Guia de Practicas de Microbiologia 2019 1

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
DEPARTAMENTO ACADÉMICO
DE CIENCIAS BÁSICAS
GUÍA DE PRÁCTICAS
DE
MICROBIOLOGÍA
SEGUNDO AÑO
PRIMER SEMESTRE ACADÉMICO
2019 - I
CHICLAYO - PERÚ
1
Introducción
El Manual de Prácticas de Microbiología tiene como objetivo orientar a los alumnos a un

mejor conocimiento y aplicación de los procedimientos de identificación y aislamiento de la
variada flora microbiana de importancia en medicina humana. La microbiología es una
disciplina que estudia la biología de los microorganismos capaces de producir enfermedad.
Desde que se describiera por primera vez la morfología de las bacterias (Leeuwenhoek
.Siglo XVII), luego el aislamiento y diagnóstico de distintos microorganismos sobre todo en las
dos últimas décadas del Siglo pasado en la que se inicia la denominada “Época dorada de la
bacteriología” , ésta ha evolucionado tremendamente. Continuamente se describen procesos
infecciosos así como situaciones nuevas en los pacientes motivando ello la disponibilidad de
información científica relacionada con la microbiología clínica y la infectología.
Los avances tecnológicos con aumento de la automatización, el desarrollo de la biología

molecular, la química de los ácidos nucleicos, los avances en inmunología clínica y los
conocimientos de la patogenicidad microbiana hacen necesario la revisión continua de los
textos de microbiología.
Tenemos el convencimiento que ésta orientación académica proporcionará a los alumnos

de la Asignatura de Microbiología los recursos para preveer el inicio del padecimiento , así
como la base para la orientación terapéutica y la prevención de las enfermedades infecciosas.
Se da una relación concisa de los métodos de laboratorio empleados en el estudio de las

bacterias, hongos, rickettsias y virus. Con tal motivo serán expuestos conceptos y ejercicios
fundamentales, con lo que esperamos uniformar criterios acorde con la actualizada tecnología.
Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodológicamente a fin de facilitar la

aplicación de los conceptos básicos y así llegar al diagnóstico de los diferentes procesos
infecciosos en humanos.
El objetivo de estas prácticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las técnicas
más comúnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiología y permitir la observación
experimental de los conceptos aprendidos durante las clases teóricas.
Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prácticas , no es una compilación

amplia del tema, sino un Manual que contiene los requerimientos básicos y orientación,
adecuando los recursos y procedimientos que contribuirán a cimentar la formación integral del
médico humano.
Como docentes, nos sentiremos satisfechos si al final del curso se han cumplido los
objetivos, utilizando los elementos y procedimientos de diagnóstico en el proceso enseñanza –
aprendizaje.
2
Generalidades
El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difícil, debido al tamaño

que presentan, siendo éste entre 1 y 6 micras. Para su observación se requiere el empleo del
microscopio de luz , el cual , no proporciona el suficiente poder de resolución que permite
observar las diferentes estructuras de las bacterias lo que hace necesario el uso del
microscopio electrónico.
Para la observación y estudio de las bacterias se utilizan diversos métodos. El más simple
de ellos consiste en la observación en fresco, de esta manera se visualizan características
someras que proporcionan una idea del tamaño, forma y en ciertas especies la movilidad;
estos aspectos pueden mejorarse con el empleo del microscopio de contraste de fase.
Otra tecnología que permite observar con mayor claridad a las bacterias, lo constituyen los
métodos tintoriales , que facilitan el estudio de la forma , agrupamiento, y afinidad a diversos
colorantes. Entre las técnicas de mayor utilidad destaca la tinción de Gram, la cual permite
clasificar a las bacterias según su afinidad tintorial en Gram positivas y Gram negativas.
Existen grupos bacterianos que para su observación requieren otras técnicas como la de
Ziehl-Neelsen, la cual identifica a las bacterias ácido-alcohol resistente. Algunas bacterias
poseen ciertas estructuras importantes que pueden ser evidenciadas mediante técnicas de
coloración especial como por ejemplo, para observar cápsula, esporas, flagelos .
Para realizar el diagnóstico de hongos y virus existen técnicas particulares, las mismas
que serán descritas en los capítulos correspondientes.
3
CRONOGRAMA DE PRÁCTICAS
SEMANA FECHA TEMA

Práctica de Laboratorio Nº 1:
1ra 05 Marzo
Bioseguridad Practica
2da 12 Marzo
Obtención y manejo de muestras clínicas
3ra 19 Marzo Preparación, fijación y coloraciones bacterianas (coloración simple y
coloración diferencial: Gram y Ziehl Neelsen )
4ta 26 Marzo Medios de Cultivo, Métodos de siembra y aislamiento bacteriano
5ta 2 abril
Pruebas bioquímicas para bacterias grampositivas
6ta 9 abril
Actividad antimicrobiana in vitro: Antibiograma
7ma 16 abril
Pruebas bioquímicas para bacterias gramnegativas (enterobacterias)
Práctica de Laboratorio Nº 8: Identificación y aislamiento de
Mycobaterium.
8va 23 abril
Coloración de Ziehl- Neelsen y Aislamiento de Bacterias Anaerobias
9na 30 abril SEMANA DE EXAMENES PARCIALES
Práctica de Laboratorio Nº9:

10ma 7 mayo
Cultivo de muestras clínicas: Urocultivo, Coprocultivo
Práctica de Laboratorio N°10:
11va 14 Mayo Técnicas de diagnóstico micológico: Diagnóstico de micosis
superficiales y cutáneas.
.
Práctica de Laboratorio N° 11:
12va 21 Mayo Técnicas de diagnóstico micológico: Diagnóstico de micosis
subcutáneas, sistémicas y oportunistas.
Práctica de Laboratorio N° 12A:
13va 28 Mayo Diagnóstico virológico
Práctica de Laboratorio N° 12B:
14va 4 Junio
Diagnóstico virológico
15 va 11 Junio DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO- REPASO GENERAL
4
PRÁCTICA Nº 1
Normas de Bioseguridad
Disposiciones Generales
En general en todo laboratorio deben seguirse normas que garanticen la calidad de las
técnicas y asimismo, la seguridad en el trabajo. En el caso particular del Laboratorio de
Microbiología donde se trabaja con materiales susceptibles de contaminación accidental, se
recomienda la adopción rigurosa de normas de seguridad e higiene a fin de evitar el riesgo de
infección de las personas que en él laboran.
Con tal motivo, en el Laboratorio de Microbiología se consideran cuatro niveles de seguridad

biológica, según los microorganismos con los que se trabaja :
▪ Nivel 1 : Microorganismos no patógenos y patógenos oportunistas

▪ Nivel 2 : Microorganismos o muestras con un potencial de riesgo moderado
▪ Nivel 3 : Microorganismos y muestras de alto riesgo; los trabajos se realizan en cabinas de
seguridad , nunca en las mesas.
▪ Nivel 4 : Microorganismos de altísimo riesgo , solo se hacen en laboratorios de
experimentación y no en laboratorios de microbiología clínica . Se requiere este nivel cuando
se maneja microorganismos de riesgo, especialmente virus, también con algunas bacterias y
hongos.
De toda forma durante las prácticas se deben cumplir las siguientes recomendaciones :
1. Los alumnos ingresarán a la Sala de Prácticas solamente con el uniforme obligatorio y el

mandil . No está permitido el ingreso con otras prendas de vestir o cualquier otro objeto
diferente al material asignado para el ejercicio.
2. Observar en todo momento las medidas de asepsia con el material de trabajo . Los
profesores de cada grupo les indicarán la metodología a seguir.
3. Está prohibido comer, beber y/o fumar durante las clases prácticas, así como llevarse los
dedos , el lápiz o cualquier otro objeto a las proximidades de la boca y ojos.
4.La evaluación de los alumnos de las asignaturas correspondientes al Departamento de

Ciencias Básicas se regirá según el Reglamento de Evaluación de Estudiantes de Pregrado ,
Período Lectivo 2013.
5. Por razones de seguridad, ningún material de prácticas saldrá de la sala de trabajo. En

caso que se rompa algún material de vidrio con cultivo microbiano , avisar de inmediato al
profesor para que disponga la inmediata desinfección y limpieza.
6. Uno de los instrumentos de trabajo , el asa o mango de Kolle , terminado el ejercicio

programado deberá ser esterilizado mediante flameado , de acuerdo con las instrucciones
dadas por el profesor.
7. Todo material de trabajo como son: láminas portaobjetos, laminillas o pipetas, deberán ser
depositadas en los bocales de vidrio con solución desinfectante, los que estarán a la vista en
cada mesa. Si fuera material de desecho , como restos de algodón , papel, etc. , depositarlos
en los recipientes para la basura, nunca en la mesa de trabajo o en el suelo . Los tubos,
placas de Petri o frascos de cultivo se dejarán en canastillas o depósitos destinados para ser
esterilizados.
5
8. Los profesores estarán en todo momento atentos para orientar y/o resolver cualquier duda
que se presente en el desarrollo de las prácticas.
9. Cada alumno debe disponer obligatoriamente del Manual de Prácticas, el que deberá ser
estudiado con anterioridad a cada ejercicio, de forma tal que tenga conocimiento previo de los
ejercicios que se van a presentar.
6
Material y Equipo básico en las prácticas de Microbiología
En el campo de la microbiología médica se requieren de conocimientos básicos,

indispensables para facilitar el estudio de los diferentes microorganismos ; por tal motivo es
necesario que el alumno se familiarice desde el principio con el material y equipos empleados
en el aislamiento e identificación de los microorganismos
(bacterias, hongos y virus) . Ellos deben ser debidamente preparados y posteriormente
esterilizados para asegurar que los ejercicios reúnan los requisitos exigidos para el trabajo
microbiológico. A continuación se describen algunos de ellos:
▪ Asa y aguja de siembra : Muy usada en la práctica microbiológica, hecha de alambre de

platino o de otro material , se inserta en un mango que facilita su manejo. El alambre puede
ser recto o terminar en forma de pequeño anillo.
▪ Autoclave : Aparato para esterilización por vapor bajo presión , provisto de manómetro y una
llave que regula la presión y la temperatura a la que desea esterilizar.
▪ Cabina de Flujo laminar : Equipo que proporciona área estéril , para los trabajos
microbiológicos, en especial en cultivos , evitando la interferencia de los microorganismos de
contaminación ambiental.
▪ Centrífuga : Aparato diseñado para acelerar la separación de partículas sólidas suspendidas

en líquidos.
▪ Contador de colonias : Sirve para contar electrónicamente y de forma exacta las colonias de
microorganismos.
▪ Crioviales : Pequeños tubos cónicos de polipropileno resistentes a muy bajas temperatura

(- 4ºC). Usados para guardar muestras en la congeladora. Ejemplo: suero, cepas virales.
▪ Estufa : Aparato de dimensiones diversas , donde se incuban los cultivos, generalmente a

37ºC.
▪ Filtros esterilizantes : Para dejar libre de contenido microbiano a productos en estado líquido,
los que por su naturaleza no pueden ser sometidos a la acción del calor en sus diferentes
modalidades.
▪ Gradilla : Soporte para tubos de ensayo.
▪ Jarra de anaerobiosis : Instrumento útil para el aislamiento de bacterias anaerobias ya que

permite un cierre hermético no dejando ingresar oxígeno.
▪ Lámina portaobjetos : Lámina de vidrio que se utiliza para preparar frotis bacterianos.
▪ Matraces y balones : Recipientes volumétricos de gran utilidad para la preparación y

almacenamiento de soluciones, colorantes , reactivos , medios de cultivo , etc. Los balones se
diferencian de los matraces por tener una base esférica con fondo plano. En ambos los cuellos
terminan en un discreto reborde lo que les confiere resistencia.
▪ Mechero de Bunsen : Mechero de gas , en el que éste se mezcla con aire antes de producir
la flama. Se utiliza para esterilizar el asa de siembra.
▪ Medios de cultivo : Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de microorganismos

.En su composición se incluye un número balanceado de nutrientes y un determinado volumen
7
de agua. De acuerdo con su consistencia pueden ser líquidos, semisólidos y sólidos. Se
presentan en forma deshidratada.
▪ Microscopio : Instrumento óptico utilizado para la observación de microorganismos que no

son visibles a simple vista.
▪ Pipetas : Son tubos cilíndricos de diversos materiales, pueden ser graduadas y sirven para
medir volumen conocido de líquido. Otras no son graduadas y se utilizan para la transferencia
de líquidos.
▪ Pipetas Pasteur : Varillas de vidrio de 4 mm de diámetro y de 20 a30 cm de longitud. Se les

emplea para la toma de pequeños inóculos de siembra.
▪ Pipeteadoresautomáticos : Pipetas que absorben de forma automática sin necesidad de uno

aspirar, pequeños volúmenes (1µl a 1 000 µl ) de muestras.
▪ Placa de Petri : recipiente de vidrio o plástico que , en general se usa para contener medio
de cultivo y proporciona una suficiente área para el crecimiento bacteriano.
Autoclave Cabina de Flujo laminar
8
PRÁCTICA Nº 2
OBTENCIÓN Y MANEJO DE MUESTRAS CLÍNICAS
OBJETIVOS
▪ Realizar los procedimientos adecuados para asegurar las medidas de bioseguridad

apropiadas.
▪ Conocer las técnicas de toma de muestra y manejo de las diferentes muestras clínicas para
su óptimo procesamiento.
▪ Conocer las precauciones para el manejo y transporte de muestras clínicas.
INTRODUCCIÓN
En términos de la efectividad del Laboratorio de Microbiología , nada es más importante que la

apropiada selección , colección y transporte de las muestras clínicas. Estos procedimientos
quedan inutilizados muchas veces por falta de cuidado y métodos defectuosos usados en la
recolección y manejo de las muestras.
Independientemente del hecho que algunos tipos de muestras requieren metodología de
recolección muy especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben ser
tenidos en cuenta al coleccionar las muestras clínicas :
▪ La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.
▪ Cuando se va a proceder a tomar un espécimen clínico, es importante evitar la

contaminación con microorganismos saprofitos del área. Esta flora normal puede interferir con
la interpretación del cultivo y enmascarar la presencia del verdadero agente etiológico de la
enfermedad.
▪ Seleccionar el lugar anatómico correcto de donde se obtendrá el espécimen y utilizar la

técnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtención .
Especialmente en el caso de investigar microorganismos anaerobios.
▪ Nunca refrigerar una muestra por anaerobios.
▪ Coleccionar un apropiado volumen de la muestra.

