INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Practica No. “Efecto del pH y la concentración de la

intensidad de fluorescencia de riboflavina”.

Grupo 5QM2
Sección 3

Autor: Suarez Gómez Alexis Gabriel

Profesor: QFP Carolina Acuña González

Ciclo escolar 2019

Ciudad de México, 26 de marzo del 2019

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Objetivos:
 Conocer el manejo de un fluorómetro de filtros.
 Conocer los factores fisicoquímicos que pueden abatir la fluorescencia.
 Determinar el efecto del pH del disolvente sobre la intensidad de fluorescencia.
 Determinar el efecto de la concentración de riboflavina en la intensidad de
fluoescencia.
Fundamento
La radiación electromagnética se origina cuando las partículas excitadas (átomos, iones o
moléculas) se relajan a niveles de menor energía cediendo su exceso de energía en forma
de fotones. La excitación puede producirse por diversos medios, tales como el bombardeo
con electrones u otras partículas elementales, que generalmente conduce a la emisión de
rayos X; la exposición a achispas de corriente alterna o al calor de una llama, un arco o un
horno, la cual produce radiación ultravioleta, visible o inflarroja; la irradiación con haz de
radiación electromagnética, que produce radiación fluorescente; una reacción química
exotérmica que produce quimioluminiscencia. La radiación emitida por una fuente excitada
se caracteriza adecuadamente por medio de un espectro de emisión, que generalmente
toma la forma de una representación gráfica de la potencia relativa de la radiación emitida
en función de la longitud de onda o de la frecuencia.
Entre los métodos de fotoluminiscencia. La fluorescenica y la fosforescenica son el
resultado de la absorción de la radiación electromagnética y la disipación de la energía
mediante la emisión de la radiación.
Resultados
Tabla1. Resultados de la curva de calibración de riboflavina en diferentes medios.
Riboflavina Intensidad de Intensidad de Intensidad de Intensidad de
(ppm) fluorescencia en fluorescencia en HCl fluorescencia en fluorescencia en
H20 0.1M CH3COOH 0.9M NaOH 0.1M
0 4.83 4.81 4.84 4.83
1 5.77 4.78 5.59 4.83
2 6.62 4.79 6.3 4.85
3 7.11 5.17 6.69 4.86
4 8.06 5.33 7.27 4.87
5 8.71 5.4 8.09 4.87
10 11.5 5.83 10.29 4.69
50 15.96 6.28 13.52 4.93
pH 5 1 3 13
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Figura 1. Resultados de la curva de calibración de la riboflavina en diferente medios.

10
9
Intensidad de fluorescenica (RFC)

8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6
Riboflavina (ppm)

Intensidad de fluorescencia en H20 Intensidad de fluorescencia en HCl 0.1M

Intensidad de fluorescencia en CH3COOH 0.9M Intencsidad de fluorescencia en NaOH 0.1M

Figura 2. Resultados de la curva de calibración de la riboflavina en diferente medios a una

concentración máxima de 5 de Riboflavina.

Preguntas adicionales.
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1. ¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima excitación y de

máxima emisión?

Es necesario conocer las longitudes de onda de máxima excitación y de máxima emisión

para poder llevar a cabo una determinación cuantitativa de un compuesto por fluorometría,
la longitud de onda de máxima excitación es el parámetro en el cual absorbe energía
radiante y la longitud de onda de máxima emisión es el parámetro al que emite la radiación
electromagnética.

2. Diga cuáles son las formas coenzimáticas de la riboflavina y cuál es su papel en el

metabolismo celular.

Las formas coenzimáticas de la riboflavina son el FMN y el FAD.

Flavin adenin dinucleótido (FAD). Es un coenzima transportador de electrones semejante

al NAD+, ahora bien, nunca como un transportador libre, de una proteína enzimática llamada
flavoproteína (FP). Así también de forma distinta al NAD+, el FAD acepta dos electrones y
dos iones hidrógeno en una típica reacción de óxido-reducción. La conversión de FAD a la
forma reducida FADH puede ocurrir en dos etapas, el FAD puede participar en la
transferencia de uno o dos electrones en las reacciones químicas en las que participa.

