INTERACCIONES ANTIGENO ANTICUERPOS

APLICACIONES DIAGNOSTICAS (GENERACIONES DE ELISA, Y WESTERN BLOT)

NOTA

USO DE SUSTRATOS CROMOGENOS y ENZIMAS COMO: fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, B- galactosidasa

Los métodos más usados: indirecto, sándwich y competitivo

Producción de IgM ante una infección reciente, Ig g infección crónica

Hacia el año 83 que fue descubierto el virus de VIH, se

comenzaron a diseñar pruebas para saber quiénes estaban
expuestos al virus y la primera ´prueba que se genero fue el
ELISA en este caso de 1ra generación
PARA ENTENDER EL VIH
Esta es una curva de su paciente infectado por VIH el día 0, es
el día en que se infectó, pero es necesario que pase un tiempo
para que se pueda diagnosticar su presencia (curva del ARN
VIRAL) RECORDAR QUE UN VIRUS es material genético
rodeado por un material proteico que lo envuelve
Uno de los primeros en detectarse es el material viral, que se
está replicando. Luego aparecen algunas proteínas virales
aisladas. Imaginemos el virus y en el centro hay 2 cadenas de ARN. Y afuera están las proteínas que van hacer
contacto con la célula que va infectar: es decir que el vivíon es la estructura proteica que forma el virus. Algunas de
las proteínas que se expresan en la membrana son: p24 (se genera en gran cantidad, y se detecta en la sangre del
paciente en forma libre y tempranamente)
Poco después aparece la línea gris, es la línea de anticuerpos, y es aquí donde se pudiera utilizar ELISA, para detectar
pero antes el paciente ya está infectado, pero no se es capaz de detectar, puede estar incluso 1 mes infectado. En
principio se encontrar el isotipo de Ig M y a medida que avanza es de Ig G.

El método de ELISA es necesario para saber cuál es la estrategia que vamos usar para el diagnostico
ELISA DE 1RA GENERACION
Si quiero detectar anticuerpos, debo colocar ag, lo particular es
que en los primeros tiempos la fuente de ag eran lisados virales,
es decir producir ag del virus, y se tomaba un paciente
infectado, y en laboratorio infectar cel. In vitro como linfocitos
T cd4, y esas células infectadas comienzan a generar virus en
cantidad porque se replican. Es decir que rompí esa estructura,
rompí el virus y tome los antígenos, para buscar los anticuerpos

Zori Gonzalez 
 Si el paciente estaba infectado (línea gris)
Debería tener anticuerpos, y lo que se media era
Ig G que es de la etapa crónica, después se unían
a los ag, se hacía lavado, se colocaba el 2do
reactivo (un anti Ig g) porque estaba midiendo Ig
G de anticuerpo de VIH, se añade el sustrato
color, y si es activo nos da una reacción color
para verificar que si esta la infección
DETALLES
EL PROBLEMA,
Muchos pacientes que no estaban expuestos al
virus, sus resultados eran positivos. El problema en este momento era la ESPECIFICIDAD, porque algunos que no
estaban infectados, daban como positivos, el problema radica en la 1ra etapa que al hacer lisado viral allí estaban
ag del VIH, y también había residuos de antígenos de otros virus, por lo tanto el anticuerpo se iba a unir e iba a dar
color, quiere decir que estaba contaminado ese Ag,
CARACTERISTICAS
 Sensibilidad limitada (solo Ig G). Capta la infección cuando esta presente Ig G y no IgM
 Proteínas celulares que contaminaban el Antígeno , y generaban reactividad cruzada
 creaba un problema con personas que no estaban infectados

ELISA DE 2DA GENERACION

 NO UTILIZO LISADO VIRAL
 Se comenzó a generar pedacitos de virus ) ejemplo
gp120, p24, gp41, (elimino una serie de contaminantes)
 mejoro su especificidad ,se utiliza ag de VIH 1 y VIH 2
aumento la capacidad de detectar las 2 infecciones
 Disminuyen los falsos ´positivos
 Mejora la sensibilidad captaba cantidades más pequeñas
 Detectaba la información en etapas más tempranas

ELISA DE 3RA GENERACION

 Permitió Detectar y medir tanto IgM como Ig G, detectar cualquier isotopo de Ig, con alta sensibilidad
 Evaluar VIH 1 y VIH 2

Zori Gonzalez 
 Para eso fue necesario cambiar el 2do reactivo se dejó de usar anti Ig G,
usar un ag viral conjugado a una enzima para que un brazito del Ac
del paciente se uniera al ag y otro brazito se uniera al ag de la fase solida
del solida del foso.
EL PRICIPIO SIEMPRE ES EL MISMO PÉRO COMIENZAN A
CAPTARSE CON MEJOR DETALLE Y EVITAR FALSOS
POSOITVOS