Insuficiente material puede ser causa de resultados falsos negativos.
▪ Junto con la muestra se debe enviar una solicitud de análisis en la que debe figurar el
nombre del paciente, número de identificación personal, procedencia, tipo de muestra, fecha y
hora de colección, especificar región anatómica, diagnóstico clínico, duración de la
enfermedad, terapia antibiótica , prueba requerida e iniciales del funcionario que tomó la
muestra.
▪ El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su grado de

instrucción sobre los procedimientos a realizar.
▪ Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibióticos o agentes antimicrobianos.

Si se han administrado, informar de ello al laboratorio. A menudo un líquido cefalorraquídeo no
revela patógenos bacterianos en frotis ni cultivo, cuando se ha tomado un antibiótico en las 24
horas anteriores.
▪ Colocar la muestra en un recipiente estéril y adecuado para su transporte como cajas,

gradillas, bandejas, llevando en la base papel absorbente embebido en desinfectante , con el
fin de asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del espécimen y
mantener medidas de bioseguridad apropiadas.
9
▪ Ordenar siempre un frotis para tinción o coloración de Gram, para los especímenes que
procedan de cavidades asépticas y anotar su interés en determinado microorganismo.
CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA
▪ Hoja de solicitud de análisis no llenada correctamente

▪ Muestras sin rotular o inadecuadamente rotuladas
▪ Muestras sin medios de transporte adecuado, en contenedores quebrados, rotos o
con derrames
▪ Muestras secas o con contaminación obvia
▪ Muestras sin preservación adecuada
Las muestras más frecuentes en los estudios microbiológicos son :
■ ORINA :
En las muestras de orina se pueden realizar diferentes análisis como : examen microscópico
de orina, urocultivo, determinación de algunos residuos de medicamento (doping) e
investigación de microorganismos especiales como Leptospira. El éxito de estos exámenes
dependerá de la técnica con que se tome la muestra y sobre todo del tiempo transcurrido entre
la toma de la muestra y el análisis, ya que el proceso de descomposición que se sucede en la
orina por acción de las bacterias allí presentes , modifica el parámetro de los componentes y
muy especialmente altera la carga microbiana.
Procedimiento
▪ Lavarse las manos

▪ Las pacientes mujeres deben realizar previamente el lavado de los genitales externos con
agua y jabón y de adelante hacia atrás, mientras que los hombres solo lo realizarán en el caso
de solicitarse cultivos.
▪ Secarse con un apósito estéril
▪ Las muestras deben colocarse en un frasco de boca ancha y tapa de rosca estériles,
depositar aproximadamente entre 30 y 40 ml de preferencia la primera muestra de la mañana
a través del chorro medio (miccionar una buena cantidad en el inodoro y luego en el envase).
▪ En mujeres la micción debe ser separando los labios mayores de la vulva.
En hombres se hace la retracción del prepucio de manera que el chorro de orina salga
directamente .
▪ Tapar el frasco con precaución , evitando contaminar la muestra y/o derramarla.
▪ En casos de niños pequeños utilizar bolsas colectoras adheridas a los genitales.
▪ La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio. En caso de no ser posible
refrigerarla no más de 4 horas.
■ HECES :
Las muestras de heces se solicitan para examen bacteriológico, virológico, bioquímico y para
la búsqueda de parásitos.
Las muestras de heces de un paciente sospechoso de enfermedades diarreicas deben
colectarse antes de la administración de cualquier antibiótico.
10
Procedimiento
▪ Muestra evacuada : La persona debe defecar en un recipiente limpio y seco, teniendo

cuidado de no miccionar para que ésta no se mezcle con orina.
▪ Hisopado rectal : La muestra se obtiene con un hisopo de algodón estéril , el cual se
desenvuelve y se lubrica antes de su uso, introduciéndolo en el medio de transporte , de
preferencia Cary Blair, y luego se introduce en el recto , unos 3 cm, mediante movimientos de
rotación.
El hisopo con la muestra se introduce hasta el fondo del tubo que contiene el medio de
transporte (Cary Blair o Amies).
El frasco con la muestra o tubo con el medio de transporte se pueden conservar a temperatura
ambiente hasta su procesamiento o envío al laboratorio, no más de 12 horas.
No se debe refrigerar la muestra.
■ HEMOCULTIVO:
La sangre de los individuos sanos es estéril. Una presencia repentina de bacterias

habitualmente es eliminada del torrente circulatorio en un período de tiempo corto de minutos
a horas, excepto cuando existe una infección masiva o está presente un foco intravascular
infectado. Básicamente cuando las bacterias se multiplican a tasas que exceden el sistema
retículoendotelial para eliminarlas , se habla de BACTERIEMIA. El término FUNGEMIA se
utiliza para designar la presencia de hogos en sangre.
Siempre que exista una razón para sospechar de una bacteriemia se debe practicar el cultivo
de la sangre o hemocultivo.
Procedimiento
▪ Los hemocultivos se obtendrán antes de iniciar la terapia antibiótica, el incumplimiento de

este punto puede dar lugar a resultados falsamente negativos, pudiendo comprometer la vida
del paciente.
▪ Los microorganismos de la piel pueden contaminar la sangre durante la extracción,
dificultando la interpretación de los resultados. Además algunos contaminantes actúan como
patógenos oportunistas , por lo que se debe ser muy cuidadoso durante la extracción.
▪ La toma debe realizarse por venopunción y para ello debe hacerse :
• Lavado de manos y utilización de guantes estériles
• Limpiar con jabón líquido o alcohol el lugar de la punción
• Aplicar durante un minuto povidona yodada, dejar secar
• Desinfectar los tapones de los frascos
• Efectuar la extracción
• No airear los frascos
• Nunca debe hacerse la extracción a través de catéteres , salvo en aquellas
circunstancias en que se indica específicamente.
• Cuando la extracción se realice con adaptador , se debe esterilizar o ser de un sólo
uso.
■ MUESTRAS FARINGEAS Y AMIGDALARES :
Más del 70 % de procesos están ocasionados por virus : rinovirus , coronavirus,

adenovirus(3,4,7,14,21), parainfluenza, virus de la gripe, virus coxsakie A y otros enterovirus,
virus Epstein-Barr y virus herpes simple tipo I
11
Entre el 10 y 20 % de casos de faringitis agudas en niños de 5 a 10 años, están ocasionados
por Streptoccoccuspyogenes. Otras bacterias patógenas son :Streptococcusgrupos C o G,
Corynebacteriumdiphteriae, Neisseriagonorrhoeae, Haemophilusinfluenzae .
Procedimiento
▪ Las muestras de exudado faringo-amigdalar se obtienen con la ayuda de un depresor lingual,

tocando con la torunda todas las partes con exudados, membranas o zonas de inflamación. Se
deben frotar las criptas tonsilares y la faringe posterior.
▪ No se requieren medidas especiales para su transporte y conservación.
▪ La toma de muestra de la epiglotitis , debido al riesgo de complicaciones, se hace por un
especialista en las condiciones adecuadas.
▪ Es recomendable realizar hemocultivos.
■ MUESTRAS NASALES :
Procedimiento
La muestra se obtiene introduciendo una torunda para cultivo, previamente embebida en suero
fisiológico estéril, unos 2 cm en la nariz y girando suavemente contra la mucosa de la
superficie nasal.
■ CATÉTERES :
El estudio bacteriológico de los catéteres , nos va a permitir en ocasiones conocer el agente

causal de una bacteriemia relacionada con el catéter y prevenir que aparezca dicha
bacteriemia. Para valorar su importancia podemos decir que de una u otra forma el 82 % de
las bacteriemias nosocomiales se relacionan con la presencia de catéteres.
Vías de infección : a. Piel y catéter : en los catéteres periféricos y de corta duración
b. Endoluminal : en las vías centrales tunelizadas.
Procedimiento
▪ Desinfectar con alcohol al 70 % una zona de la piel de unos 10 cm correspondientes

a la zona de entrada del catéter
▪ Retirar el catéter con la máxima asepsia, con la ayuda de pinzas y tijeras estériles,
cortar los 5 cm distales del catéter que corresponde a la porción intravascular.
▪ Introducir el segmento del catéter en un recipiente estéril correctamente identificado
▪ La muestra debe ser enviada al laboratorio en un período de tiempo menor de 30
minutos. Cuando no sea posible deberá ser guardada en refrigeración a 4º C
■ LÍQUIDOS ESTÉRILES :
El fundamento es la búsqueda de agentes patógenos u oportunistas, que pueden estar

presentes en los líquidos o fluidos orgánicos . En este grupo incluimos líquidos producidos , ya
sea de forma espontánea o bien provocada a nivel de las serosas, en las que habitualmente
no existen microorganismos y son presumiblemente estériles. Su buen manejo presenta un
triple interés por :
• La trascendencia de esta patología por su elevada morbilidad o mortalidad
• Dificultad de diferenciar patógenos y oportunistas como consecuencia de cuidados
terapéuticos instaurados o prótesis aplicadas previamente.
• Posibilidad de contaminación exógena, sea en la obtención o en su manipulación,
siendo por ello muy importante extremar las medidas de asepsia, de recogida y
procesamiento.
12
Muestras
• Líquido ascítico o peritoneal
• Líquido articular o sinovial
• Líquido pericárdico
• Líquido pleural
Procedimiento
▪ La obtención de estos líquidos es un procedimiento médico

▪ La toma se realiza por punción percutánea (toracocentesis, paracentesis, punción
pericárdica o punción articular)
▪ Para el estudio bacteriano se requerirá de 1 a 10 ml; para líquido de diálisis
peritoneal se requerirá de un volumen superior a 100 ml.
▪ Para evitar la coagulación de algunos líquidos se utilizará heparina sin
conservantes, ya que otros anticoagulantes podrían tener acción antibacteriana.
▪ Los recipientes idóneos son los viales de transporte para anaerobios
▪ Los frascos de hemocultivo también son útiles para cultivar líquidos biológicos
estériles. Si se sospecha de anaerobios colocar la muestra luego de ser extraída en
un frasco para anaerobios.
■ LÍQUIDO CÉFALORRAQUIDEO (LCR)

La meningitis es un proceso inflamatorio del Sistema Nervioso Central, que afecta a las
leptomeninges y al líquido cefalorraquídeo . Se trata de una urgencia médica y requiere un
diagnóstico y tratamiento precoz . Su morbimortalidad , en meningitis agudas bacterianas , se
relaciona directamente con el retraso en el inicio de la terapéutica.
Los casos esporádicos de meningitis agudas bacterianas , se relacionan directamente con el
retraso en el inicio de la terapéutica, aparecen en edades extremas de la vida, ocurriendo el 75
% de los casos en menores de 1 año.
Muestra
▪ La toma de la muestra la realiza el médico tratante o el patólogo clínico del

laboratorio.
▪ Se obtendrá antes de instaurar cualquier terapia antimicrobiana , siempre que las
condiciones lo permitan.
▪ LCR se obtiene por punción lumbar
▪ Generalmente se obtendrán dos tubos, el primero se enviará para el estudio
bioquímico, el segundo para el estudio microbiológico con el mayor volumen
posible.
▪ El tubo más turbio se enviará a Microbiología.
▪ Se debe solicitar simultáneamente hemocultivos, porque las meninges suelen ir
acompañadas de un proceso bacteriémico
▪ El volumen mínimo para el estudio bacteriológico rutinario es 1 ml, aunque es
preferible disponer de volúmenes superiores. Para hongos o micobacterias se
necesitarán al menos 2 ml adicionales por cada uno de los estudios, siendo deseable
llegar a los 10 ml.
▪ La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues algunos agentes
etiológicos como Streptococcuspneumoniae pueden lisarse rápidamente a partir de
la primera hora de su recogida
▪ Si no fuera posible se mantendrá en estufa entre 35 a37ºC y una parte se incubará
en frasco de hemocultivo, que se mantendrá en idénticas condiciones.
▪ Si no se dispone de estufa se mantendrá a temperatura ambiente. Nunca se
refrigerará pues se afectará la viabilidad de Neisseriameningitidis y H. influenzae.
13
Procesamiento del líquido cefalorraquídeo
▪ Centrifugar a 1 500 hasta 3 000 revoluciones durante 15 a 20 minutos.

En caso de líquidos muy purulentos no será necesario centrifugar.
▪ Recoger el sobrenadante con pipeta de Pasteur estéril y conservarlo a 4ºC en
refrigeración.
▪ Sembrar el sedimento con pipeta de Pasteur en : agar Sangre a 35 - 37ºC, atmósfera
de CO2 ,agar Chocolate a 35 - 37ºC atmósfera de CO2 ,caldoTioglicolato o caldo
Infusión Cerebro Corazón BHI a 35 - 37ºC por 72 horas.
▪ Se realizarán tres extensiones para tinción : tinción de Gram, Azul de metileno,
Wright.
■ EXTRACCIÓN DE SANGRE PERIFÉRICA :
1. Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesitará para ejecutar la
obtención de la muestra.
2. Lavarse las manos previamente a la extracción de la sangre y si es preciso
colocarse guantes.
3. El paciente deberá sentarse cómodamente de manera que el brazo quede colocado
paralelamente a la mesa de trabajo , donde se realizará la extracción se sangre.
4. Apoyar el brazo del paciente sobre un pequeño cojín bajo el codo. Con la palma de
la mano hacia arriba.
5. Con la mano izquierda tirar del extremo de la ligadura, cruzándolo y a
continuación introducir este extremo por debajo de la parte principal de la ligadura
aproximadamente dos dedos por encima de la flexión del codo. Ésta se deberá
ajustar solo lo suficiente para aminorar la corriente sanguínea y dilatar la vena ,
sin apretar tanto que reduzca el paso de la sangre por las arterias.
6. Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la
dilatación de las venas.
7. Con el dedo índice de la mano izquierda palpar la vena en la que se introducirá la
aguja.
8. Desinfectar la zona de la piel donde se realizará la punción con un pedazo de
algodón embebido en alcohol yodado.
9. Tomar la jeringa con la mano derecha, colocar la yema del dedo índice sobre la
base de la aguja.
10. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba, introducir la aguja en el
centro de la vena sin titubeos., de 1 a1,5 cm aproximadamente.
11. Luego de extraer la sangre por punción venosa, retirar la aguja de la jeringa y
colocarla en un depósito de metal ( para autoclavar o incinerar); verter lentamente
la sangre en un tubo o en el caldo de cultivo.
14
PRÁCTICA Nº 3
COLORACIONES BACTERIANAS SIMPLES
OBJETIVOS
▪ Explicar la coloración Azul de metileno.

