Unión enzimática de fragmentos de DNA

La unión o ligado covalentes de moléculas de DNA se basa en la reacción enzimática muy simple: la
esterificación del OH en 3’ de una desoxirribosa terminal por un resto fosfato unido a la posición 5’
de otra desoxirribosa también terminal, la formación de este puente fosfodiester provoca la unión
covalente de las cadenas polinucleotídicas que aportan ambas desoxirribosas:

La actividad que cataliza esta reacción recibe el nombre de DNA-ligasa y requiere dos cofactores:
iones Mg+2 y ATP.

Una de sus funciones esenciales in vivo es el de sellado de la muescas que aparecen en las
moléculas de dsDNA celulares como resultado de diferentes procesos

Su aplicación a la unión de fragmentos de DNAs basa en el hecho de que, en ocasiones, estos

mimetizan in vitro la estructura del sustrato de la enzima el caso más sencillo de ver es el de dos
piezas de dsDNA con extremos mono catenarios protuberantes y de secuencias complementarias,
de forma espontánea pueden acoplarse y mantenimientos transitoriamente unidas por puentes
hidrógenos, dando lugar a un intermediario no covalente de estructura semejante a la de un
dsDNA con dos muescas; la ligasa acepta esta molécula como sustrato y cataliza el sellado de
ambas muescas, produciendo la unión de dos piezas.
Existen dos requisitos para esta unión:

 Los terminales presenten las posiciones 5’ fosforiladas y las 3’ con grupo OH libres.
 Las regiones monocatenarias que sobresalen en el extremo de cada fragmento sean
complementarias entre sí o a lo largo de toda su longitud, para que puedan unirse a través
de puentes hidrógenos entre bases nitrogenadas, es decir que sean cobesivas

De esta forma, dos piezas de DNA que resulta de la digestión de una misma enzima de restricción
van a tener extremos protuberantes y cohesivos entre sí, es decir, compatibles. Este es el camino
más directo para preparar los terminales de dos fragmentos de dsDNA que se desee unir.

La DNA-ligasa es también capaz de unir dos fragmentos de DNA de doble hebra fosforilados en 5’
con terminales romos. Siguiendo un mecanismo más complicado, que no pasa por la formación de
intermediario no covalente, puede darse un encuentro triple que implique a los dos extremos de
dos piezas de DNA y a la molécula de la enzima.

Las características particulares de esta reacción hacen que funcionen mejor las concentraciones
mayores de DNA y de enzimas para favorecer los choques triples

Esta reacción es más compleja que en el caso anterior, sigue una cinética diferente y es totalmente
inespecífica respecto a la secuencia de las regiones terminales, ya que no requiere el
acoplamiento previo de los mismos y todo extremo romo es “compatible” con cualquier otro. Esto
puede resultar inconvenientemente dentro de una estrategia de clonaje, pero por otro lado,
permite unir piezas preparadas por vías que no exigen el uso de una endonucleasa específica.

DNA- Ligasa
Es una enzima de tipo ligasa que forma enlaces covalentes entre el extremo 5’ de una cadena
polinucleotídica y el extremo 3’ de otra cadena polinucleotídica. También se denomina enzima de
unión de polinucleótidos.

Su función es catalizar un enlace fosfodiéster entre el grupo 3'-hidroxilo extremo de una de las
cadenas de ADN y el grupo 5'-difosfato del extremo de la otra cadena de ADN. Para llevar a cabo
esta reacción, la célula necesita energía porque se trata de una reacción termodinámicamente
desfavorable, es decir, no es una reacción que sucede de manera espontánea.
Por un lado, en las células eucariotas y en las arqueas, la fuente de energía es el ATP (Adenosin
Trifosfato). La molécula de ATP se separa en AMP (Adenosin Monofosfato) y pirofosfato para
facilitar la dirección.

Por otro lado, las bacterias obtienen la energía del NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) el
cual se divide en AMP y NMN (mononucleótido de nicotinamida) con la misma finalidad que lo
hace el ATP de eucariotas y arqueas.

La ADN ligasa no puede unir dos moléculas de ADN de cadena sencilla (ADN con una sola cadena)
ni formar un ADN circular de cadena sencilla sino que su función es sellar las roturas que han
tenido lugar en las moléculas de ADN de doble cadena (ADN con dos cadenas enrolladas en forma
de doble hélice) en el momento de la separación de la doble hélice.