Esta prueba es buena para la mayoría de los pacientes peor nos limita todavía en diagnósticos tempranos

Para mejorar aún más

Es posible reconocer la p24 es una proteína de indicio de VIH y que parece mucho antes que los Anticuerpos,
En este caso ella funciona como un antígeno, para que lo capte un anticuerpo)
 Se agregó en este caso un anti p24, y se tienen además todas las mejorías de las demás generaciones
 Y captamos este antígeno de etapa temprana(mucho más sensibilidad)
 Funciona como si fuera una hibridación o unión de ELISAS: Elisa indirecto capta anticuerpo más Elisa
tipo sándwich que capta antígeno
Podemos combinar para tener un mejor resultado,
Si había anticuerpos o antígenos p24 se iban asociar a los antígenos fijos en el foso o a los anticuerpos p24, 2
formas de captar la infección)
VENTAJAS
 VIH1-VIH2
 Antígeno p24
 Cualquier Ig, detección más temprana
CASO DE UNA MADRE
EMBRAZADA
INFECTADA CON VIH,
y se requiere saber si el niño
está infectado o no
Las de 4ta generación capta
Ig G; pero recordar que
través de la placenta, se pasa
al hijo este mismo isotipo de
Ig G, y si utilizo el ELISA
va a dar positivo, porque los
anticuerpos de la madre están en el niño, y no se puede discriminar para saber si el problema lo tiene el niño o son
los anticuerpos de la madre, QUE HACER EN ESTE CASO?
Zori Gonzalez 
LA estrategia es usar el ARN, porque es del virus, y si lo capto es porque está en el no, y este ARN no pasa atraves
de la placenta, en el caso de bebes infectados lo que medimos es el material genético viral mediante una prueba de
PCR (REACCION DE CADENA DE LA POLIMERASA) es decir que si capto este ARN el niño está infectado

WESTERN BLOT
Inmunoblot o electro transferencia, técnica analítica altamente específica utilizada para identificar proteínas
específicas en una mezcla compleja de proteínas, presente en extractos celulares o de tejidos.
Su uso inicial era para detectar en una mezcla de proteínas, si había una proteína específica que yo requiera su
detección
Ejemplo: Hay un tubo de ensayo con mezcla de proteínas, y quiero saber si hay IFNgamma:

Etapas:
1. Preparación de la muestra
2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel de
Poliacrilamida)
3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa)
4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso de Anticuerpos primarios o secundarios apropiados.

 Luego se somete a una electroforesis y se va ir separando en base al tamaño y carga de las proteínas , y debo
conocer la proteína que estoy buscando y migrara a un sitio determinado
 2da fase utilizar un anticuerpo anti IFN gamma,
El WESTERN BLOT requiere separar las proteínas y posteriormente se detecta con anticuerpos específicos
APLICACIÓN AL DIAGNOSTICO DE VIH
Como es una búsqueda de proteína determinada en una mezcla de proteínas, en este caso las del virus de VIH que
voy a separar y saber en qué parte están , se agrega al suero del paciente y pueden haber anticuerpos contra los
antígenos agregados , se marcan con positividad( ejemplo hay Anticuerpos contra p120)
COMPARACION DE ELISA CON WESTERN BLOT Ambos miden anticuerpos, y este también es
ESPECÍFICO
 Suponiendo en la 3ra generación de ELISA se puede decir que hay anticuerpos contra el VIH
 En el caso de Western Blot tiene Anticuerpos contra la p24 del VIH, contra gp120, pero no gp 41. Esta da
más detalles y Mayor discriminación
EN LAS 1RAS ETAPAS DE LA INFECCION SE DIAGNOSTICABA CON UN ELISA Y CONFIRMABA CON
WESTERN BLOT .Pero ELISA ya cumple con sus funciones y hay un de uso de Western Blot

UTILIZAR GUIA QUE DIJO EL PROFESOR: para saber los instrumentos que se utilizan,

APLICACIONES DE WESTERN BLOT

Se utiliza además que en aplicaciones de diagnóstico de VIH: Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina,
comúnmente llamada “enfermedad de las vacas locas”
Zori Gonzalez 
Es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular
 Permite identificar antígenos inmuno-dominantes para vacunas.
 Estudiar perfil de citocinas.
 Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra.
 Factores de crecimiento
 Niveles de fosforilación, modificaciones post-traduccionales, etc.
En la tira de WESTERN BLOT
Hay un Lado distintas proteínas que se colorean cuadro azul
proteínas del VIH y lado de control negativo cuadro rojo

Estas tiras son de un paciente seguido en el tiempo en el día 0 no hay

Anticuerpos
Hacia el día 2 anticuerpos contra la proteína p24 que se sigue
marcando hasta el final, gp 41 es débil.
Esto nos dice que gradualmente van apareciendo más anticuerpos
contras más antígenos

Zori Gonzalez 