VIH-2 (gp36). Otros incorporan el
antígeno core (p24). Actualmente, existe controversia en la duración del período
ventana entre 3 ó 6 meses. En general, se recomienda el alta médica a los 6 meses
después de una actividad de riesgo de infección.
 PRUEBA DE INMUNOFIJACIÓN DE DOT-BLOT

Prueba para la detección del VIH en la cual los antígenos virales se encuentran unidos a
una membrana de nitrocelulosa dentro de un contenedor plástico. Los antígenos
utilizados son recombinantes o sintéticos. Se utilizan conjugados de anti-
inmunoglobulina ligados a una enzima que se fija al anticuerpo del paciente. La adición
del sustrato permite la visualización del color en el papel. Su ventaja y principal
indicación es la posibilidad de identificación entre los dos tipos de virus. Las pruebas
son rápidas y fáciles de realizar, pero son costosas. Muchas producen resultados en 5 ó
15 minutos.
 TÉCNICAS DE INOCULACIÓN EN ANIMALES DE LABORATORIO

Este fue el primer método que se utilizó para el aislamiento de virus , demostrándose la
reacción positiva por la muerte y los cambios histológicos o clínicos. Existen factores
negativos en el uso de animales de laboratorio : el confinamiento de los mismos de tal
manera que no se pueda impedir una infección cruzada a otros animales y al personal
de laboratorio, la presencia de enfermedades víricas latentes en los animales de
experimentación que pueden activarse por el mismo trauma que supone la inoculación
con la consiguiente interferencia a la hora de la interpretación de los resultados .
135
FUENTES DE INFORMACIÓN
■ Arenas R. Micología Médica Ilustrada.2ª edición.2005. Editorial Mc Graw Hill

■ Bailey & Scott. Diagnóstico Microbiológico .11ª edición 2004.Editorial Médica
Panamericana.
■ Granados R. Microbiología Tomo II.2ª edición.2003.Editorial Thomson Paraninfo
■ Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología Médica 18ª edición 2005 Editorial
Manual Moderno
■ Koneman Diagnóstico Microbiológico 6ª edición .2008.Editorial Médica
Panamericana
■ Murray P. Microbiología Médica.5ª edición 2008.Editorial Elsevier
■ Sherris Microbiología Médica. 4ª edición.2005.Editorial Mc Graw Hill
■ Baker F.J, Breach M.R. Manual de Técnicas de Microbiología Médica.1990.Editorial
Acribia
■ Cann A Principios de Virología Molecular. 4ª edición.2005. Editorial Acribia
■ Organización Panamericana de la Salud. Oficina Sanitaria Panamericana Regional de
la Organización Mundial de la Salud. Garantía de calidad en el diagnóstico serológico
de la Infección por el virus de la inmunodeficiencia humana . Publicación Nº 42
■ Ministerio de Sanidad y Política Social. Cataluña .España. Prueba de detección rápida
de la infección por VIH. AATRM Núm. 2007/3
■ Cristhopher Donat’s Cruz Malpica. Estandarización de la prueba de Ensayo
Inmunoenzimático para la detección de anticuerpos IgG en sueros humanos para el
virus Phlebotomus fever. Tesis para optar el título de químico farmacéutico.
Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de farmacia y Bioquímica2001
http://sisbib.unmsm.edu.pe/Bibvirtual/tesis/Salud/Cruz_M_C/generalidades.htm
■ Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
Procedimientos en Microbiología Clínica.
www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap6.htm
■ Moura AC Diversidade genética, densidade populacional e potencial de promoҫão de
crescimento de rizobactérias associadas ao cacaueiro [Tesis Maestría].Bahia
:Universidade Federal do Rencôcavo ; 2007.
■ Chaves L Aspectos bioquímicos e moleculares de bacterias isoladas de terra preta
antropogênica (TPA) na região da Amazônia Brasileira.[Tesis Maestría] Piracicaba :
Universidade de Sâo Paulo; 2007
136
la posición de la base relativa a la molécula
GLOSARIO DE MICROBIOLOGÍA de azúcar en la armazón del ADN.
cADN : biblioteca de secuencias de ADN

