Técnicas para estudios celulares - Conteo y viabilidad

Informe de Laboratorio #3

Camila Carmona,Miguel Martinez, Laura Zapata

Ingeniería Biológica, Facultad de Ciencias , Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín
ccarmona@unal.edu.co–mmartinezju@unal.edu.co – lzapatabo@unal.edu.co

Febrero 4, 2019

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1. Introducción levemente se tomó una muestra de eso y por capilaridad se insertó en

La centrifugación es una técnica en la cual se separan los compuestos
dependiendo su densidad, esto se hace gracias a la fuerza de la
gravedad creada en un centrífuga, aparato que gira rápidamente el
tubo que contiene la muestra, generando una fuerza centrífuga que
sedimenta las concentraciones quedando éstas en varias fases, lo cual,
hace más fácil su separación. [1]
el hemocitómetro, se montó la muestra en el microscopio y se intentó
analizar la muestra, pero no fue posible encontrar células en ninguna
de las muestras por lo cual tuvimos que usar los resultados de la
profesora para hacer los cálculos.
3. Resultados

http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/sho/Centrifugacion-PIS.pdf ● Práctica de centrifugación de sangre

Los resultados del conteo celular ,no fueron tomados durante la
Uno de los objetivos de la práctica fue por medio de la práctica ya que no fue posible observar células de ningún tipo en el
centrifugación, separar en fases una muestra de sangre. Normalmente hemocitómetro, por lo tanto fue necesario que la monitora repitiera el
se dividen los glóbulos rojos, glóbulos blancos (granulocitos, experimento bajo las mismas concentraciones.
neutrófilos y linfocitos), plaquetas y el plasma, quedando este último
en mayor proporción en la parte superior del tubo. Sin embargo, se Imagen 1.Solucion de sangre con PBS y ficol.Primera etapa
buscó por medio del Ficol separar también en otra fase los glóbulos
blancos y plaquetas. Esta muestra de células mononucleares se
utilizaría luego con el objetivo de aprender a realizar un conteo de
células en un hemocitómetro de Neubauer.También fue necesario
utilizar el método de centrifugación para recoger muestras de algas y
protozoarios en tres tipos de aguas y clasificar cada una de las
estructuras encontradas.

2. Metodología Sangre +PBS

Se comenzó la práctica con la muestra de sangre, se extrajeron 2 ml Ficol

de PBS y 2ml de sangre , luego de invertir suave, la solución se
agregó lentamente en 3 ml de ficol .Se llevaron las muestras a la Imagen 2.Solución Centrifugada.Segunda etapa
centrifugadora a una temperatura de 4 °C, por 20 minutos a 1500
rpm.Mientras se centrifugaba la muestra, se prosiguió con el análisis
de 3 tipos de aguas:A y B de aguas estancadas, y C del acuario. Cada
equipo tomo 2 muestras de un solo tipo y se pusieron juntos con las
de otros 2 tipos de aguas en la centrifugadora por 20 minutos a 80
gravedades. Pasados los 20 minutos se extrajo toda el agua que estaba
encima del sedimento a analizar, de este se extrajo un poco con las
pinzas y en un portaobjetos se puso un poco de muestra sobre 1 gota
de glicerina y se puso un cubreobjetos encima. Se llevó a montar la Plasma
muestra en el microscopio y se visualizaron en 40x y se compartieron
las muestras con los demás equipos.Al terminar eso, el tiempo de Células mononucleares
centrifugado de las células sanguíneas también había terminado por Ficol
lo cual procedimos a extraer el plasma encima del aro con las células
mononucleares y con lo recolectado se separó en otro tubo del cual se Glóbulos rojos
tomaron 10 ul y se mezclaron con 10ul de azul de tripan. Al agitar
Tabla 1.Conteo celular Imagen 5. Muestra 40x algas.

Cuadrante Células vivas Células muertas

1 27 8

2 25 8
Chlorella
3 17 3

4 22 4 Scotinosphaera

Total 91 23

Células por ml =(91/4)*2*10000=455000

Células totales=455000*2= 910000 Imagen 6. Muestra 40x algas y arácnido
Viabilidad celular=91/114=79,8%
Células mononucleares en cuerpo
humano=5000*455000=2.275.000.000

● Práctica de centrifugación de aguas

Imagen 3. Muestras de aguas antes de centrifugar

Ima

Ácaro de
agua

C
Diatomea
s
A B

gen 4. Muestras de aguas después de centrifugar Muestra B

Imagen 7. Muestra 40x tecameba y palmella

C
B
Palmel
la
Tecam
eba

Imagen 8. Muestra 40x paramecium y chlorococcum

Muestra A
 Chloroco
ccum
Tecame
ba
Parameci
um
Bursaria
Palmella

4. Discusión
Imagen 9. Muestra 40x micractinium y coleastrum
En la primera parte de la práctica no fue posible calcular el número
de células mononucleares debido a que hubieron varios errores; al
momento de añadir la solución de PBS y sangre al final se pudo
provocar hemolisis debido a la rapidez de la adición, (buscar
definicion de hemolisis en inglish), también cuando se extrajo el aro
Coelas de la solución centrifugada, al momento de usar la pipeta pasteur se
trum mezclaron las células mononucleares con el ficol, dificultando la
separación de los mismos.