La bacteria E.Coli es capaz de formar un enlace fosfodiéster si hay al menos algunas bases
nitrogenadas de ADN de cadena sencilla con el extremo de un fragmento de ADN de doble cadena
y formar pares de bases.

La ligasa codificada por el bacteriófago T4 puede unir dos fragmentos de doble hélice de extremos
romos, esta capacidad se explota en la tecnología de ADN recombinante.

La manera más sencilla del ADN es aquella que tiene su extremo romo. Este tipo de moléculas
terminan con un par de bases. Las moléculas con extremos romos tienen dos desventajas; la
primera es que las cadenas con extremos romos tienen menos rendimiento y la segunda es que
tiene más posibilidades de insertar el fragmento de ADN deseado en la dirección opuesta a la que
se quiere. por otro lado, dos extremos romos siempre serán compatibles entre sí.

La enzima reacciona con ATP o NAD+ para formar una molécula de AMP ligada por un grupo
fosfoamido con el grupo amino del sitio activo de la lisina.B. El fosfato 50 del ADN ataca el grupo
fosforilo del AMP para formar ADN adenilado.C. La ADN ligasa cataliza la reacción entre el grupo
OH del ADN y el fosfato 50 activado para formar un enlace fosfodiéster así liberando AMP.

Mecanismo de actuación de la ADN ligasa

Para formar los dos enlaces fosfodiéster covalentes entre ambos extremos de las dos cadenas, la
ADN ligasa cataliza una reacción junto con el ATP que sigue 3 pasos:

1. Adenización de un residuo en el centro activo de la enzima liberando fosfato.

2. Transferencia del AMP hacia el fosfato 5 'del donante originando la formación de un enlace
pirofosfato.
3. Formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato 5 'del donante y el hidroxilo 3' del
aceptor. Cuando la ligasa trabaja sobre extremos romos requiere mayor concentración de
enzimas y diferentes condiciones de reacción
ADN ligasas en mamíferos

 ADN ligasa I
 Esta ADN ligasa es principal en el mecanismo de replicación del ADN. En el dominio del
grupo amino terminal no catalítico se localiza el centro activo de esta enzima. Además la
ADN ligasa I participa en la excisión del ADN así permitiendo su reparación y
mantenimiento junto con otras proteínas como la beta ADN polimerasa, con la cual la ADN
ligasa I interacciona de manera directa, formando así un complejo multiproteico
desempeñando dicha función.

 ADN ligasa II
Esta enzima es un fragmento generado por proteólisis de la ADN ligasa III.

 ADN ligasa III

Dos formas de la ADN ligasa III son generadas por el gen LIG3: alfa-ADN ligasa III y beta-
ADN ligasa III. Estas enzimas se diferencian por su habilidad de unirse a la proteína
reparadora del ADN, XRCC1. La proteína XRCC1 solo se une a la alfa-ADN ligasa y se hace a
través del dominio BRCT en el fragmento C-terminal de los polipeptidos de la ligasa. Esta
proteína permite la reparación de daños en la cadena simple de ADN y la reparación por
escisión de base (BER). Por otro lado la beta-ADN ligasa III parece ayudar en la finalización
de la recombinación meiótica o en la reparación del ADN postmeiosis.

 ADN ligasa IV
La ADN ligasa IV se une a una proteína reparadora de ADN, XRCC4. Esta unión se hace a
partir de la región C-terminal de la ADN ligasa IV, que contiene dos dominios BRCT. Esta
interacción, estimuladora para la actividad de unión del ADN implica que esta enzima
funciona en el sistema de recombinación genética V(D)J y en la unión terminal no-
homóloga de las rupturas de ADN bicatenario

DNA-ligasa del bacteriófago T4

Es un virus de tipo I con ADN que infecta bacterias Escherichia coli. Tiene un tamaño aproximado
de 200 nm. El fago T4 pertenece al grupo T, que incluye también los enterobacteriófagos T2 y T6. El
fago T4 posee un ciclo vital lítico únicamente, y no lisogénico.

Su ADN es bicatenario y lineal, mide 169 kb y puede codificar hasta 289 clases de proteínas.