Ácido-alcohol resistencia: Propiedad de las
especies del género Mycobacterium, por la ADN mitocondrial: Contiene 16,569 bp de
que las células teñidas con carbolfucsina ADN, además de 37 genes que codifican
caliente no se decoloran al tratarlas con algunas proteínas y moléculas de ARN
alcohol ácido. relacionadas con la función mitocondrial.
Este material se hereda por vía materna.
Ácido desoxirribonucleico (ADN): Gran Cuando se forma el cigoto, el
molécula de ácido mucleico que se espermatozoide aporta su genoma, pero no
encuentra principalmente en losc su genoma mitocondrial. El ADN
cromosomas de los núcleos celulares y que mitocondrial lo aporta el ovocito
es portadora de la información genética de
las células vivas. Aerobio: Microorganismo que vive y crece
en presencia de oxígeno libre.
Ácido nucleico: Polímero de nucleótidos. Aerobio estricto: Microorganismo que no
Véase ácido desoxirribonucleico y ácido puede crecer en ausencia de oxígeno.
ribonucleico.
Aerobio facultativo: Microorganismo
Ácido ribonucleico (RNA): Polímero de capaz de crecer en condiciones anaerobias
nucleótidos unidos por un esqueleto de pero que se desarrolla mas rápidamente en
fosfato-ribosa. Interviene en la síntesis de un media aerobio.
proteínas.
Agente antimicrobiano: Producto que mata
Acidófilo: Organismo que crece de manera o inhibe el desarrollo de microorganismos.
óptima en un medio ácido. Característica de
la célula u organismo celular que tiene Agudo: En relación a una enfermedad o
afinidad por los colorantes ácidos. síntoma que comienza bruscamente con una
intensidad marcada para desaparecer
Adherencia: Propiedad de las bacterias que después de un período relativamente corto
les permite adherirse (pegarse) a las de tiempo.
superficies de la célula hospedadora.
Amiloide. Que se vuelve azul con el yodo
Ácido desoxirribonucleico (ADN): Gran
molécula de ácido nucleico que se encuentra Análogo: Sustancia química idéntica a otra,
principalmente en los cromosomas de los excepto en un grupo funcional.
núcleos celulares y que es portadora de la
información genética de las células vivas. Anticuerpos: Proteínas globulares que
3´: Marca el final de una cadena de una aglutinan al antígeno. Poseen 2 sitios
molécula de ADN. El término 3´ se refiere a iguales para la fijación del antígeno. Se
la posición de la base relativa a la molécula compone de 2 cadenas iguales livianas L de
de azúcar en la armazón del ADN. 220 aminoácidos, (Low -molecular weight-
= bajo peso molecular) y 2 cadenas pesadas
5´: Marca el principio de una cadena de una H de 440 aminoácidos, (High molecular
molécula de ADN. El término 5´ se refiere a weight = Alto peso molecular).
137
Anaerobio: Microorganismo capaz de Basidioesporas : Esporas propias de los
vivir y crecer en condiciones anaerobias. basidiomycetes.
Anaeróbico: Entorno carente de oxígeno. Basidiomycetes : Hongo superior cuyas

Generalmente se refiere a un hábitat esporas se sitúan en la parte exterior de los
microbiano. basidios.
Anafilaxia (choque anafiláctico): Reacción Basófilos : Producen y almacenan:

alérgica violenta causada por una reacción histamina, factor quimiotáctico eosinófilo
entre un antígeno y un anticuerpo. anafiláctico, y otras sustancias. Su función
aparente es la hipersensibilidad rápida,
Antibiótico: Agente químico producido por como el asma alérgica. La reagina IgE se
un organismo que es dañino para otros une fácilmente a la membrana y si un
organismos. antígeno específico se aglutina a este
complejo se libera histamina, heparina y
Antígeno: Sustancia que interacciona con otros mediadores. También tienen un rol en
un receptor de las células T o con una las alergias por contacto.
inmunoglobulina.
Betalactamasa : Antibióticos del tipo de la
Ápice o apical. Extremo superior o punta penicilina, formados por una anillo
de una cosa.. betalactámico heterocíclico, con cuatro
átomos.
Argenta. Plateada.
Bactericida : Sustancia antimicrobiana con
Asca : Célula madre de los hongos capacidad para matar bacterias.
Ascomycetes : Donde se encuentran las Bacteriemia : Aparición transitoria de

esporas. bacterias en sangre.
Asexual : Reproducción que no requiere la Bacteriófago :Virus que infecta células

unión de los núcleos. procarióticas.
Atenuación : Selección de cepas de un Bacteriostático: Sustancia con capacidad