3. Estructura resonante de la riboflavina

Riboflavina a un pH ácido Riboflavina a pH 7 Riboflavina a un pH alcalino

4. Diferencias entre fluorescencia y fosforescencia.

Fluorescencia
Ocurre de manera más rápida, se
completa en 10-5segundos o menos a
partir del tiempo de excitación.
En las mediciones de fluorescencia, la
fuente excita el analito y provoca la emisión
de radiación característica, la cual se mide
generalmente de manera perpendicular al
rayo incidente que proviene de la fuente.
Fosforescencia
Ocurre de manera más lenta, se puede
extender durante minutos u horas
después.
Dado a su baja intensidad para aumentar
la eficiencia, la fosforescencia se realiza a
bajas temperaturas en medios rígidos,
como los vidrios.
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Las bandas de fluorescencia constan de La fosforescencia molecular ha sido

un gran número de líneas muy estrechas
entre sí. Ha sido usado para la determinar
la cantidad de aminoácidos, proteínas,
coenzimas, vitaminas, ácidos nucleicos,
alcaloides, porfirinas, esteroides,
flavonoides y muchos metabolitos.
utilizada para la determinación e una
variedad de especies orgánicas y
bioquímicas, en las que se incluyen ácidos
nucleicos, aminoácidos, pirina y pirimidina,
enzimas, hidrocarburos policíclicos y
pesticidas.

5. Aplicaciones de la fluorescencia

• La fluorescencia ha demostrado ser una herramienta valiosa en la identificación de

derrames de petróleo. La fuente de un derrame de petróleo se puede identificar
comparando el espectro de emisión de fluorescencia de la muestra del derrame con el de
la fuente sospechosa. La estructura vibracional de los hidrocarburos policíclicos presente
en el petróleo hace posible este tipo de identificación.

• Métodos de fluorescenica cuantitativos para determinar la cantidad de aminoácidos,

proteínas, coenzimas, vitaminas, ácidos nucleicos, alcaloides, porfirinas, esteroides,
flavonoides y muchos metabolitos.

• Debido a su sensibilidad, la fluorescencia se utiliza ampliamente como técnica de

detección para los métodos de cromatografía líquida.

Discusión.
Haciendo referencia a la fluorescencia cabe mencionar que es uno de los diversos
mecanismos por los que una molécula puede regresar al estado basal después de que ha
sido excitada por absorción de radiación, entre los factores que pueden abatir dicho
mecanismo son el pH, la concentración del analito, presencia de la luz visible y la
temperatura, entre los cuales se evaluó el pH, con respecto a la figura 1 y 2 de la curva de
calibración de la riboflavina en diferente medios: agua, ácido acético, HCl y NaOH, cabe
mencionar que el agua en función al cambio de la concentración de la riboflavina y de las
lecturas de intensidad de fluorescencia expresada en unidades de fluorescencia resonante
(RFU), mantiene la proporcionalidad cumpliendo la ley de Bouguer y Beer, dado a que la
radiación emitida es proporcional a la concentración del analito. Con respecto al medio en
ácido acético igualmente se cumple con dicha proporcionalidad aunque en menor medida
en comparación con el agua.
Con respecto al ácido clorhidrico posiblemente a mayores concentraciones se llegara a
cumplir dicha proporcionalidad dado a la tendencia del gráfico, mientras que a medio
alcalino se pierde completamente la proporciolnalidad, teniendo baja fluorescencia, entre
las causas de una baja fluorescencia se atribuye al pH parámetro que se varió, por ejemplo
a pH ácido la fluorescencia baja dado a que los grupos amino se protonan perdiendo
resonancia en la molécula, por ello a pH 7 (H2O) hay mayor RFU, dado a que en la molécula
ocurren mayor número de resonancias por su conjugación. Sin embargo a pH alcalino no
hay fluorescencia, dado a que la molécula se desprotona, llegandose a romper perdiendo
la capacidad de poder llegar a emitir la radiación electromagnética que se le hacía incidir.
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Conclusión.

 A pH neutro se da el máximo de fluorescencia.

 La riboflavina manifestando resistencia a ácidos débiles, pero ya no en ácidos
fuertes.

Referencia bibliográfica

 José María Tijón Rivera, Rosa Olmo López, Amando Garrido Pertierra, César
Teijón López, María Dolores Blanco Gaitán. Bioquímica estructural. 2ª ed. Madrid:
Editorial TÉBAR; c2009. 35pp.
 Douglas A. Skoog, Donal M. West, F. James Holles, Stanley R. Crouch. Química
analítica. 9a ed. México: CENGAGE Learning; c2015. Pp. 762-769

Plagio.