▪ Identificar la diferencia entre coloración simple y coloración diferencial
INTRODUCCIÓN
Debido al pequeño tamaño de los microorganismos , se requiere de un microscopio óptico, ya

sea de campo claro (lo más usado) o de campo oscuro, para hacer la descripción morfológica
de estos. La observación de los frotis teñidos es lo más recomendable. El frotis se prepara
haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual
se fijan y se tiñen los microorganismos.
Las coloraciones son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la

capacidad de los mismos para retener (o no), determinadas sustancias colorantes, lo que
depende de la carga de la célula y del colorante. Estos colorantes pueden ser de distintos tipos:
▪ Catiónicos : sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las
células y las tiñen. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.
▪ Aniónicos : Con carga negativa, no penetran en el interior de la célula, de modo que
no tiñen las células sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa.
Ejemplos: Eosina, Nigrosina.
▪ Liposolubles: se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: Negro sudán.
Los colorantes aumentan el contraste combinándose químicamente con el protoplasma

microbiano y permiten localizar estructuras específicas del microorganismo y diferenciarlos en
su forma, tamaño, agrupación y afinidad a ciertos colorantes . Las bacterias pueden presentar
las siguientes formas esféricas (cocos), estos a su vez disponerse en cadenas (estreptococos)
, en pares (diplococos), o en racimos (estafilococos), sarcinas, en forma alargadas cilíndricas
(bacilos) y espirales (espiroquetas y espirilos).
De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar
diferentes tipos de tinciones como son :
▪ Simples : Utiliza un sólo colorante. Las células presentan una composición química
diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma distinta
frente a un colorante . El colorante tiñe las células como en el caso de : Azul de
metileno, Safranina o no la tiñe : Nigrosina.
▪ Diferenciales : Los diferentes tipos de células presentan distinta composición
química y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que
permite clasificar a los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de
tinción. Ejemplos: tinción de Gram y Ziehl-Neelsen, ambas utilizan más de un
colorante.
▪ Selectivas: Distintas estructuras celulares tienen diferente composición química de
modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ejemplos: tinción de
esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden
utilizar uno o más colorantes.
15
■ COLORACIÓN AZUL DE METILENO
Es una coloración simple que permite observar presencia o ausencia de microorganismos y

distinguir algunas formas bacterianas : cocos, bacilos , espirilos.
Se utiliza el Azul de metileno, el cual se agrega sobre la extensión por un minuto , luego del cual
se enjuaga , se deja secar a temperatura ambiente y se observa al microscopio con la lente de
mayor aumento.
MATERIALES
▪ Guantes
▪ Hisopos estériles
▪ Láminas portaobjetos
▪ Mechero de alcohol
▪ Jeringa de 10 cc
▪ Algodón y alcohol yodado
▪ Ligadura
METODOLOGÍA
■ HISOPADO FARÍNGEO
1. El profesor, con la colaboración de un alumno, enseñará a tomar una muestra de

exudado faríngeo. El paciente ( en este caso el alumno), se sentará cómodamente
de frente al profesor , el área debe tener buena iluminación para que permita
visualizar adecuadamente el sitio anatómico a examinar.
2. Indicar abrir la boca y con ayuda del bajalengua deprimir la lengua para favorecer
que la faringe quede expuesta, con un hisopo estéril frotar firmemente la pared
posterior de la faringe y las amígdalas, particularmente en donde existan puntos
blancos o áreas que presenten signos de inflamación o sangrado.
3. Cuando el paciente no tenga amígdalas, la muestra se obtendrá del fondo de las
fosas amigdalinas. Al retirar el hisopo tener la precaución de no hacer contacto con
ninguna otra área de la boca.
4. A partir de la muestra tomada, se realizará la siembra por el método de
aislamiento en estría en placa, se utilizarán placas de agar sangre , agar chocolate
y agar manitol salado.
5. Antes de eliminar el hisopo , realizar una extensión para preparar un frotis, fijar la
muestra y teñir con una tinción simple (Azul de metileno) para observar :
• Morfología de la bacteria
• Agregación o tipo de distribución bacteriana.
16
RESULTADOS
■ Frotis de hisopado faríngeo :
Hisopo
Lámina
portaobjetos
Aislamiento en estría
■ Coloración simple : Azul de Metileno
• Cubrir el frotis con colorante Azul de metileno por un minuto

• Lavar con agua corriente
• Dejar secar a temperatura ambiente
1. Cubrir con Azul 2. Lavar con agua

de metileno
Graficar lo observado al microscopio
17
COLORACIONES BACTERIANAS COMPUESTAS
COLORACIÓN DE GRAM
OBJETIVOS
▪ Explicar el fundamento de la coloración de Gram.

▪ Ejecutar la técnica de coloración más usada en bacteriología : coloración de Gram.
▪ Establecer la diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
INTRODUCCIÓN
Descrita por Christian Gram en 1884, permitiendo dividir a las bacterias en dos grupos
taxonómicos : Gram positivas y Gram negativas.
En esta técnica se deben tener en cuenta tres aspectos fundamentales:
• Las bacterias Gram positivas retienen firmemente el colorante inicial
• Al añadir el mordiente se forma un complejo molecular de gran tamaño
• La penetración está condicionada por la permeabilidad de la pared celular.
Los mecanismos antes mencionados se relacionan con la composición química de la pared de

las bacterias. Las bacterias Gram positivas contienen una mayor cantidad de mureína, ácido
tecoico, pocas proteínas y algunas contienen polisacáridos.
Las bacterias Gram negativas poseen poca mureína, una elevada cantidad de lípidos, proteínas
y polisacáridos y no contienen ácido tecoico.
La mureína en las bacterias Gram positivas impide que el complejo cristal violeta-yodo sea
eliminado por el decolorante alcohol–acetona, ya que es insoluble en alcohol. El alto contenido
de lípidos en la pared de las bacterias Gram negativas ocasiona que el complejo cristal violeta
– yodo sea eliminado o disuelto por el decolorante.
Al finalizar la coloración las bacterias Gram positivas quedan teñidas con el cristal violeta:
morado y la bacterias Gram negativas quedan teñidas con el colorante de contraste :safranina :
rojo.
MATERIALES
▪ Cultivos en medio líquido de Escherichiacoli y Staphylococcussp.
▪ Asa bacteriológica
▪ Equipos de coloración para tinción de Gram
▪ Mechero, portaobjetos y puentes para tinción
▪ Microscopio
METODOLOGÍA
Preparar un frotis de cada uno de los cultivos de Escherichiacoli y Staphylococcussp
Preparación del frotis para la tinción

▪ Trabajar en un área aproximadamente de 10 cm de distancia de la llama del
mechero ( zona considerada estéril ), flamear el asa, hasta el rojo vivo y dejarla
enfriar por 30 segundos
▪ Con un lápiz graso identificar cada una de las láminas portaobjetos donde se van a
realizar las preparaciones.
▪ Destapar el tubo con el cultivo, empleando para el propósito los dedos anular y
meñique , introducir el asa, tomar una pequeña muestra de cultivo.
▪ Depositar el material en el centro de una lámina portaobjetos y extenderlo en un
área aproximadamente de 0,5 cm.
▪ Cuando se trata de cultivos de medio sólido , colocar una gota de agua destilada
sobre la superficie , descargar la muestra y homogeneizar. Dejar que la preparación
18
seque espontáneamente al aire libre.
▪ Fijar la preparación pasándola rápidamente sobre la llama del mechero , evitando
un calentamiento excesivo para evitar que el material se carbonice.
▪ Con un lápiz graso identificar cada una de las preparaciones.
♦ Para la realización de un buen frotis se deben cumplir las siguientes condiciones :

▪ Utilizar láminas limpias y en perfecto estado, libre de rayones y de manchas, deben ser
previamente pasadas por la llama del mechero para eliminar trazas de grasa y no se deben
tocar con las yemas de los dedos .
▪ Debe ser delgado, translúcido y homogéneo para que, durante el proceso de tinción, reciba en
toda su superficie el mismo tratamiento con las diferentes sustancias químicas y se debe usar
para la preparación la técnica aséptica.
▪ Utilizar un mínimo de cultivo cuando es un medio sólido.
▪ Cuando se trabaja a partir de un medio líquido debe tomarse suficiente cantidad : una muestra
con el asa de siembra.
Técnica de coloración de Gram :

• Cubrir las preparaciones con cristal violeta , durante un minuto, lavar ligeramente con agua
corriente.
• Cubrir con lugol durante un minuto, lavar ligeramente con agua corriente.
• Decolorar con la mezcla alcohol – acetona , escurrir de 5 a 6 gotas y lavar con agua corriente
• Cubrir con safranina durante 30 segundos , lavar con agua corriente y dejar secar.
• Colocar sobre la coloración una gota de aceite de inmersión .
• Observar al microscopio con la lente de mayor aumento.
1. Cubrir con
cristal violeta 2. Lavar con agua
(1 minuto) corriente
3. Cubrir con lugol 4. Lavar con agua

(1 minuto) corriente
19
5. Decolorar con 6. Lavar con agua
alcohol acetona corriente
(5 a 6 gotas)
7. Cubrir con
safranina 8. Lavar con agua
(30 segundos) corriente
Bacteria Gram
positiva
20
Bacteria Gram
negativa
RESULTADOS
Graficar lo observado al microscopio
21
PRÁCTICA Nº 4
MEDIOS DE CULTIVO
MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO
OBJETIVOS
▪ Comprender la utilidad de los medios de cultivo en el trabajo microbiológico.

▪ Diferenciar los distintos medios de cultivo de acuerdo a su consistencia y función.
INTRODUCCIÓN
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes, que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Debido a que la diversidad metabólica de los microorganismos es muy
amplia, la variedad de los medios de cultivo también lo es. La mayoría de los medios de cultivo
se comercializan en forma de liofilizados , que es preciso rehidratar . La preparación de un
medio de cultivo se reduce a pesar la cantidad del medio y disolverlo en agua destilada ( libre
de inhibidores de crecimiento), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias
termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente
esterilizados en la autoclave.
CONDICIONES GENERALES
▪ Presentar todos los elementos necesarios, en sus proporciones y/o cantidades

necesarias.
▪ pH adecuado
▪ Condiciones osmóticas adecuadas
▪ Estéril y preservado de cualquier contaminación.
▪ Medio fresco ya que se desecan y pierden humedad, concentrándose el resto de los
componentes.
COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CUTIVO
▪ Agua : destilada o desionizada

▪ Agar : se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de
ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.
▪ Azúcares : son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más
empleados son : glucosa, lactosa y sacarosa.
▪ Extractos : son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales,
obtenidos con agua y calor. Ejemplo : extracto de carne , de levadura, de
malta.
▪ Peptonas : son proteínas hidrolizadas , se obtienen por digestión química o
enzimática de proteínas animales o vegetales.
▪ Fluidos corporales : sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguíneo, son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos
microorganismos patógenos.
▪ Sistemas amortiguadores : son sales que se añaden al medio para mantener el pH
dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ejemplo : fosfatos bisódicos o
bipotásicos.
▪ Indicadores de pH : son indicadores ácido-base que se añaden para detectar
22
cambios de pH en el medio.
▪ Agentes reductores : sustancias que se añaden al medio para crear condiciones que
permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ejemplo :
cisteína, tioglicolato.
CLASIFICACIÓN
▪ Por su consistencia
• Medio de cultivo líquido: caldo Nutritivo, caldo Selenito, caldo Peptonado

• Medio de cultivo semisólido: agar Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM), agar Movilidad,
Indol y Ornitina (MIO)
• Medio de cultivo sólido: agar Sangre, agar Mac Conkey, agar Manitol salado.
▪ Por su función o fines especiales
• Medios nutritivos (simples): con nutrientes mínimos para que las bacterias poco
exigentes desarrollen . Ejemplo: caldo y agar Nutritivo.
• Medios nutritivos enriquecidos: son medios simples a los que se añaden ciertos
productos a manera de suplemento nutritivo que permiten el aporte de factores de
crecimiento. Ejemplo: agar Sangre, agar Chocolate.
• Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que por su composición química

favorecen o permiten la multiplicación de unos microorganismos, inhibiendo
parcialmente la de otros. Ejemplo: caldo Selenito, caldo Peptonado alcalino.
• Medios selectivos: permiten el crecimiento sólo de la especie que se desea aislar,

para lo cual se les agrega colorantes bacteriostáticos: Azul de metileno, Verde
malaquita, Verde brillante. Ejemplos: agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella
(SS), agar Manitol salado.
• Medios diferenciales: contienen sustancias nutritivas y un indicador de pH que

permite detectar las reacciones bioquímicas específicas de los microorganismos.
Ejemplo: agar Triple azúcar (TSI),agarÚrea, agar Citrato de Simmons.
• Medios de transporte: permite mantener viables a los microorganismos durante el

traslado al laboratorio. Ejemplo: caldo Hafna, Cary Blair, Stuard.
MATERIALES
▪ Caldo nutritivo : en matraz y tubos

▪ Agar nutritivo en matraz ,placas y tubos
▪ Agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella, agar Manitol salado, agar Chocolate,
agar Triple Azúcar (TSI), agar Úrea, agar Citrato de Simmons, agar SIM.
23
METODOLOGÍA
Observar y diferenciar los medios de cultivo proporcionados en la práctica.
■ Medios Simples:
■ Medios Enriquecidos:
24
■ Medios Selectivos:
■ Medios Diferenciales:
25
MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO
OBJETIVOS
▪ Conocer y realizar las diferentes técnicas de siembra y aislamiento bacteriano.