microorganismo patógeno que no son para inhibir el crecimiento bacteriano, pero
virulentos, pero que mantiene intacta su sin matar a la bacteria.
capacidad inmunitaria.
Brote: Aparición de gran número de casos
Bacteria : Microorganismo unicelular de la de una enfermedad en un corto periodo de
especie Esquizomicetos .El género presenta tiempo.
variedades morfológicas y sus componentes
pueden ser alargados (bacilos), redondeados Cápside: Cubierta proteica de un virus.
(cocos), o en forma de coma (vibrios). La
naturaleza de la enfermedad que producen Carcinógeno: Sustancia que inicia la
es diferente en cada bacteria. formación de un tumor.
Basidio : Célula más bien ancha y corta que CD4 Células T moléculas superficiales,
lleva en su exterior a las esporas de algunos cooperadoras/inductoras
hongos superiores.
Célula: Unidad fundamental de los seres
vivos. Con excepción de la célula
138
bacteriana, todas las demás poseen núcleo, Congénita, anomalía: Anomalía
citoplasma y diversos orgánulos que están generalmente estructural presente en el
rodeados por una membrana citoplasmática. momento del nacimiento que puede ser
heredada , adquirida durante la gestación u
Células B: Linfocitos dependientes de la ocasionada en el parto.
médula ósea; precursoras de las células
plasmáticas, sintetizan y liberan Congénita, enfermedad: Defecto físico o
inmunoglobulinas. mental presente en el momento del
nacimiento que puede ser heredada, o
Células cooperadoras: Basófilos, causada por la influencia de factores
eosinófilos y mastocitos. ambientales durante el embarazo.
Célula Gram negativa: Célula procariótica Conidio : Espora de origen asexual que no
cuya pared celular contiene relativamente se encuentra en el himenio.
poco peptidoglicano pero que tiene una
membrana externa compuesta por Conidióforo : Hifa que llevan los conidios.
lipopolisacárido, lipoproteína y otras
macromoléculas complejas. Relativo a la Contagio: Transmisión de una enfermedad,
coloración rosada de la contratinción que se se refiere sobretodo a infecciones.
utiliza para teñir microorganismos.
Contagioso: Que es transmisible. Por
Célula Gram positiva: Célula procariótica contacto directo o indirecto.
cuya pared celular está formada
principalmente por peptidoglicano y que Crateriforme : Que tiene forma de cráter.
carece de la membrana externa de las
células Gram negativas. Relativo a la Crónico: Enfermedad o proceso que se
coloración, célula que conserva el color desarrolla lentamente y persiste por largo
violeta de la tinción que se utiliza en el tiempo, con frecuencia toda la vida.
método Gram para tedñir microorganismos
Dehiscente : Que tiende a abrirse por sí
Células T: linfocitos dependientes del solo.
Timo, responsables de la inmunidad celular.
Desinfectante: Agente que mata
microorganismos, pero que puede ser
Clamidospora : Célula hifal, encerrada por también dañino para los tejidos humanos.
una gruesa pared celular.
Dextrinoide : Se dice de las esporas que
Claviforme : En forma de clava. con un reactivo yodado toman coloración
rojiza.
Colonia: Grupo de microorganismos de un
cultivo procedentes de una sola célula. EBV: Epstein-Barr Virus, = VEB en
Tienen diferentes características español = Virus de Epstein Barr.
morfológicas de tamaño, forma y color.
Eosinófilos: Células producidos en la
Columnela : Parte central estéril de la gleba médulas ósea , pueden aumentar su
de muchos Gasteromycetes y Myxomicetes producción si las células progenitoras son
que en forma de columna sale de la base del estimuladas por la interleucina 5 segregada
exoperidio. por los linfocitos T. Su nivel aumenta en las
infestaciones por parásitos, en reacciones
139
alérgicas, en el asma y en alguna patología Esterigma : Pequeña rama o estructura hifal
del miocardio. que sostiene un esporangio, un conidio o
una basidióspora.
Endémico (a): En relación a una
enfermedad o a un microorganismo propio Exotoxina: Toxina que se libera al exterior
de una zona geográfica o una población. de la célula.
Endocitosis: Proceso en el que una Fagocito Célula capaz de rodear engullir y

partícula es introducida intacta en una célula digerir microorganismos y detritus
animal. La fagocitosis (incorporación de celulares. Los macrofagos y las células del
cuerpos sólidos) y la pinocitosis sistema reticuloendotelial son fagocitos no
(incorporación de sustancias líquidas) son circulantes. Los leucocitos y los
dos tipos de endocitosis. macrófagos libres circulan en la sangre.
Enfermedad de transmisión sexual (ETS): Falso negativo: Resultado incorrecto de