Micrac Además, hay que tomar en cuenta que la extracción de la muestra de

tinium sangre se realizó varias horas antes de iniciar el procedimiento, por lo
cual se pudieron dañar varias células debido a que la muestra se
encontraba a temperatura ambiente. El contacto con el aire de la
solucion sanguinea a estas temperaturasy al mayor tiempo de
almacenamiento genera un amuento de pH (anexo
https://books.google.com.co/books?
id=nM8ED6gYou0C&pg=PA623&lpg=PA623&dq=temperatura+de+
preservacion+de+la+sangre+para+centrifugacion&source=bl&ots=H
Muestra C qTridIqsg&sig=ACfU3U193lpiUjbz1xxb7CKLj7fPLyQOZQ&hl=es
Imagen 10. Muestra 40x anabaena y ulothrix &sa=X&ved=2ahUKEwjg-
ISI7J3gAhUvzlkKHVDrAqkQ6AEwFnoECAIQAQ#v=onepage&q=
temperatura%20de%20preservacion%20de%20la%20sangre%20para
%20centrifugacion&f=false 621 ) el cual puede alterar la
concentración de iones y destruir la célula. Una de las mejores
manera de preservar muestras sanguíneas es almacenarla a bajas
temperaturas, alrededor de los 4 centígrados
Anabaena Los resultados brindados por el laboratorista nos indican que la
muestra estudiada tiene un 10 % de lo que se considera un conteo
normal de GB en el cuerpo humano. Podemos inferir que el conteo
fue mal realizado o de lo contrario la donate estaría sufriendo de
leucopenia y linfopenia.
Ulothrix
.https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003643.htm

En la segunda parte de práctica, encontramos en las tres muestras de

agua presencia de diferentes tipos de algas, artrópodos y protozoos.
Las algas que se encontraron son de aguas estancadas, estas
proliferan en aguas que se encuentran cercanas a la luz, unicelulares y
multicelulares, los artrópodos que se se encontraron era acaros de
Imagen 11. Muestra 40x palmella y tecameba
agua.

5. Conclusiones

Esta práctica nos ayudó a comprender los procesos de separación por

centrifugación, como la fuerza gravitatoria decanta las partículas y la
intensidad de esta que se requiere para separar distintas mezclas.
proceso de centrifugado, no destruccion de memmbranas, mato
al acaro

6. Preguntas

F. ¿Qué métodos se conocen para determinar la viabilidad celular ?

Explique brevemente
http://0-hera.ugr.es.adrastea.ugr.es/tesisugr/1850579x.pdf

G. ¿Cómo actúa el azul de tripan sobre las células?Explique

H. ¿Qué errores se han podido cometer al realizar el recuento de

células en la cámara de Neubauer?
R//: A pesar de que durante la práctica de laboratorio no nos dio el
experimento ,los errores presentados en los datos suministrados por
la profesora se pudieron dar ya que el conteo de células en la
cámara de Neubauer suele tener un margen de error entre 20% y
30% debido al pipeteo, a los errores estadísticos por ser la muestra
poco representativa, errores del volumen de muestra realmente
introducido en la cámara, a la dificultad para extraer la cantidad de
entre la fracción plasmática y la celular, además dificultad para
encontrar en la cámara la retina grabada.. Sin embargo, el
hematocitómetro sigue siendo uno de los métodos más
ampliamente utilizados en los laboratorios de todo el mundo.

http://www.celeromics.com/2012/es/resources/Technical
%20Notes/Como-contar-celulas-con-camara-de-Neubauer-
Paso3.php

http://www.academia.edu/24081726/Conteo_Camara_Neubauer

G. ¿Cual es la utilidad de la centrifugación en la separación de

cualquier tipo de célula?

Referencias.

[1] Lima, L. ESTRÉS OXIDATIVO Y ANTIOXIDANTES: Actualidades

Sobre Los Antioxidantes En Los Alimentos. Universidad de la Habana.
Publicado por Editorial Universitaria, 2002;1:1-3. [en línea]. Disponible
en:http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/mednat/estres_oxidativo_y_antio
xidantes.pdf. (Octubre de 2018)

Anexos
https://www2.palomar.edu/users/warmstrong/algae1.htm
http://www.elaguapotable.com/Algas%20hongos%20y%20protozoos.pdf