Al objeto de preservar su ADN evitando la acción de las nucleasas de la célula huésped, éste
contiene unas bases nitrogenadas diferentes a las habituales como citidina e hidroximetilcitidina.
De esta forma el virus puede hacer uso de sus propias nucleasas para destruir el ADN celular de su
huésped, la bacteria E. coli.

Su estructura es de tipo complejo. Consta de un capsómero (con ADN en el interior) o cabeza,

unido a un collar y a una cola. La cola posee en su extremo final una placa basal, en la que residen
los parásitos (parte inferior de la placa) y a la que se unen las fibras de la cola, que permiten la
unión del fago a la bacteria. En el collar aparecen una especie de 'bigotes', sensores ambientales
que evitan la infección fágica en condiciones desfavorables por regulación de la retracción de las
fibras de la cola. Todas las estructuras son proteicas.
El fago T4 tiene algunas características únicas como:

 Alta velocidad de copia de ADN con sólo un error cada 300 copias.
 Mecanismos especiales de reparación.
 Redundacias terminales que pueden recombinarse y formar concatémeros. El ADN de los
viriones maduros es el resultado del corte de los concatémeros en las unidades que lo
forman, el genoma del virus.

Aplicaciones

 Unión de fragmentos de dsDNA con extremos protuberantes, complementarios y

cohesivos
 Unión de moléculas de dsDNA con extremos romos
 Unión de Linkers a fragmentos de dsDNA con extremos romos

Extremos de los fragmentos a unir

 Extremos protuberantes iguales obtenidos por digestión con la misma enzima
Es el caso más sencillo: Ambos fragmentos se han obtenido por digestión con la misma
enzima por lo tanto terminales idénticos, protuberantes y cohesivos, los que permiten la
unión transitoria de las dos piezas mediante puentes de hidrogeno y su sellado posterior
catalizado por las ligasas.

El procedimiento de preparación de extremos es sencillo, aunque el conjunto de los

productos de ligasa es complejo.
 Terminales compatibles obtenidos por digestión con enzimas diferentes
Los fragmentos a unir también se pueden preparar con digestión con enzimas que
reconocen diferentes dianas, pero que producen regiones protuberante idénticas.
Es importante señalar que la unión de fragmentos en extremos compatibles formados de
esta manera puede dar lugar a la molécula de DNA en las que se hayan perdido las dianas
originalmente usadas para la preparación de piezas de partidas.
 Extremo romos
 Se trata del caso menos especifico y por lo tanto el más universal.

Puesto que en este caso la reacción de ligado no atraviesa una etapa previa con formación
de un intermediario no covalente, la contabilidad de terminales es absoluta: cualquier
extremo romo puede unirse a cualquier otro extremo romo, independientemente de la vía
seguida para su preparación.

Este tipo de unión presenta ciertos inconvenientes:

 La práctica de la reacción es más compleja

 La orientación en la unión de las piezas es incontrolable, lo que puede ser un problema

En muchos casos la unión de fragmentos es irreversible, ya que no suele recuperarse

ninguna diana de restricción en los puntos de ligado.

Modificación de extremos:
 Modificación del estado de fosforilación de los extremos
El enlace fosfodiester cuya formación cataliza la ligasa se formara a partir de un resto de
fosfato unido a un OH en 5’ de una desoxirribosa, y un grupo OH libre de un 3’ de la
desoxirribosa contigua.

Si las piezas a unir presentan un esquema de fosforilación distinta tendrá que ser corregido
haciendo uso de las actividades de fosfatasa o quinasa

 Conversión de terminales protuberantes en terminales romos

Esta es una modificación que puede lograrse por dos caminos opuestos:

 Recortando el extremo monocatenario protuberante mediante digestión con una

exonucleasa
 Rellenando la región en monohebra mediante incubación con una polimerasa

Es importante señalar ciertos detalles:

 La opción degradativa:
Es válida siempre, sea cual sea el terminal que sobresale, pero elimina la secuencia
monocaterania he impide la recuperación de la diana de restricción tras el ligado
 La opción rellleno:
Solo es viable cuando el extremo protuberante es el 5’ y la polimerasa puede elongar
el 3’ retraído y en algunos casos especiales ofrece las posibilidades de que el sitio de
restricción se recupere tras la unión al segundo fragmento
 Conversión de terminales romos en extremos protuberantes
Consiste en la construcción de una región homopolimerica en los extremos 3’ de un dsDNA
lo que se conoce como la cola