▪ Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo puro.
INTRODUCCIÓN
En Microbiología se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una porción
de una población de microorganismos (inóculo), de un cultivo crecido a un medio nutritivo para
su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios
previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los profesores de práctica. La
principal advertencia consiste en trabajar siempre próximos a la llama del mechero que ,
debido a las corrientes de convección verticales que genera es capaz de crear un ambiente
estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama.
Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el número de células

bacterianas (inóculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo estéril. Al querer aislar
una especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos deben emplearse
técnicas de aislamiento lo que permite, obtenerlas en forma pura. Esto implica la utilización de
medios tanto simples como especiales , mayormente sólidos de acuerdo a la naturaleza del
microorganismo.
Las técnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas :
▪ Por siembra : es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo

con un medio de cultivo, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo
de incubación , pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. La finalidad es el
aislamiento para tener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra
problema (orina, heces, secreciones, agua servida).
La siembra puede ser :

▪ Por inoculación
▪ Por estrías simples
▪ Por dispersión o agotamiento
▪ Por puntura
▪ Por diluciones sucesivas : consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del

inóculo, ésta se utiliza cuando se tienen muestras líquidas ( orina, agua ) , se realiza
haciendo diluciones a las muestras : 1 :100, 1:1 000, 1:10 000 etc. Luego se
siembra cada dilución en placas de Petri con medios de cultivo.
Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al examen macroscópico :
morfología de las colonias, actividades bioquímicas o características inmunológicas
de los microorganismos aislados.
26
Tomado de Microbiología Tomo II de Granados 2ª edición
Técnica de siembra por diluciones sucesivas
MATERIALES
▪ Asa de siembra en aro y en punta

▪ Tubos de vidrio de 16 x150mm
▪ Tubos de caldo Nutritivo con cultivo mixto bacteriano :Staphylococcusaureus y
Escherichiacoli
▪ Placas con agar Nutritivo, agar Sangre y agar Manitol salado
▪ Tubos con caldo y agar Nutritivo
▪ Suero fisiológico estéril
▪ Mechero de Bunsen
METODOLOGÍA
■ Manejo del asa bacteriológica o de siembra :

El profesor demostrará el manejo adecuado del asa y explicará las precauciones que se deben
tener en la toma de la muestra :
▪ Esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar quemar a las bacterias
▪ Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo líquido, ya que en este lugar se encuentra
una mayor concentración de microorganismos.
▪ Observar que al retirar el asa del tubo esté cubierta por una película líquida.
27
El asa de siembra se
toma del
mango como si fuera un
lápiz
El tapón del tubo se

toma
con el dedo meñique
de la mano derecha
La boca del tubo se

flamea después de
abrirlo
y antes de cerrarlo
■ Método de siembra por agotamiento : aislamiento a partir de un cultivo mixto
▪ Con un lápiz graso marcar por detrás de la placa que contiene el agar , las líneas
como está indicado en la figura Nº 1, por lo que quedarán tres sectores : el sector
uno (1) el más pequeño de los otros dos , servirá para descargar el asa.
▪ Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio líquido , cerrar el tubo y
colocarlo en la gradilla.
▪ Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y sembrar
trazando una serie de líneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector uno
(1) . Esto mismo se puede hacer colocando la placa de Petri sobre la mesa y con la
palma de la mano , hacer un movimiento rápido para levantar el fondo que contiene
el medio de cultivo, como lo indicará el profesor.
▪ Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados , hasta que el sector uno (1)
quede a la izquierda y el sector dos (2) hacia arriba. Sin volver a tomar el inóculo,
trazar un zigzag un poco más abierto en el sector dos (2), invadiendo el sector uno
(1) en las primeras líneas del zigzag , pero no en las últimas.
▪ Girar nuevamente la placa 90 grados , ahora el sector dos (2) estará a la izquierda y
el sector tres (3) hacia la derecha.
▪ Hacer un nuevo zigzag en el sector tres (3), invadiendo el sector dos (2) . Este paso
puede repetirse sembrando un cuarto sector.
▪ Incubar las placas a 37º C durante 24 horas. Las placas ya sembradas deberán
colocarse con la tapa hacia abajo y la parte que contiene el agar sembrado hacia
arriba.
28
1 1
2
2 3
3
Figura Nº 1 Figura Nº 2
■ Método de siembra en caldo de cultivo
▪ Coger el asa de siembra en aro , esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar
por unos segundos.
▪ Abrir la placa que contiene el agar con el crecimiento bacteriano y con la ayuda del
asa de siembra coger una colonia bien aislada (figura Nº 1) .
▪ Luego destapar un tubo con caldo de cultivo (figura Nº 2), coger la torunda, que está
dentro de este con el dedo meñique de la mano con que se está cogiendo el asa de
siembra con la colonia
▪ Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se desprenda
la colonia del asa de siembra.
▪ Introducir la torunda, tapar el tubo, llevar a esterilizar el asa de siembra y
homogeneizar bien el caldo.
▪ Llevar a incubar a 37º C por 12 horas.
Figura Nº1
Figura Nº2
Transcurrido el tiempo de incubación, observar el desarrollo bacteriano en los medios de

cultivo líquido y sólido
▪ Medio líquido : la turbidez indica desarrollo

▪ Medio sólido : presencia de colonias
29
RESULTADOS
Realizar la lectura, observar y graficar los resultados.
▪ Staphylococcusaureus
Agar Nutritivo Agar Sangre Agar Manitol

Salado
▪ Escherichiacoli
Agar Nutritivo Agar Sangre Agar Mac

Conkey
30
PRÁCTICA Nº5
DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS
OBJETIVOS
▪ Reconocer las características morfológicas y en los cultivos de las bacterias Gram

positivas
▪ Identificar bioquímicamente las diferentes bacterias Gram positivas de importancia
clínica.
INTRODUCCIÓN
Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clínica con forma de
cocos como Staphylococcusaureus, especies de Streptococcus , principalmente S.
pneumoniae y cocos anaerobios : Peptostreptococcus.
Entre los bacilos Gram positivos patógenos más comunes tenemos Bacillusanthracis,
Clostridium, Gardnerella, Listeria ,Corynebacterium.
Todas esta bacterias se encuentran causando procesos infecciosos en los seres humanos y
en algunos casos estas se encuentran colonizando alguna parte del cuerpo junto con bacterias
de la flora normal. Por eso se hace necesario para su aislamiento e identificación realizar toma
de muestras y procesamiento bacteriológicos correctos.
Dentro de los Gram positivos, los cocos y en especial las especies de Streptococcus y los
Staphylococcusson los más fáciles de aislar e identificar mediante observación de hemólisis,
pruebas bioquímicas o diferenciales específicas como la prueba de catalasa para diferenciar
Staphylococcusde Streptococcus , la prueba de coagulasa para diferenciar Staphylococcus
patógenos de los no patógenos, la reacción de Quellung para distinguir neumococos etc.
MATERIALES
▪ Cultivos de Streptococcuspneumoniae en agar Sangre

▪ Cultivo de Staphylococcusaureus en agar Manitol salado y agar Sangre
▪ Tubos con plasma (1ml ) y pipetas graduadas de 1 ml estériles
▪ Reactivo de peróxido de hidrógeno
▪ Equipo para la coloración de Gram
▪ Asas bacteriológicas
▪ Mecheros
▪ Microscopios
METODOLOGÍA
Pruebas bioquímicas para Staphylococcusy Streptococcus

▪ Observar el tipo de hemólisis que presentan las placas de agar Sangre
▪ Realizar la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar Sangre y con una
de Manitol salado.
▪ Para la prueba de coagulasa , en dos tubos con un ml de plasma cada uno,
depositar en uno 0,5 ml del cultivo de Staphylococcusaureus y en otro un ml de
Streptococcusepidermidis . Incubar 30 minutos a 37º C.
▪ Preparar un frotis con las colonias que han desarrollado en el agar Sangre y en agar Manitol
salado.
31
Preparación de Frotis :
1. Con el asa de siembra

tomar una colonia de la placa
de Petri 2. Extender la muestra sobre la
lámina portaobjetos
3. Fijar el extendido con la

llama del mechero
METODOLOGÍA
La identificación de Staphylococcus y Streptococcus, se basa en la morfología de las colonias

que se observan en los cultivos primarios y en el tipo de hemólisis en agar Sangre. Sin
embargo para evitar errores de interpretación , se emplean pruebas bioquímicas como :
■ Prueba de Catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición de peróxido de hidrógeno en agua

y oxígeno. Se encuentra presente en la mayoría de los microorganismos aerobios y
anaerobios facultativos excluyendo los estreptococos.
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rápida con
desprendimiento de burbujas : la enzima catalasa convierte el peróxido de hidrógeno , en agua
y oxígeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar los géneros Micrococcus y
Staphylococcus : catalasa positivo del género Streptococcus : catalasa negativo.
32
negativo.
Con el asa de siembra se toma una
colonia del cultivo del
microorganismo y se coloca en la
lámina
Peróxido de
hidrógeno
Figura Nº 1
Figura Nº 2
(+)BURBUJEO :Staphylococcus
(-) NO BURBUJEO :Streptococcus
Figura Nº 3
Tomado de Diagnóstico Microbiológico de Bailey y Scott 11ª edición
POSITIVO NEGATIVO
■ Fermentación del manitol
El agar Manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de Staphylococcus

patógenos en cultivos mixtos, ya que se aprovecha la capacidad de los Staphylococcus de
desarrollar en presencia de Cloruro de sodio (Na Cl) al 7,5 % y la de fermentar manitol, en
este caso se observará la formación de un halo amarillo en el agar circundante a las colonias.
33
■ Coagulación del plasma
Staphylococcusaureus produce una proteína llamada coagulasa , capaz de aglutinar el plasma

tratado con oxalato, citrato o heparina en presencia de un factor contenido en el suero.
Este factor sérico reacciona con la coagulasa , activando el fibrinógeno y produciendo un
coágulo o trombo de fibrina. La coagulasa se presenta en forma unida (adherida a la célula) y
en forma libre. El estudio de la actividad coagulasa se puede llevar a cabo en un tubo de
ensayo (para coagulasa libre) y en portaobjetos (coagulasa nido), también llamado factor de
agregación , la prueba en tubo se hace poniendo un ml de plasma al que se le agrega una
asada de un cultivo nocturno de S. aureus. Se incuba la mezcla a 37º C durante 4 horas y se
considera positivo ante cualquier grado de
coagulación.
(+) PRUEBA POSITIVA

Formación de coágulo
Staphylococcusaureus
(-) PRUEBA NEGATIVA

No hay formación de coágulo No se forma
Coágulo Staphylococcusepidermidis coágulo
Tomado de Diagnóstico Microbiológico de Bailey y Scott 11ª edición
POSITIVO NEGATIVO
34
RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS
• Streptococcus
Hemólisis Prueba de
catalasa
• Staphylococcusaureus
Fermentación Prueba de Prueba de

del manitol catalasa coagulasa
35
• Staphylococcusepidermidis
Fermentación Prueba de Prueba de

del manitol catalasa coagulasa
36
PRÁCTICA Nº6
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS
▪ Entender el fundamento del antibiograma , el modo en que se realiza y las

principales fuentes de error.
▪ Conocer los principales métodos de susceptibilidad a un antimicrobiano.
▪ Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibióticos de una bacteria de
crecimiento rápido aislada en prácticas anteriores. El método utilizado es el de
difusión en agar o de Kirby-Bauer.
INTRODUCCIÓN
La actividad de los antimicrobianos (antibióticos y quimioterápicos) debe ser evaluada “in vitro”
para obtener la información que permitirá decir si un microorganismo es susceptible o
resistente a determinado producto.
Los antimicrobianos actúan produciendo toxicidad selectiva , no actúan directamente sobre el
huésped, sino que se combinan químicamente con determinados sistemas de los
microorganismos , enfocando así la acción sobre los microorganismos más que sobre el
huésped.
La determinación de la mínima concentración inhibitoria (MIC) nos proporciona la dosis
mínima necesaria del quimioterápico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que permite
hacer estudios de uso clínico y detectar mutantes resistentes.
Dos son los procedimientos empleados para conocer ésta información, el método del tubo
dilución y el del disco difusión en agar, a éste último se le denomina : antibiograma.
■ Acción de los antibióticos

▪ La actividad antimicrobiana in vitro determina:
a. La potencia de un agente antibacteriano en solución
b. Su concentración en los líquidos del cuerpo o en los tejidos
c. La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas del
medicamento.
▪ Inhibición de síntesis de pared celular: Penicilina, Cefalosporinas, Bacitracina,
Vancomicina, Novobiocina.
▪ Alteración de la permeabilidad de la membrana celular: Anfotericina B, Colistina,
Nistatina, Polimixina.
▪ Inhibición de la síntesis proteica :Aminoglucósidos ( Kanamicina, Amikacina ,
Estreptomicina ), Tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrólidos ( Eritromicina ),
Lincomicinas.
▪ Inhibición de síntesis de ácidos nucleicos : Ácido Nalidíxico, Novobiocina,
Sulfonamidas, Trimetropin, Rifampicina.
■ Medición de la actividad antimicrobiana

Esta se determina mediante los métodos de dilución o difusión, utilizando un microorganismo
standard y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se utilizan las pruebas de
dilución en tubos y el método de difusión.
■ Prueba de dilución
En éste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medios líquidos, se
inoculan después con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se toma cuando la
cantidad de sustancias antimicrobiana es capaz de inhibir el crecimiento o de matar a las
bacterias en prueba.
■ Método de difusión
37
▪ Preparación del inóculo
La técnica del antibiograma sólo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello
previamente se procederá, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa.
Cultivar la bacteria aislada en un tubo con medio líquido apropiado (caldo Nutritivo, Infusión
cerebro corazón) o preparar una suspensión directa a partir del cultivo en placa usando el
siguiente método:
a. Tomar una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solución salina frotando
en la pared del tubo.
b. Homogeneizar bien y ajustar la densidad óptica con un patrón de turbidez Nº 0,5 de Mac
Farland : 0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M a 99,5 ml de ácido sulfúrico 0,36 N 0,18 M. Esto
equivale a 108 células/ml . Diluir si es necesario la suspensión o añadir más inóculo.
c. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez, sumergir una torunda estéril en
la suspensión, rotar la torunda estéril varias veces. Presionando firmemente sobre la pared
interior del tubo por encima del nivel del líquido, para remover el exceso de inóculo.
d. Inocular la superficie seca de la placa con agar MüellerHinton estriando con una torunda en
tres direcciones mediante rotación de la placa, para asegurar una distribución uniforme del
inóculo, dejar secar la placa a temperatura ambiente por 3 a 5 minutos para que cualquier
exceso de humedad superficial sea absorbido.
e. Colocar los discos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estéril (o con un
aplicador automático) presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto
completo son la superficie del agar.
Distribuir los discos uniformemente de modo que estén a una distancia de 15 mm del borde de
la placa y a 25 mm uno del otro (el diámetro de los discos según las normas de la
Organización Mundial de la Salud debe ser de 6 mm), no deben colocarse más de 6 discos en
una placa.
La dificultad de éste método está en las diferentes velocidades de crecimiento para los
diversos microorganismos.
El uso de un disco para cada antibiótico estandarizado , permite dar el informe de S (sensible),
I (intermedio) y R (resistente)
■ Factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro :

▪ El pH del medio, ya que algunos antibióticos son más activos a pH ácido
(Nitrofurantoína), otros a pH alcalino (Aminoglucósidos , Sulfonamidas)
▪ Los componentes del medio, en este caso las proteínas séricas fijan a las penicilinas desde
40 % para la Meticilina y 98 % para la Dicloxacilina.
▪ Estabilidad de los medicamentos , a la temperatura de la incubadora varios agentes
antimicrobianos pierden su actividad.
▪ Cuanto más grande sea el inóculo bacteriano, más baja será la sensibilidad del
microorganismo.
▪ Cuanto más tiempo se prolonga la incubación, mayor es la oportunidad de presentarse las
mutantes resistentes , igualmente los microorganismos que crecen rápido y activamente son
más sensibles a la acción de los antibacterianos que aquellos que se encuentran en fase de
reposo.
■ Dilución en tubo
▪ Se obtiene un resultado cuantitativo , destacando dos características importantes :
▪ Concentración mínima inhibitoria (CMI) : es la concentración mínima de

antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo.
▪ Concentración mínima bactericida (CMB) : es la concentración que mata a los
microorganismos.
Normalmente la CMI es suficiente para combatir una determinada infección, ya que los
mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar al microorganismo.
MATERIALES
38
▪ Caldo de cultivo con suspensión bacteriana a la escala de turbidez de Nº 0,5 de Mc
Farland
▪ Placas de Petri con agar MüellerHinton
▪ Torundas estériles
▪ Discos impregnados con diferentes antibióticos
▪ Pinzas estériles.
METODOLOGÍA
▪ Sumergir la torunda en caldo tripticasa de soya con cepa bacteriana , presionar

firme sobre las paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de la
placa de agar MuellerHinton.
▪ Colocar con la ayuda de pinzas, los discos impregnados con diferentes antibiótico
sobre la superficie del agar.
▪ Los discos deben quedar a una distancia de 25 mm entre ellos.
▪ Incubar a 37°C durante 24 horas.
Realizar la lectura, observar y anotar los resultados.
■ Lectura de los discos de sensibilidad

El diámetro de la zona de inhibición se mide con una regla milimetrada, colocada debajo de la
placas de Petri.
El límite del área de inhibición está dado por la inhibición completa del desarrollo, tal como se
puede apreciar a simple vista.Los milímetros de la lectura serán llevados a la tabla
correspondiente para traducir su interpretación en los términos :Sensible ( S ), Intermedio ( I ) ,
Resistente ( R ).
39
Tomado del Manual de laboratorio para
la identificación y prueba de
susceptibilidad a los antimicrobianos de
patógenos bacterianos de importancia
para la salud pública en el mundo en
desarrollo. Organización Mundial de la
Salud 2004.
Sensible
Resistente
Lectura de los halos de Inhibición de los discos de sensibilidad
Quimioterápico Concentración del Halo de Inhibición

Disco mcg Sensible Intermedio Resistente
Ampicilina AM 10 ug +17 14-16 -13
Amikacina AK 30 ug +17 -15
Ac. Nalidíxico AN 30 ug +19 14-18 -13
Cefalotina CF 30 ug +18 15-17 -14
Cefoxitina CTX 30 ug +21 16-10 -15
Ceftriaxona CRO 30 ug +21 14-20 -13
Cloranfenicol C 30 ug +18 15-18 -14
Kanamicina K 30 ug +18 14-17 -13
Nitrofurantoina FD 300 ug +17 15-16 -14
Sulfatrimetoprim SXT 231,2 ug +16 11-15 -10
Ciprofloxacino CIP 5 ug +21 16-20 -15
Antibiótico S I R
40
Antibiótico S I R
41
PRÁCTICA Nº 7
IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS.
PSEUDOMONA
OBJETIVOS
▪ Conocer los procedimientos de identificación bioquímica de las principales bacteria

Gram negativas.
▪ Interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas y correlacionarlas con la
diferentes especies de bacterias Gram negativas.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias Gram negativas pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los primeros
los más abundantes tanto en el hombre como en los animales. Varios de estos
microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal , algunos están asociados a
infecciones entéricas y a procesos infecciosos (especialmente cuando éstas bacterias invaden
otros órganos o sistemas).
Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal , de un portador sano o de la
diseminación endógena de la bacteria en una persona susceptible, pudiéndose ver afectado
cualquier órgano del cuerpo.
Familia de bacilos entéricos
Esta familia Enterobacteriaceae, incluye a varios patógenos que causan síndromes diarreicos .
Un gran número de ensayos han sido desarrollados a manera de identificar rápidamente al
patógeno, para que posteriormente el médico, con base en el reporte, indique el tratamiento
adecuado o para que los epidemiólogos puedan localizar la fuente de infección. Dentro de los
bacilos Gram negativos , las enterobacterias son responsables del 30 a 35 % de todas las
septicemias, más del
70 % de todas las infecciones del tracto urinario y muchas infecciones intestinales.
Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiológicos de infecciones
entéricas tenemos :Salmonella , Shigella, y Escherichiacoli. Estas pueden producir cuadros
diarreicos e infección sistémica , que son procesos infecciosos que se diseminan
generalmente por vía sanguínea o linfática.
Medios de aislamiento primario
Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el

desarrollo de otras. Esta capacidad puede ser moderada (agar Eosina azul de metileno (EMB)
y Mac Conkey) y alta (agar Salmonella-Shigella, Desoxicolato y Citrato) o completamente
específica (Sulfato de bismuto y Verde brillante).
Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que permite desde
el principio tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como Escherichiacoli y no
fermentadoras de la lactosa :Salmonella, Shigella.
Medios diferenciales : Pruebas Bioquímicas
Son aquellos en los que se pone de manifiesto las propiedades metabólicas de los
microorganismos frente a diferentes sustratos. Existen medios que permiten observar una, dos
o más características metabólicas de la bacteria inoculada . Entre los más utilizados están :
42
▪ Agar Triple Azúcar (TSI): medio sólido que contiene glucosa, sales de hierro
y un indicador de pH. Permite conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los
carbohidratos. Se detecta la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S), así como de gas. El
tubo se siembra por picadura y en estría por lo que se debe observar tanto
el fondo como la superficie del medio
▪ Agar Lisina Hierro (LIA) : medio sólido que contiene lisina, sales de hierro, glucosa y un
indicador de pH. Se determina la descarboxilación y desaminación oxidativa de la lisina, la
producción de ácido sulfhídrico o sulfuro de hidrógeno (H2S) y la fermentación de glucosa. Se
siembra por picadura y estría.
▪ Medio para Sulfuro ,Indol y Movilidad (SIM) : medio semisólido, se utiliza en la producción
de sulfuro de hidrógeno, la formación de Indol y movilidad. Se inocula con una única punción
con asa de siembra recta a través del centro, hasta una profundidad de unos dos tercios del
medio.
▪ Agar Citrato de Simmons : medio sólido que contiene citrato de sodio, compuesto que
puede ser utilizado como única fuente de carbono, por algunas bacterias. Se siembra por
picadura y estría
• Agar Úrea (Método de Christensen) : medio sólido, se utiliza para determinar la capacidad
de un organismo para producir la enzima ureasa, que hidroliza la úrea . La hidrólisis de la úrea
produce amoníaco y anhídrido carbónico. La formación de amoníaco alcaliniza el medio y el
cambio de pH se detecta por el cambio de color del rojo fenol de naranja pálido a magenta.
Existen más pruebas bioquímicas que pueden utilizarse como complemento a las ya descritas
como son : rojo de metilo, VogesProskawer, utilización de malonato, las cuales ayudan a
determinar la especie del microorganismo aislado. En ocasiones a pesar de recurrir a diversas
pruebas metabólicas, no se consigue la identificación , siendo necesario realizar reacciones
inmunológicas para llegar al diagnóstico definitivo.
BACTERIAS PIÓGENAS GRAM NEGATIVAS
Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clínica son las bacterias
piógenas Gram negativas, que pueden ser cocos o cocobacilos . Las enfermedades que
producen por lo general incluyen la acumulación de abundantes cantidades de pus y afectan
frecuentemente el aparato genital o respiratorio. Dichas enfermedades comprenden : uretritis
purulenta (gonococo) , meningitis , neumonías , bronquitis, sinusitis, otitis media, conjuntivitis,
epiglotitis etc.
Las bacterias piógenas Gram negativas patógenas en humanos son :Neisseria, Haemophilus,
Bordetella, Moraxella.
Las bacterias del género Neisseria son diplococos Gram negativos inmóviles, cuyos lados
adyacentes son aplanados y ligeramente cóncavos. Sólo dos especies de este género son
patógenas exclusivamente de humanos :Neisseriagonorroheae o gonococo, agente causal de
la enfermedad de transmisión sexual, la gonorrea y la
N .meningitidis o meningococo productos comensales para el hombre y que habitan
principalmente el tracto respiratorio superior.
Esporádicamente se pueden comportar como patógenos oportunistas N. sicca y
N. mucosa.
El diagnóstico definitivo de una infección gonocócica se hace por el aislamiento en cultivo de

N. gonorrhoeae.
Para el diagnóstico del gonococo, el lugar de la toma de la muestra dependerá de la edad,
sexo y de las características de la infección.
43
La tinción de Gram es el método de elección para el examen directo de las muestras. Son
oxidasa positiva.
Para los cultivos , el medio debe ser de preparación reciente, bien hidratado y precalentados.
Se utilizan medios selectivos como agar Thayer Martin modificado. Se debe utilizar un medio
no selectivo ya que algunas cepas pueden inhibirse por los antimicrobianos contenidos en los
medios selectivos. Debe estar además en una atmósfera que contenga de 3 a 5 % de CO2.
El diagnóstico de la infección meningocócica, se hace con el aislamiento de N. meningitidis a
partir de líquido cefalorraquídeo, sangre, líquido sinovial, pleural o pericárdico. Las más
utilizadas son las dos primeras.
Con la tinción de Gram se observan como diplococos Gram negativos, crecen en los medios
de cultivo enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmósfera de CO2. Son oxidasa
positivo y fermentan los carbohidratos.
MATERIALES
▪ Placas con agar Eosina azul de metileno sembradas con cepas problemas.
▪ Placas con medio Mac Conkey, Eosina azul de metileno (EMB) y Salmonella-Shigella
▪ Tubos con medio TSI, Citrato de Simmons, LIA, ÚREA, SIM, sin sembrar y
sembrados con cepa problema
▪ Asas de siembra
▪ Reactivo de Kovacs
▪ Láminas fijadas con frotis de líquido cefalorraquídeo con tinción de Gram.
▪ Microscopio
▪ Aceite de inmersión
▪ Placas de cultivo con agar Chocolate.
METODOLOGÍA
■ Enterobacterias
▪ En las prácticas se harán los trabajos de laboratorio que nos permitan observar las
características de cultivo y con ello su identificación
▪ A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa de siembra previamente
esterilizada una muestra y sembrar por estrías en los medios Eosina azul de
metileno y Salmonella – Shigella. Incubar a 37ºC por 24 horas.
▪ Transcurrido el tiempo de incubación , observar la morfología de las colonias de las
placas sembradas (Mac Conkey, EMB y S-S).
▪ Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato de Simmons,
LIA y SIM. Esto se hace por puntura en los medios y luego en estrías en la parte de
inclinación (pico de flauta) como lo indicará el profesor en cada medio. Llevar a
incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
▪ Hacer la lectura de las pruebas bioquímicas, interpretar y realizar la identificación
del microorganismo proporcionado.
■ Interpretación Bioquímica
Agar Triple Azúcar (TSI):

▪ Fermentación de glucosa : en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a color
amarillo. Es una reacción débil.
▪ Fermentación de sacarosa : en todo el tubo el medio cambia a amarillo,
principalmente en el fondo, donde se intensifica el color debido a la reacción de la
glucosa.
44
▪ Fermentación de lactosa : en la superficie el medio vira a amarillo.
Debido a la fermentación puede hacer producción de gas, lo que se manifiesta por la
presencia de burbujas en el medio.
▪ Producción de ácido sulfhídrico o sulfuro de hidrógeno (H2S): por degradación
enzimática de aminoácidos que contienen azufre originan un precipitado de color
negro. La producción de H2S tiene lugar en ambiente ácido, de ahí que el precipitado
negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan ácidos a partir de la
glucosa. Así , un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque
el color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro.
Agar Lisina Hierro (LIA) :

▪ Descarboxilación de lisina : el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramente
morado en la superficie.
▪ Fermentación de la glucosa : en el fondo del tubo el medio vira a amarillo.
▪ Desaminación de la lisina : vira a color rojizo en la superficie del medio. Es
característico de Proteus y Providencia.
▪ Producción de H2S : precipitado de color negro ( por el mecanismo citado
anteriormente).
Agar Citrato de Simmons :

▪ Utilización de citrato como fuente de carbono : el medio vira a color azul.
Agar Úrea:
▪ Los microorganismos que hidrolizan la úrea producen un cambio de color en el pico
de flauta de naranja pálido a magenta.
Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM) :