Enfermedad que se transmite por contacto una prueba diagnóstica que indica
sexual. equivocadamente la ausencia de la
enfermedad.
Entérico: Referido al intestino.
Falso positivo: Resultado incorrecto de una
Enterotoxina : Toxina que afecta al prueba diagnóstica que indica la existencia
intestino Epidémico (a): Que afecta a un de la enfermedad.
número significativamente grande de
personas al mismo tiempo. Se refiere Fiebre: Elevación anormal de la
también a la enfermedad que se transmite temperatura corporal por encima de
rápidamente en una población que puede 37° C causada por una enfermedad.
oscilar entre un área demográfica delimitada
o cerrada. Filiforme : Que tiene forma o apariencia de
hilo.
Epidemia: Enfermedad que se presenta al
mismo tiempo en una gran cantidad de Fotofobia: Sensibilidad ocular anormal a la
individuos de una población. luz.
Epidemiología: Estudio de la incidencia, Fungemia: Presencia de hongos en la

distribución y causa de las enfermedades en sangre.
el hombre.
Fúngico : Relativo a los hongos.
Espora : Corpúsculo reproductor de las
plantas criptogámicas. Fusiforme : En forma de huso.
Esporangio : Estructura a modo de saco Gangrena: Muerte o necrosis de un tejido

cuyo contenido protoplasmático se como consecuencia de isquemia, o invasión
convierte en gran cantidad de esporas. bacteriana, afecta con mayor frecuencia las
extremidades, pero puede desarrollarse
Esporocitos : Recipiente hueco: estructura también en órganos internos (intestino,
que contiene las esporas. vesícula biliar).
Esporulación : Acción y efecto de Germen: Cualquier microorganismo,

esporular: producir esporas. especialmente los patógenos.
140
Hábitat. Lugar donde vive. Infección intrahospitalaria (IIH) :
Infección que se adquiere luego de 48 horas
Hemólisis : Presencia de restos de de permanecer en el establecimiento de
eritrocitos lisados alrededor de una salud y que el paciente no portaba a su
colonia desarrollada en una placa de ingreso. Se consideran también a aquellos
agar sangre de carnero. procesos infecciosos que ocurren hasta 30
días luego del alta.
Hemólisis alfa : Las colonias están
rodeadas por una destrucción parcial Infección por gotitas: Infección adquirida
de los eritrocitos y pérdida de algo de por inhalación de microorganismos
hemoglobina en el agar lo que resulta patógenos suspendidos en las partículas de
en una coloración verde (hemólisis líquidos procedentes de una persona
incompleta). infectada a través del estornudo o la tos.
Hemólisis beta : Las colonias están Inmunocompetente: Persona que presenta

rodeadas por una zona de hemólisis un estado óptimo de su inmunidad, celular y
completa (clara, transparente) debido a humoral que le permite resistir a un proceso
una destrucción total de los eritrocitos infeccioso.
Hemoptisis: Expulsión de sangre de la vías Inmunodeficiente-inmunodeprimido:

respiratorias con la tos. Persona que en el que existe un estado
anormal del sistema inmunitario, por lo que
Hemorragia: Pérdida externa o interna de la inmunidad humoral o celular o humoral
una gran cantidad de sangre en un período son inadecuadas y disminuyen la resistencia
corto de tiempo. a las infecciones.
Hialina. Transparente como el vidrio o Inmunidad celular: Respuesta inmunitaria

parecido a él. con ausencia de anticuerpos, se necesitan
linfocitos activos.
HTLV-1: Retrovirus asociado a la
leucemia de células T .Endémico en el Inmunidad humoral: Respuesta
Caribe, Japón y Sur-este USA. inmunitaria caracterizada por la síntesis y
liberación de anticuerpos.
Ictericia: Coloración amarillenta de la piel,
mucosas y conjuntivas ocasionada por Inóculo: Alicuota de una muestra que
aumento de la bilirrubina. es transferida a un medio de cultivo.
Incubación : Mantenimiento de Limpieza: Es la remoción mecánica de