El procedimiento tailing supone la realización de dos incubaciones en paralelo en una de

ellas, uno de los fragmentos a unir se trata con la enzima en presencia de un solo dNTP; en
la otra incubación, la segunda pieza se trata con la dNTT y el dNTP de base
complementaria al primero.
 Relleno parcial de terminales protuberantes en 5’
Se basa en el relleno de regiones con el 3’ retraído mediante una polimerasa pero en
presencia de tan solo ciertos dNTPs precursores, así se puede conseguir rellenar
parcialmente los terminales monocatenarios y reducirlos a unas secuencias cohesivas más
cortas pero compatibles
Linkers y adaptados
 Linkers:
 Los Linkers son segmentos cortos de DNA de doble hebra que contienen una secuencia de
reconocimiento para una enzima de restricción (dianas).

 Supongamos que tenemos un inserto con extremos romos. Como antes se ha comentado,
el clonado de estos insertos es inespecífico, pero si llegasen a tener extremos cohesivos la
unión sería específica. Por eso, se pueden añadir al inserto varias bases adicionales para
conformar un extremo cohesivo nuevo (en definitiva es alargar el inserto sin variar en
absoluto su secuencia).

 Procedimiento: tenemos un inserto de extremos romos (dos hebras negras) y el linker de

EcoRI, que como se puede observar es una secuencia repetida de su secuencia diana. Se
liga el inserto al linker y posteriormente se corta con EcoRI, quedando el inserto con dos
extremos cohesivos a cada lado.
  Problema: puede que dentro del inserto haya una diana para la enzima de restricción que
se emplea en el segundo paso, por eso antes de ligar el inserto a los linkers se hace un
tratamiento específico de metilación para protegerlo.

 Adaptadores:
 Los adaptadores son secuencias de DNA cuyo objetivo es el de “transformar” un extremo
de un tipo en otro, o cambiar un extremo cohesivo producto de una enzima de restricción
en otro extremo.

 Esto es algo análogo a un “cambio de enchufe”: podríamos tener un inserto con un

extremo romo originado por la enzima XmnI y querer transformarlo en un extremo
cohesivo de EcoRI. Para ello se emplea un adaptador simple formado por un extremo romo
de XmnI y uno cohesivo de EcoRI ligados. Este adaptador se liga con el inserto por la parte
del extremo romo de XmnI.
  Por otro lado podríamos tener un extremo cohesivo originado por BamHI y necesitar un
extremo cohesivo de EcoRI. Para ello se emplea un adaptador convertidor, que consta de 3

partes: extremo de BamHI, fragmento romo de XmnI y finalmente el extremo de EcoRI.

Este adaptador se uniría al inserto por la parte de BamHI y acabaría con el extremo
deseado de EcoRI. La parte de XmnI es simplemente un puente.

Consideraciones del proceso de ligando

 Factores que afectan al rendimiento del proceso

En el caso más general, en el medio de la reacción existe cuatro regiones terminales que
pueden ser compatibles, de manera que la ligasa puede catalizar la unión de cualquier
pareja entre ellas; esto lleva a la formación de una serie de subproductos mayoristas son
moléculas circulares, resultados de uniones intracatenarias y moléculas dimericas,
resultado de la unión de dos moléculas idénticas; además, ya en menor proporción, se
forman otras estructuras resultado de reacciones de orden superior

Existen diversas formas de reducir la formación de subproductos y evitar así una caída
considerable en el rendimiento:

 Aumentando la concentración de lo0s fragmentos se favorecen los choques

intermoleculares y se reduce la frecuencia de la uniones intramoleculares que llevan a
la formación de los círculos monomericos

 La preparación de cada uno de los fragmentos con sus dos extremos distintos impide
que puedan formar círculos intramoleculares
 La construcción de colas de homopolimeros completamente en ambas piezas es una
solución ya que se impide tanto la circulación de monómeros copmo la polimerización
de fragmentos
UNIVERSIDAD
NACIONAL SAN

AGUSTIN
Facultad de ingeniería de procesos
Química orgánica II
ING. Luis Salazar cossio
ALUMNA: SHEILA SOFIA BERNEDO
MANRIQUE
CUI: 20150755 turno: A
AREQUIPA-PERÚ
2017