▪ Motilidad: Los cultivos móviles muestran un crecimiento difuso o turbidez lejos de la
línea de inoculación , por lo que observando si el crecimiento está solo en la
picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el microorganismo
es inmóvil o móvil.
▪ Indol : la aparición transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la
interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por lo tanto , la
prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehído
del reactivo originando un complejo de color rojo.
▪ Producción de H2S: precipitado de color negro ( por el mecanismo citado
anteriormente).
Escherichia
coli
45
Klebsiella
Salmonella
Shigella
46
RESULTADOS
Realizar la lectura e identificación de los microorganismos, observar y anotar los resultados.
• Escherichia coli :
TSI LIA Citrato de Úrea SIM

Simmons
• Klebsiellasp

Simmons
47
• Proteussp

Simmons
• Salmonella sp

Simmons
• Shigellasp

Simmons
48
PSEUDOMONA
Las especies pertenecientes al género Pseudomonas son ubicuos, se encuentran en la

tierra, materia orgánica en descomposición, en la vegetación, en el agua. También podemos
encontrar estos microorganismos en el ambiente hospitalario, en lugares húmedos, como
comida, baños, respiradores. No forman parte de la flora normal del ser humano con
excepción de los pacientes hospitalizados y en pacientes ambulatorios inmunodeprimidos.
Debido a las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad nutricional , se logra su
amplia distribución ambiental, siendo capaces de utilizar un gran número de compuestos
orgánicos como fuentes de carbono y nitrógeno.
Son bacilos Gram negativos móviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios
estrictos, la mayoría de las cepas son móviles por medio de uno o más flagelos polares;
utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera oxidativa; y suelen ser citocromo
oxidasa positivos
El género Pseudomonasse divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente, Grupo Stutzeri,
Grupo Alcalígenes y Grupo con pigmento amarillo.
Grupo fluorescente : Pertenecen a este grupo las especies : Pseudomonaaeruginosa,
Pseudomonafluorescens y Pseudomonaputida , las cuales se caracterizan por la producción
de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da fluorescencia blanca a verde azulada bajo luz
ultravioleta de longitud de onda larga (400 nm). Sólo una especie, Pseudomonaaeruginosa ,
produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina.
Pseudomonaaeruginosa produce un aspecto característico cuando crece en una placa de agar
sangre , se pueden observar grandes colonias grises y presenta beta hemólisis. Las colonias
tienen un aspecto de piel de caimán y con brillo metálico.
La exudación de pus azulado, con olor similar a las uvas , por la producción de piocianina es
característico en las heridas infectadas por este microorganismo. La piocianina es un
antibiótico que puede permitir que la Pseudomonaaeruginosa exista en la naturaleza, también
puede desempeñar un papel en la nutrición , al funcionar como una forma de adquirir fosfatos
inorgánicos. Se puede realizar una
identificación rápida de Pseudomonaaeruginosa si se observan las siguientes características :
morfología típica de las colonias, producción de pigmentos difusibles, olor a fruta y positividad
en la prueba de oxidasa.
CARACTERÍSTICAS DEL GRUPO FLUORESCENTE:
PRUEBA Pseudomonaaeruginos Pseudomonafluorescen Pseudomonaputid

a s a
PIOVERDIN + + +
A
PIOCIANINA + - -
MATERIALES
▪ Placas con agar Nutritivo sembrada con cepa problema.

▪ Asas de siembra
49
Pseudomona
aeruginosa
piocianina
RESULTADOS
50
PRÁCTICA Nº 8
IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE MYCOBACTERIUM
COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN.
BACTERIAS ANAEROBIAS
OBJETIVOS
▪ Conocer los riesgo y precauciones durante el procesamiento de muestras con

micobacterias.
▪ Conocer el procesamiento de las muestra para el estudio de micobacterias.
▪ Explicar el fundamento de la coloración de Ziehl-Neelsen.
▪ Ejecutar la técnica de coloración de Ziehl-Neelsen.
INTRODUCCIÓN
El género Mycobacterium está integrado por más de 100 especies, presentan alto contenido
de ácidos micólicos en su pared que retienen las anilinas utilizadas como colorantes : fucsina ,
auramina, aun después de ser tratadas con alcohol-ácido de modo que todas las especies se
presentan como ácido-alcohol resistentes (BAAR).
El complejo Mycobacteriumtuberculosis comprende varios agentes etiológicos de tuberculosis
M.tuberculosis ,M.africanum y M.canetti, los cuales son primariamente patógenos en el
hombre.
M.tuberculosis y M.africanumson las especies de micobacterias más importantes por ser
altamente patógenas para el hombre y muy transmisibles de persona a persona por aerosoles
expulsados por la tos de pacientes con lesión pulmonar.
La muestra más examinada en la investigación de Mycobacteriumtuberculosis es la de esputo

debido a que la tuberculosis pulmonar es la más frecuente, sin embargo dado que la
enfermedad puede manifestarse en cualquier órgano , con menor frecuencia puede requerirse
la investigación de muestras como orina, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido
ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias, las cuales deben procesarse también
para cultivo.
La muestra de esputo mucopurulenta proveniente del árbol bronquial que se obtiene después
de un esfuerzo de tos, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar
bacilos, debe tener un volumen aproximado de 3 a 5 ml .Se recomienda analizar 2 ó 3
muestras de cada sintomático respiratorio. La primera muestra debe obtenerse en el momento
de la consulta y la segunda al día siguiente al despertar por la mañana. Puede obtenerse una
tercera muestra al momento de entregar al laboratorio la segunda muestra. El envase debe ser
de boca ancha y con tapa de rosca.
Si la muestra de esputo no va a ser procesada el mismo día, se debe introducir cada envase
en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa por encima de la tapa , se conservarán en
refrigeración a 4º C, para impedir la proliferación de la flora secundaria, preferentemente
dentro de una caja de plástico.
Para manipular las muestras y sobre todo los pasajes a otros medios de cultivo es importante
hacerlos en la cabina de seguridad.
Para que la baciloscopía sea positiva es preciso que la muestra contenga entre 5 000 y 10 000
bacilos por ml de muestra.
51
Las micobacterias se multiplican con más lentitud que otras bacterias patógenas para el
hombre a causa de su pared celular hidrófoba, que las hace agruparse e inhibe la
permeabilidad celular a los nutrientes
El medio de cultivo más conocido es el Löwenstein-Jensen. La temperatura óptima de

crecimiento es de 37ºC. Los cultivos se revisarán diariamente hasta un total de 60 días ,
pasados los cuales si no hay crecimiento se considerarán negativos.
Lectura de los extendidos

Observar cada campo microscópico en superficie y profundidad , moviendo el tornillo
micrométrico antes de desplazarse al siguiente campo; seguir un recorrido en líneas rectas,
para recorrer el extendido evitando repetir la lectura de los campos , ejemplo : de izquierda a
derecha. El número mínimo de campos a examinar es de 100 , los cuales pueden ser leídos
por un microscopista experimentado en cinco .
Los bacilos se observarán como bastoncillo delgados , ligeramente curvos, rojo fucsia,
destacándose claramente contra en fondo azul. Pueden presentarse aislados, apareados o
agrupados.
Escala semicuantitativa para los extendidos examinados por tinción Ziehl-Neelsen
Resultado del examen microscópico Informe

No se encuentran BAAR en 100 campos observados No se observan bacilos ácido-alcohol
Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos resistentes
observados Nº exacto de bacilos en 100 campos
Se observan entre 10 y 99 BAAR en 100 campos
observados Positivo (+)
Se observan de 1 a 10 BAAR en 50 campos
observados Positivo (++)
Se observan más de 10 BAAR en 20 campos
observados Positivo (+++)
Tinción de Ziehl-Neelsen
La ácido-alcohol resistencia es la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su

pared fucsina fenicada y retenerla aun con la acción de los decolorantes como la mezcla de
ácido y alcohol . Esta característica se debe al alto contenido lipídico fundamentalmente
fosfolípidos, ceras y ácidos micólicos.
MATERIALES
▪ Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos
▪ Frotis fijos de Mycobacteriumtuberculosis a partir de esputos
▪ Tubos con medios de cultivo Löwestein-Jensen mostrando colonias de micobacterias
▪ Equipo de coloración para tinción de Ziehl-Neelsen
▪ Mecheros
▪ Microscopios
METODOLOGÍA
Preparación y fijación del extendido
1. Ordenar las muestras

2. Numerar las láminas portaobjetos
3. Tomar la muestra y la lámina portaobjetos y colocarlas por detrás del mechero, de
52
manera que la llama quede entre el operador y el frasco
4. Destapar con cuidado el envase
5. Partir un aplicador en dos. Tomar una parte del aplicador con la mano izquierda y
la otra con la mano derecha entre el pulgar y el índice y con los extremos
irregulares seleccionar la partícula más densa o purulenta de la muestra
6. Colocar las partículas seleccionadas sobre la lámina portaobjetos y extenderla con
movimientos suaves . Dejar secar el extendido a temperatura ambiente
7. Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solución de hipoclorito de
sodio al 1 %.
8. Cerrar el envase de la muestra
9. Cuando el extendido haya secado, pasarlo sobre la llama del mechero por tres (3) o
cuatro (4) veces para fijarlo.
Tinción de Ziehl-Neelsen
1. Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada

2. Con la llama de un hisopo embebido de alcohol calentar suavemente por debajo de
los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta observar que se desprenden los
primeros vapores blancos
3. En el término de 5 minutos calentar tres veces hasta la emisión de vapores.
No dejar hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y
colorearse mal.
4. Dejar enfriar y enjuagar con abundante agua
5. Cubrir todo el extendido con la solución decolorante y dejar actuar por tres
minutos. Enjuagar con abundante agua
6. Cubrir todo el extendido con solución de Azul de metileno, dejar actuar por un
minuto
7. Enjuagar con abundante agua
8. Dejar secar al medio ambiente
1. Cubrir con fucsina 2. Calentar suavemente con

básica fenicada ayuda del hisopo (5 minutos)
53
4. Cubrir con solución
3. Enjuagar con decolorante (3 minutos)
abundante agua
5. Enjuagar con 6. Cubrir con Azul de

abundante agua metileno (1 minuto)
7. Enjuagar con
abundante agua
54
bacilos ácido-alcohol
resistentes
Medio de cultivo
Löwenstein-Jensen
Crecimiento de
Mycobacteriumtuberculosis
RESULTADOS
Realizar la observación microscópica de las láminas y graficar los resultados.
55
BACTERIAS ANAEROBIAS
Las bacterias anaerobias han sido encontradas en infecciones que comprometen todos
los órganos y regiones anatómicas del cuerpo. Los abscesos más profundos y las lesiones
necrosantes que involucran anaerobios son polimicrobianos y pueden incluir aerobios
obligados, anaerobios facultativos, microaerófilos como microorganismos acompañantes.
Estos microorganismos, de forma conjunta con el trauma, la éstasis vascular o la necrosis
tisular, reducen la tensión de oxígeno y el potencial de oxidoreducción en los tejidos y proveen
las condiciones favorables para la multiplicación de los anaerobios obligados.
En las últimas décadas , las infecciones anaerobias se han vuelto más comunes, para lo cual
existen dos probables explicaciones : a) el aislamiento por parte del laboratorio de las
bacterias anaerobias ha mejorado de modo que las infecciones endógenas no son más mal
diagnosticadas o pasan inadvertidas , b) una proporción mayor de pacientes está recibiendo
fármacos inmunosupresores por neoplasias u otras enfermedades , lo que deriva en la
resistencia del huésped inmunodeprimido. Las infecciones anaerobias primarias se establecen
fácilmente en áreas de tejido dañado y la bacteriemia, diseminación metastásica de las
bacterias con formación de abscesos distantes y una cadena progresiva de eventos , pueden
suceder a veces con un desenlace mortal. Es importante el aislamiento e identificación de las
bacterias anaerobias debido a que estas se asocian a una elevada morbimortalidad y a que el
tratamiento varía según la especie implicada.
Aislamiento de bacterias anaerobias
● Selección de las muestras para el cultivo :

Debido a que los anaerobios residentes a menudo
están presentes en grandes cantidades como flora normal en las superficies de las mucosas ,
incluso la contaminación mínima de una muestra puede dar resultados erróneos. Todos los
materiales recogidos de lugares que carecen de flora natural como líquidos corporales que no
sea orina, exudados de abscesos profundos, aspirados con aguja fina y biopsias de tejidos
pueden ser cultivados para bacterias anaerobias.
● Recolección y transporte de las muestras:

Al tomar muestras de piel o mucosas, se debe se
descontaminar la superficie, para lo cual se debe utilizar jabón , alcohol etílico al 70 % y tintura
de yodo por un minuto ( en círculos concéntricos comenzando por el centro), también se
puede utilizar yodopovidona al 10 % , luego de lo cual se espera al menos 2 minutos antes de
la extracción de la muestra . El material para el cultivo anaerobio se obtiene mejor por biopsia
de tejidos o por punción y aspiración . El empleo de hisopos no es una alternativa adecuada
debido a la exposición excesiva de la muestra a los efectos de la desecación , la posibilidad de
contaminación durante la recolección y a que los microorganismos pueden quedar retenidos
dentro de las fibras del hisopo. Si se utiliza un hisopo, este debe provenir de un sistema de
transporte exento de oxígeno.
Un factor crucial para la viabilidad de los cultivos anaerobios es el transporte de las
muestras; el efecto letal del oxígeno atmosférico debe ser nulo hasta que la muestra pueda
procesarse en el laboratorio. Ya no se acepta tapar de nuevo una jeringa ni el transporte de la
aguja y la jeringa al laboratorio debido a los problemas secundarios a lesiones por punción .
Por lo tanto incluso los aspirados deben inocularse en el mismo tipo de tubo o frasco ampolla
libre de oxígeno. La muestra (pus, líquidos corporales u otro material líquido) se inocula a
través del tapón de goma después de extraer todo el aire de la jeringa y la aguja. Si sólo se
puede obtener una muestra con hisopo, se requiere de un dispositivo especial para la
recolección con una atmósfera libre de oxígeno. Cuando se reinserta el hisopo, debe de
tenerse cuidado de no inclinar el recipiente , lo que provocaría la salida y el desplazamiento
del anhídrido carbónico o el nitrógeno libre de oxígeno al aire ambiental.
El tejido puede colocarse en una pequeña cantidad de líquido para preservarlo de la
desecación y luego colocarlo en una bolsa para anaerobiosis.
56
Todas las muestras deben mantenerse a temperatura ambiente hasta su procesamiento en el
laboratorio, dado a que la refrigeración puede oxigenar la muestra. Todas las muestras deben
ser remitidas al laboratorio lo antes posible.
● Examen directo de los materiales clínicos:

El análisis macroscópico de las muestras es
importante para establecer la presencia de anaerobios, datos orientadores serán el hallazgo
de un olor fétido, el aspecto purulento de muestras líquidas así como el hallazgo de tejido
necrótico y gas.
En los portaobjetos preparados para la tinción de Gram, es más útil la fijación con metanol que
el calor; se deben observar características celulares y el fondo del frotis y en la tinción de
Gram , observar la forma, tamaño, disposición de las bacterias y registrar el número de
microorganismos presentes . Observar características morfológicas distintivas como :
presencia de esporas, ramificaciones, filamentos con corpúsculos esféricos, formas
granulares. La tinción de Gram permite determinar características celulares, las tinciones de
Wright y Giemsa a veces pueden revelar información adicional. Las tinciones de naranja de
acridina son las más útiles para detectar bacterias en hemocultivos, líquido cefalorraquídeo,
líquido pleural, líquido articular y exudados.
Procesamiento de las muestras

Las muestras para cultivos anaerobios pueden procesarse en la mesa de trabajo
común con incubación en jarras o bolsas para anaerobiosis o en una cámara anaerobia.
■ Jarras para anaerobiosis : el sistema que más se utiliza para crear una atmósfera anaerobia
es la jarra para anaerobiosis; para lo cual se utiliza una jarra plástica transparente ( disponible
en el comercio) con una tapa que se cierra para hacerla hermética. Las condiciones de
anaerobiosis pueden obtenerse mediante el uso de un sobre que se adquiere en el comercio,
generador de hidrógeno y CO2, que se activa con el agregado de agua o con la humedad
proveniente de las placas de agar. La anaerobiosis se alcanza luego de 1 a 2 horas.
■ Bolsas plásticas anaerobias : Es una bolsa de plástico transparente , de varios tamaños,

con capacidad para una a tres placas de Petri de 100 mm de diámetro, un generador de gas
H2-CO2 que produce una atmósfera cuando se le agrega agua, partículas de catalizador de
paladio frío y resazurina como indicador. La bolsa se sella con calor luego de la activación del
generador para permitir el mantenimiento de las condiciones anaerobias.
Incubación de los cultivos

En la mayoría de los casos, la temperatura adecuada es de 35 a 37°C, para el aislamiento
primario de bacterias anaerobias a partir de muestras clínicas. Las placas inoculadas en las
mesas de trabajo y colocadas en las jarras de anaerobiosis deben incubarse al menos 48
horas y reincubarse por otros 2 a 4 días para permitir que los microorganismos de crecimiento
lento formen colonias; algunos anaerobios como ciertas especies de Actinomyces y
Eubacterium, crecen más lentamente y las colonias no pueden detectarse si las jarras se
abren antes. Si las jarras se abren pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento
lento pueden morir debido a la exposición de oxígeno. Debe evitarse la exposición prolongada
de las placas recién inoculadas al aire ambiental, ciertos anaerobios encontrados en muestras
clínicas como Peptostreptococcusanaerobius , pueden no crecer o mostrar un retraso
prolongado en el desarrollo cuando las placas recién inoculadas se mantienen en el aire
ambiental.
CUADRO N°1 : Incidencia de anaerobios como flora normal de los seres humanos
57
GÉNERO Piel Tracto Intestino Genitales Uretra Vagina
Respiratorio externos
Superior
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Bacteroides 0 +/- 2 +/- +/- +/-
Prevotella 0 2 2 1 +/- 1
Porphyromonas 0 1 1 D D +/-
Fusobacterium 0 2 1 D D +/-
Veillonella 0 2 1 0 D 1
BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Finegoldia magna 1 2 2 1 +/- 1
Micromonas 1 2 2 1 +/- 1
micros
Clostridium +/- +/- 2 +/- +/- +/-
Actinomices 0 1 1 0 0 +/-
Bifidobacterium 0 1 2 0 0 +/-
Eubacterium 0 1 2 D D 1
Lactobacillus 0 1 1 0 +/- 2
Propionibacterium 2 1 +/- +/- +/- 1
D:Desconocido; 0: No se encuentra o raro; +/-: irregular; 1: por lo común presente; 2 :
Presente en grandes cantidades
CUADRO N°2: Muestras que no deben cultivarse en medios para anaerobios
HISOPADOS FARÍNGEOS O NASOFARÍNGEOS

■ Hisopados gingivales
■ Muestras broncoscópicas o esputo
■ Contenido gástrico, contenido de intestino delgado, heces, hisopados rectales, fístulas
colonocutáneas
■ Superficies de úlceras por decúbito, hisopados de muestras de costras de
abscesos,revestimientos mucosos
■ Materiales adyacentes a la piel o las mucosas
■ Orina de micción espontánea
■ Hisopados cervicales o vaginales
MATERIALES
▪ Placas con agar Chocolate ▪
Jarra anaerobia
RESULTADOS
58
PRÁCTICA Nº 9
CULTIVO DE MUESTRAS CLÍNICAS: UROCULTIVO Y COPROCULTIVO
OBJETIVOS
▪ Conocer el procedimiento para el cultivo de una muestra clínica.
▪ Identificar los microorganismos más frecuentes causantes de patologías clínicas.
▪ Conocer las condiciones para una adecuada toma de muestra para cultivo de una
muestra clínica.
■ CULTIVO DE ORINA: UROCULTIVO
La infección del tracto urinario (ITU) , se define como la presencia y multiplicación de

microorganismos en el tracto urinario con invasión de tejidos adyacentes. La presencia de
leucocitos en la orina , indica una respuesta inflamatoria del tracto urinario, la mayoría de las
veces debido a una invasión tisular por bacterias. Por lo general la piuria, está presente en las
ITU , por lo que se le considera un criterio diagnóstico para ésta enfermedad.
La mayoría de las ITU son causadas por bacilos Gram negativos de las enterobacterias ,
siendo la Escherichiacoli y Klebsiellasp, los más frecuentemente aislados , en infecciones no
complicadas. También pueden ser causa de ITU otros bacilos Gram negativos como
Proteussp ,Enterobactersp y Pseudomonaaeruginosa sobre todo en pacientes sometidos a
instrumentación, portadores de catéteres urinarios, con anomalías anatómicas o funcionales
del tracto urinario y en pacientes hospitalizados.
Entre las bacterias Gram positivas pueden estar Staphylococcusepidermidis y

Enterococcussp. En la mayoría de las ITU , se recupera un único microorganismo en la orina.
La presencia de más de una especie bacteriana puede deberse a una contaminación de la
muestra o pacientes con infecciones complicadas como por ejemplo litiasis , abscesos renales
o sondaje prolongado.
El diagnóstico definitivo de la ITU se hace mediante el cultivo de orina :urocultivo . Hay que
considerar que por cuidadosa que sea la técnica de toma de muestra ( salvo punción
suprapúbica) , es difícil excluir la contaminación de la orina con las bacterias del tramo distal
de la uretra , lo que puede causar interpretaciones erradas.
La orina de micción media es la más recomendable para el urocultivo. En pacientes femeninas

es recomendable el lavado de genitales externos, en el paciente masculino retraer la piel del
prepucio. La primera parte de la micción casi siempre estás contaminada con la flora
bacteriana uretral, por lo cual se debe descartar . La micción media debe recogerse en un
envase estéril. Se recomienda obtener la primera muestra de orina de la mañana , donde se
encuentra mayor número de bacterias.
El cultivo de orina se realizará para identificar y cuantificar el número de bacterias presentes

por mililitro en la orina, lo que se expresa en unidades formadoras de colonias (UFC) . La
muestra de orina debe enviarse el laboratorio en el plazo máximo de 2 horas a temperatura
ambiente, puesto que la orina es un buen medio de cultivo para muchas bacterias y la
multiplicación de los gérmenes
entre el momento de la toma de muestra y el cultivo, alterará los resultados.
Es recomendable que en todas las muestras de orina para urocultivo , se realice un examen
microscópico cuantitativo , para determinar el número de leucocitos por milímetro cúbico.
59
MATERIALES
▪ Frasco estéril de 100 ml

▪ Asa de siembra calibrada 0,01ml
▪ Pipetas graduadas de 1ml estériles
▪ Placas con agar Mac Conkey y Eosina azul de metileno
▪ Láminas portaobjetos , laminilla
▪ Equipos de coloración para tinción de Gram
▪ Centrífuga y microscopio
METODOLOGÍA
▪ Evitar la contaminación de la muestra, utilizando equipos estériles: frascos, pipetas,

placas de Petri, tubos de pruebas estériles.
▪ Examen directo:
• Centrifugar aproximadamente 10 ml de orina por tres (3) minutos a 3 000 rpm y
luego decantar el sobrenadante y observar el sedimento al microscopio a lente de
40X
▪ Cultivo
▪ Con el asa de siembra calibrada : 0,01 ml, previa agitación de la muestra , tomar
una muestra con el asa y sembrar por estrías en agar Mac Conkey, previamente
dividida en cuatro cuadrantes , empezando las estrías por el primer cuadrante y
sin esterilizar el asa continuar la siembra en el segundo, tercer y cuarto
cuadrante.
▪ Rotular la placa e incubar 24 horas a 37º C.
RESULTADOS
Realizar la lectura de la placa y a partir de una colonia bien aislada realizar las pruebas
bioquímicas para la diferenciación.
60
Realizar el contaje de colonias para obtener el recuento total de UFC/ml.
Sedimento urinario Agar Mac Conkey

Simmons
■ CULTIVO DE HECES: COPROCULTIVO
La diarrea puede definirse como el proceso de eliminación frecuente de heces, disminución de

su consistencia o ambas cosas. El diagnóstico etiológico se realiza mediante el cultivo de los
microorganismos presentes en la materia fecal : Coprocultivo , realizándose primero el
aislamiento y luego la identificación de las bacteria presentes en las heces.
Las bacterias causantes de diarreas más frecuentes son :Salmonella, Shigella y
Escherichiacolienteropatógena .También puede producirse cuadros diarreicos por :
Campylobactersp, Yersiniaenterocolítica ,Vibrio cholerae, Staphylococcusaureus y
Clostridiumdifficile.
61
Para realizar este procedimiento se requiere que la muestra se colecte en el curso de la
enfermedad, antes de iniciar tratamiento y que se deposite en un frasco estéril, procurando no
mezclarla con la orina. Si esto no es posible es conveniente conservar la muestra en un medio
de transporte adecuado manteniendo en refrigeración hasta su siembra.
Muestras inaceptables:
▪ Muestras no conservadas de más de 4 a 6 horas.
▪ Muestras múltiples el mismo día
▪ Muestras contaminadas con orina.
METODOLOGÍA
▪ Examen Directo
El examen microscópico directo de las heces permite la observación de polimorfonucleares, lo
que sugiere la infección de por un patógeno invasivo.
Examen en fresco y/o tinción de Azul de metileno de Loeffler.
Tinción de Gram : permite observar polimorfonucleares y flora predominante.
▪ Inoculación
El coprocultivo se realiza a partir de muestras recién emitidas de preferencia, de las cuales se
inoculan los medios de cultivo.
•Medios diferenciales
Para diferenciar a los bacilos entéricos fermentadores de lactosa (L+) de los no fermentadores
de lactosa (L -), e inhibir el crecimiento de la flora Gram positiva aerobia: agar Mac Conkey,
agar Eosina azul de metileno, agar Endo.
•Medios selectivos
Para inhibir el crecimiento de la mayoría de las enterobacterias y permitir el crecimiento de
Salmonella spp y Shigellaspp : agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) y agar Salmonella –
Shigella (SS)
•Medio líquido
Utilizar medio Selenito F para suprimir el crecimiento de la flora normal durante las horas
iniciales de incubación. Se resiembran en medio sólido a partir de las 6 horas. Este medio de
cultivo es fundamental para el estudio de portadores asintomáticos.
•Medios especiales
Vibrio spp
Medio de enriquecimiento: agua peptonada alcalina a partir de 6 horas ,subcultivar en agar
Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sucrosa (TCBS)
Medio selectivo :TCBS
Campylobacter medio selectivo : medio CAMP
MATERIALES
•Muestra de heces
•Placas de Petri con agar SS, EMB
•Tubos con caldo Selenito
•Láminas portaobjetos y laminillas
•Asas de siembra
•Tubos con medios diferenciales o bioquímicos.
62
RESULTADOS
Realizar la lectura de los medios de cultivo y las colonias sospechosas , realizar las pruebas
bioquímicas para diferenciar las especies de enterobacterias.