cultivos bacterianos en condiciones toda materia extraña con el objeto de
favorables para su desarrollo y disminuir el número de
multiplicación. microorganismos. Se realiza a través
del arrastre mecánico, sin embargo no
Infección : Invasión y multiplicación se asegura la eliminación de éstos.
de microorganismos en un huésped,
pudiendo progresar hacia una Linfocitos :Células básicas de la inmunidad
enfermedad. El término enfermedad adquirida.
infecciosa se aplica cuando aparecen
signos y síntomas como resultado de la Macrófago : Célula fagocítica del sistema
infección. reticuloendotelial.
141
Mácula : Mancha. Necrosis : Muerte de una porción de tejido
como consecuencia de una enfermedad o
Medio de cultivo: Medio artificial de lesión.
sustancias nutritivas necesarias para
el crecimiento y multiplicación de laa Nucleótidos, bases: · Adenina (A),Timina
bacterias in vitro, que puede (T),Guanina (G), Citosina (C)
encontrarse en estado sólido,
semisólido o líquido. Oncogén : gen que estimula la
reproducción celular.
Meningitis : Infección o inflamación de las
meninges que son las membranas que Oxidación: Reacción química que
recubren el cerebro y la médula espinal. implica la pérdida de electrones de los
átomos. Mezcla de una sustancia con el
Metabolismo: Proceso de degradación oxígeno y un aumento en la valencia.
y biosíntesis enzimática que tiene
lugar dentro de una célula y por medio Paciente : Persona que recibe un cuidado
del cual se mantienen las actividades sanitario, que esta hospitalizado o enfermo.
nutricionales y funcionales.
Plásmido : ADN de forma circular, situada
Micelial : Relativo al micelio o propio de fuera del cromosoma, a veces porta
él. información genética y se replica de modo
independiente.
Micélico : Perteneciente o tocante al
micelio. Patógeno : Microorganismo capaz de
producir enfermedad.
Micelio : Aparato nutritivo o talo de los
hongos. Parte vegetativa del hongo formada Polimorfa: Que puede tener varias formas.
por el entrelazamiento de las hifas.
Predisposición: Estado de una persona de
Micosis : Infección causada por un hongo. ser susceptible a determinado estímulo.
Microaerofílico: Organismo que crece Prevalencia : Número de casos nuevos de

y se reproduce mejor en la presencia de una enfermedad durante un tiempo
una tensión del 5% de oxígeno, 10% de determinado.
anhídrido carbónico y 85% de nitrógeno.
Reconstituir: Restablecer la forma
Microorganismo viable: Es aquel que es original de una sustancia previamente
capaz de reproducirse. alterada para su conservación y
almacenamiento, mediante la
Mitógeno : Sustancia que induce la mitosis. combinación con un líquido adecuado.
Monocitos : Leucocito mononuclear Registro: Documento que provee

producido en la médula ósea, fagocítico, en evidencias objetivas de las actividades
tránsito por sangre periférica. Tienen efectuadas o de los resultados
receptores Fc. Los monocitos con los obtenidos.
macrófagos componen el sistema
mononuclear fagocítico del sistema Riesgo : Estado de vulnerabilidad de una
reticuloendotelial. Según el estímulo pueden persona o una población frente a una
funcionar como células citotóxicas. enfermedad.
142
Riesgo, factor de : Cualquier factor
(ambiental o fisiológico) que produce en Traducción : Formación de una secuencia
una persona o población un estado de de aminoácidos a partir de una secuencia de
vulnerabilidad ante un suceso nocivo bases de una molécula de ARNm.
(enfermedad-infección).
Transcripción : Transferencia de la
Secuencia : Orden que siguen las bases de información genética del ADN por medio
nucleótidos en una cadena de ADN. de la síntesis de una copia de ARN de una
plantilla de ADN.
Septicemia : Infección sistémica que se
caracteriza por la aparición de patógenos en Translocación : Transferencia de un
sangre circulante que provienen de una fragmento de un cromosoma a otro, y
infección localizada en cualquier lugar del también el desplazamiento del ARNm por el
organismo. ribosoma durante la traducción.
Siembra primaria : Inoculación de una Traducción : Segundo paso de la

muestra a un medio de cultivo simple, expresión genética: es la síntesis de
selectivo o de enriquecimiento. proteínas a partir de un molde ó plantilla de
mARN, donde la secuencia de aminoácidos
Shock : Estado fisiológico anormal que se está determinada por la información
caracteriza entre otras por disminución del contenida en el mARN
gasto cardíaco, aumento de la frecuencia
cardíaca, disminución de la presión arterial. UFC: Unidad formadora de colonia.
Es la primera fase de la reacción del
organismo frente a una lesión traumática. Vector: Portador capaz de transmitir una
enfermedad .Los vectores biológicos son
Shock séptico : Shock causado por la por lo general artrópodos en los cuales el
septicemia debido a la liberación de microorganismo infectante completa su
endotoxinas bacterianas que están en ciclo vital.
la corriente sanguínea
Subcultivo : Pasaje de bacterias

viables derivadas de otro cultivo a un
medio de cultivo nuevo.
143

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El objetivo de estas prácticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las

Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prácticas, no es una

1. El alumno deberá ingresar al laboratorio con equipo de seguridad:

REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA ............................................ 4

MATERIAL Y EQUIPO BÁSICO EN LAS PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA .................................. 6

PRÁCTICA Nº 1: NORMAS DE BIOSEGURIDAD .................................................................................. 8

PRÁCTICA Nº 2: OBTENCIÓN Y MANEJO DE MUESTRAS CLÍNICAS........................................... 19

PRÁCTICA N° 3: COLORACIONES MICROBIOLÓGICAS SIMPLES ................................................ 28

COLORACIÓN DE GRAM ............................................................................................................................. 33

PRÁCTICA Nº 4: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLÓGICO ........................ 39

MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO.............................................................. 45

PRÁCTICA Nº 5: ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA .......................... 52

PRÁCTICA Nº 6: CULTIVO DE MUESTRAS CLÍNICAS: UROCULTIVO Y COPROCULTIVO ...... 59

PRÁCTICA Nº 7: IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS ......................................................... 71

PRÁCTICA Nº 8: DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS ............ 82

PRÁCTICA Nº 9: IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE MYCOBACTERIUM ............................ 91

PRÁCTICA Nº 10: DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO DE HONGOS AMBIENTALES ........................ 103

PRÁCTICA Nº 11: DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTÁNEAS............... 110

PRÁCTICA Nº 12: DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTÁNEAS, SISTÉMICAS Y

DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS Y OPORTUNISTAS ............................................... 118

PRÁCTICA Nº 13: DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO ............................................................................. 130

FUENTES DE INFORMACIÓN ............................................................................................................. 136

GLOSARIO DE MICROBIOLOGÍA ...................................................................................................... 137

En el campo de la microbiología médica se requieren de conocimientos básicos,

▪ Asa y aguja de siembra: Muy usada en la práctica microbiológica, hecha de alambre

▪ Centrífuga: Aparato diseñado para acelerar la separación de partículas sólidas

▪ Contador de colonias: Sirve para contar electrónicamente y de forma exacta las

▪ Crioviales: Pequeños tubos cónicos de polipropileno resistentes a muy bajas

▪ Estufa: Aparato de dimensiones diversas, donde se incuban los cultivos, generalmente

▪ Filtros esterilizantes: Para dejar libre de contenido microbiano a productos en estado

▪ Gradilla: Soporte para tubos de ensayo.

▪ Jarra de anaerobiosis: Instrumento útil para el aislamiento de bacterias anaerobias ya

▪ Matraces y balones: Recipientes volumétricos de gran utilidad para la preparación y

▪ Medios de cultivo: Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de

▪ Microscopio: Instrumento óptico utilizado para la observación de microorganismos

▪ Pipetas Pasteur: Varillas de vidrio de 4 mm de diámetro y de 20 a 30 cm de longitud.

▪ Pipeteadores automáticos: Pipetas que absorben de forma automática sin necesidad de

Autoclave Cabina de Flujo laminar

 Minimizar los riesgos protegiendo al alumno, profesor, personal administrativo y al

¿Qué es bioseguridad? Conjunto de medidas preventivas orientadas a mantener,

El laboratorio de microbiología es un espacio adecuado para realizar los análisis

Además debemos de saber que según la OMS (Organización mundial de la salud),

Encuesta de laboratorio y comportamiento (Phillips, 1965)

En el Perú existe un manual de bioseguridad que es NORMA TÉCNICA N° 015 -

 Los avisos deben ser llamativos.

 Agapito, F. (2016). Bioseguridad en el laboratorio. Universidad Científica del

1: Imágenes de los materiales y del equipo:

▪ Realizar los procedimientos adecuados para asegurar las medidas de bioseguridad

En términos de la efectividad del Laboratorio de Microbiología, nada es más importante

▪ La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.

▪ Cuando se va a proceder a tomar un espécimen clínico, es importante evitar la

▪ Seleccionar el lugar anatómico correcto de donde se obtendrá el espécimen y utilizar

▪ Nunca refrigerar una muestra por anaerobios.

▪ Coleccionar un apropiado volumen de la muestra.

▪ El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su grado de

▪ Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibióticos o agentes

CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA

 Hoja de solicitud de análisis no llenada correctamente

Las muestras más frecuentes en los estudios microbiológicos son:

En las muestras de orina se pueden realizar diferentes análisis como: examen