Simmons
■ CULTIVO DE SANGRE: HEMOCULTIVO
La detección de microorganismos viales en muestras de sangre tiene gran importancia

diagnóstica.
Cuando bacterias u hongos se multiplican a una razón que supera la capacidad del sistema
retículoendotelial del torrente sanguíneo , se produce bacteriemia y fungemia. Bacteriemia
63
persistente o crónica ocurre cuando no se ha podido localizar o drenar adecuadamente, el
foco de la infección.
La entrada directa de bacteria al torrente sanguíneo ocurre en infecciones

intravascularescomo : endocarditis, fístulas arteriovenosas, aneurismas micóticos, flebitis
supurativas, catéteres intravenosos infectados y arteriales permanentes. Es importante
comprender las circunstancias en que puede desarrollar una bacteriemia para planificar los
métodos de diagnóstico así como la interpretación de los resultados. Las fuentes de
bacteriemias son : sistema genitourinario 25 %, sistema respiratorio 20 % , abscesos 10%,
heridas quirúrgicas5 % , otros sitios conocidos 10 % y sitios desconocidos 25 %.
Siempre que exista una razón para sospechar de bacteriemia se debe practicar el cultivo de la
sangre, periférica o medular. Ya que en muchas ocasiones solo se puede establecer el
diagnóstico mediante este procedimiento. El aislamiento de un microorganismo de los
hemocultivos es transcendente porque establece el diagnóstico etiológico de la bacteriemia y
permite la elección del tratamiento.
Sepsis agudas, osteomielitis, meningitis , neumonía , pielonefritis: en estos casos el

hemocultivo debe considerarse un procedimiento de urgencia.
Bacteriemia continua de origen intravascular como endocarditis, infecciones asociadas a
catéteres , de origen desconocido, con sospecha de fungemia e inmunodeprimidos, la muestra
se puede tomar en cualquier momento.
Bacteriemias intermitentes: lo ideal es realizar la prueba cuando el paciente presenta
escalofríos o poco después o durante del pico febril. Entre el 14 y 25 % de los pacientes
hospitalizados, tienen sospecha de bacteriemia y en un 14 % de los casos esta prueba
establece el diagnóstico.
INDICACIONES
• Fiebre alta aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar con
hipotermia y deterioro general, shock no explicado, infecciones localizadas,
leucopenia, leucocitosis o trombopenia no relacionada con procesos hematológicos .
• Siempre se deben realizar en un mínimo de dos (2) horas.
• Nunca debe refrigerarse antes de su envío , puede conservarse en estufa.
MATERIALES
Cultivos en medios Ruíz -Castañeda
METODOLOGÍA
Se observarán los medios usados para hemocultivo.
RESULTADOS
Grafique lo observado en la práctica.
■ EXUDADOS VAGINALES (exocervicales)

La mucosa vaginal tiene una flora microbiana normal , cuyo crecimiento y consideración son
importantes para el estudio microbiológico de las infecciones vaginales. Se pueden considerar
tres situaciones :
• Conocer cuando se altera el equilibrio de esta flora colonizante
• Búsqueda de agentes exógenos , trasmitidos normalmente por vía sexual
• Detección de portadoras de determinados microorganismos
La mayoría de las situaciones clínicas que pueden ser objeto de estudios microbiológicos para
el aislamiento o visualización del agente etiológico son :
64
• Vulvovaginitis : agentes etiológicos más frecuentes : Cándida spp , principalmente C.
albicans; Trichomonasvaginalis y virus Herpes simple.
La presencia de un cultivo puro de otros microorganismos observados en tinción de Gram con
leucocitos , puede tener significación.
• Vaginosis : desde el punto de vista microbiológico se caracteriza por la ausencia o

disminución de la flora mixta compuesta por Gardnerellavaginalis, anaerobios (Mobilluncus,
Bacteroides, cocos anaerobios) y Mycoplasmahominis.
• Infección gonocócica : la endocervicitis gonocócica cursa con leucorrea , el exudado vaginal

no es la muestra adecuada para el diagnóstico por lo que se recomienda la obtención de
exudado endocervical.
Tipos de estudios microbiológicos

•Cultivo bacteriano
•Cultivo de levaduras
•Despistaje de Streptococcusagalactiae
•Cultivo de virus Herpes simple ya que requiere de toma de muestra y medio de transporte y
cultivos especiales, se realiza por petición expresa del clínico.
Toma de muestra
• No debe usarse antiséptico previo a la toma de la muestra . Si se utiliza espéculo,

lubricar con agua caliente.
• Se recomienda tomar dos (2) hisopados .
• Se introduce un hisopo estéril en la vagina y se recoge la muestra de la zona de
mayor exudado o en su defecto del fondo del saco vaginal posterior. Se introduce el
hisopo en el medio de transporte.
• El envío de la muestra al laboratorio debe de ser de inmediato siempre que sea
posible. Cuando no se pueda procesar la muestra de inmediato, se mantendrá en
refrigeración o a temperatura ambiente.
• Si se sospecha de infección gonocócica, no refrigerar la muestra.
• Tiempo máximo de procesamiento con medio de transporte : 24 horas.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Uno de los hisopos se empleará para el examen microscópico y el otro para el cultivo.
Examen microscópico : es el único método aceptado para el diagnóstico microbiológico de la

vaginosis bacteriana. Se hará una extensión del hisopo en lámina y tinción de Gram.
Cultivo : se pueden establecer diferentes combinaciones de medios en función de la

orientación diagnóstica : agar Sangre en atmósfera de CO2 , agar Chocolate en atmósfera de
CO2, MacConkey, agar Thayer Martin en atmósfera de CO2, medio para Gardnerella en
atmósfera de CO2 , Sabouraud con antibiótico u otro medio para Cándida, caldo para cultivo de
Trichomonavaginalis.
Examen de la muestra
Examen microscópico : en el exudado vaginal normal se observará flora regional con

predominio de morfotipoLactobacillussp y células epiteliales
Presencia de leucocitos
Presencia de levaduras o pseudohifas
Presencia única o abundante , de cualquier otro microorganismo
65
Exudado característico de vaginosis bacteriana
Presencia de células clue : células epiteliales recubiertas por bacilos o cocobacilos Gram
variables.
Ausencia o escasos leucocitos.
Flora mixta alterada.
Examen en medios de cultivo
El examen en medios de cultivo : examinar todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no hay
crecimiento de patógenos , incubar hasta la 48 horas , a excepción del cultivo en agar Mac
Conkey que se descarta a las 18 horas. El agar Thayer Martin se incubará hasta 72 horas si
es negativo.
•Agar Sangre : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial

Streptococcuspyogenes o Streptococcuspneumoniae.
•Agar Chocolate : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial
Haemophilussp.
•Agar Mac Conkey : presencia de enterobacterias.
•Agar Thayer Martin : presencia de colonias grises brillantes de distintos tamaños,
oxidasa positivo, compatibles con gonococo.
•Medio Gardnerella : presencia de colonias β hemolíticas puntiformes en gran
cantidad posiblemente Gardnerellavaginalis.
•Agar Sabouraud : presencia de levaduras.
■ SECRECIÓN URETRAL
La uretritis es el síndrome más común dentro de las Enfermedades de Transmisión Sexual

(ETS), aunque muestra un claro descenso en las últimas décadas en relación con otras ETS,
tanto en España como en otros países desarrollados. Atendiendo a su etiología se clasifican
en uretritis gonocócica y no gonocócica (UNG) , siendo estas últimas las más frecuentes en
países desarrollados.
N. gonorrhoeae es responsable en nuestro medio de menos del 25 % de todos los episodios

de uretritis. Los restantes son causados por C. trachomatis, Ureaplasmaurealyticum y por un
número variable de otros potenciales patógenos en los que la asociación causa-efecto con la
uretritis está menos aclarada . La asociación de más de un patógeno como causa de la
uretritis es más que anecdótica y la más frecuente de ellas es la asociación de C. trachomatis
y N. gonorrhoeae. Un dato significativo es la presencia de T. vaginales como único agente
encontrado hasta en un 4 % de las
uretritis no gonocócicas. Cuadros de uretritis pueden estar causados por la presencia de
condilomas intrauretrales.
La gonorrea usualmente se desarrolla a los 2 a 6 días tras la exposición, en tanto que la UNG
es variable, desde 1 a 5 semanas. Tanto las uretritis gonocócicas como las no gonocócicas
producen supuración uretral, disuria y escozor.
El diagnóstico de uretritis se establece si al menos se dan de los siguientes supuestos
▪ Síntomas : historia de secreción uretral y/o disuria
▪ Demostración con tinción Gram : más de 5 leucocitos polimorfonucleares por
campo de 1 000 aumentos en el examen directo de la secreción uretral.
Los pacientes con síntomas de uretritis, sin secreción, visible, deben ser
66
examinados, pidiéndoles que no miccionen en las 4 a 8 horas previas a la toma de muestra .
Se obtienen los 5 a 10 primeros ml de orina y tras la centrifugación a 400 rpm se examinan al
microscopio de 400 aumentos. La presencia de más de 15 leucocitos polimorfonucleares por
campo confirma el diagnóstico de uretritis.
Los síntomas de la uretritis gonocócica puede permanecer hasta más de 7 días, por ello la
uretritis postgonocócica se suele diagnosticar después de transcurrido este período. En el
examen con tinción de Gram, la presencia de diplococos Gram negativos (DGN) intracelulares
, establece el diagnóstico de uretritis gonocócica. La presencia de células inflamatorias en el
exudado uretral en ausencia de diplococos Gram negativos y cultivo negativo para establecer
el diagnóstico de UNG.
El éxito del diagnóstico microbiológico de la uretritis gonocócica depende de la correcta

obtención, transporte y procesamiento de muestras. En cada muestra deben emplearse dos
hisopos, uno para el cultivo y otro para la extensión del exudado uretral para realizar la tinción
de Gram. Las muestra para cultivo deberán inocularse en medios selectivos (Thayer Martin
modificado, Martin- Lewis ) e incubarse de modo inmediato a 35 a 37ºC durante 72 horas en
una atmósfera de 3 a 10 % de CO2 y humedad. Cuando esto no sea posible , es necesario
inocular las muestras en medio de transporte (Stuart o Amies ) .
Examen microscópico : en la secreción uretral se debe observar presencia de células y

bacterias, en especial diplococos Gram negativos intra y extracelulares.
Evaluar : presencia de leucocitos polimorfonucleares.
Examen en medios de cultivo : examinar, todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no hay
crecimiento de patógenos , incubar hasta la 48 horas. El agar Thayer Martin se incubará hasta
72 horas si es negativo.
Agar Sangre :Streptococcuspyogeneso Streptococcuspneumoniae
Agar Chocolate :Haemophilus sp, Thayer Martin : gonococo.
Pruebas bioquímicas : a las colonias sospechosas realizar las pruebas bioquímicas : Prueba
de oxidasa y fermentación de carbohidrato para Neisseria.
67
PRÁCTICA Nº 10
DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTÁNEAS
OBJETIVOS
▪ Describir las características de las colonias de hongos causantes de las micosis
superficiales y cutáneas en cultivos con agar glucosado de Sabouraud y
microscópicamente.
INTRODUCCIÓN
La colonización e invasión en mayor o menor grado de una especie fúngica se denomina

“micosis”. Dentro de las micosis superficiales se incluyen las causadas por hongos que
colonizan la superficie queratinizada de la piel o pelo. Varios son los agentes etiológicos que
pueden colonizar la piel.
Las infecciones cutáneas incluyen una variedad de procesos en los que se encuentran
afectados piel y anexos (pelo y uñas). La infección puede estar limitado a la capa córnea o
llegar a los estratos más profundos , sin invasión linfática. Producidos por los hongos
denominados dermatofitos y las enfermedades por ellos producidas dermatofitosis. La
dermatomicosis incluye a cualquier proceso micótico de la piel y el de dermatofitosis se
reserva para los producidos por hongos dermatofitos.
MICOSIS SUPERFICALES
▪ Piedra Negra
Se caracteriza por la presencia de nódulos en la porción extrafolicular del pelo, pétreos y de
color negro. El agente causal es Piedra hortae
▪ Piedra blanca
Muestra nódulos blanco-grisáceos , que son masas agrupadas de hifas y pueden encontrarse
en la parte distal o central de pelo axilar , pubiano y crural. Agente causal
:Trichosporumcutaneo o T. beigelii.
▪ Tiña negra
Es una infección superficial de la piel debido a la colonización de Hortaeawerneckii. Se
caracteriza por la presencia de manchas negro-marronáceas, no descamativas e indoloras ,
frecuente en las palmas , dedos y plantas , que en otro lugar de la piel.
▪ Pitiriasis versicolor
Caracteriza lesiones furfuráceas a veces papulomatosas o eritematosas, confluentes con
pigmento variable (hipo o hiperpigmentadas). Tiene como agente causal a Malasseziafurfur, se
localiza preferente en el tronco sobre todo hombros y espalda . Al examen microscópico
detectan los grupos de levaduras con hifas
MICOSIS CUTÁNEAS
Dermatomicosis
Micosis producida por Cándida albicans, hongo oportunista. Agente causal de intertrigos
(submamario o inguinal) , eczema de pañales, onicomicosis con paroniquia y granuloma
candidiásico., Además de C. albicans también pueden presentar onicomicosisCándida
stellatoidea, C.tropicalis, C. guillermondi y C. parapsilosis.
Las preparaciones teñidas con Gram , muestran levaduras Gram positivas redondas u ovales ,
con brotes de blastosporas de 3 a 4 μm acompañadas de pseudohifas de 3 a 10 micras de
longitud.
68
La mayoría de los medios de cultivo bacterianos son satisfactorios para el aislamiento de
Cándida; de todas las formas se recomienda efectuar la siembra en medio de Sabouraud con
antibióticos (cloranfenicol).Los medios que contienen actidiona (cicloheximida) inhiben el
crecimiento de algunas especies .
La incubación se realiza a temperatura ambiente (25 a 30º C) cuando se trata de medios con
inhibidores y a 37ºC en el caso de medios enriquecidos exentos de sustancias inhibidoras. Al
cabo de 24 a 48 horas se puede observar las colonias
características de color blanco o crema, opacas, elevadas, lisas, brillantes o mates de 1 a3
mm de diámetro. La prueba de filamentación y producción de clamidosporascaracterísticas ,
son muy sencillas y útiles para la identificación de C. albicans.
Dermatofitosis
Es una infección fúngica de los tejidos queratinizados (piel, pelo, uñas) que ocurre en los seres
humanos y animales producida por un grupo de hongos estrechamente relacionados
denominados “dermatofitos”.
Los agentes etiológicos de las dermatofitosis se clasifican en tres géneros :Epidermophyton ,

Microsporum y Trichophyton. El diagnóstico se puede hacer mediante :
▪ Examen directo
Para el estudio micológico se procede a tomar la muestra, que en este caso sería , pelos,
escamas de la piel o muestras ungueales que se toman con pinzas o bisturí estéril del centro o
borde de la lesión y se colocan en una lámina. Se transportan entre dos láminas portaobjetos
limpias y se observan directamente al microscopio, con una gota de hidróxido de potasio al 10
% (KOH ) cubierto con una laminilla.
Al microscopio se pueden observar las artroconidias dentro del pelo (endotrix) o en forma de
vaina alrededor del pelo (ectotrix).
▪ Cultivo
Las muestras se siembran en SGA adicionando cicloheximida, que inhiben los hongos
saprofitos. La identificación se hace sobre la base del aspecto macroscópico de las colonias
entre ellos la producción de pigmento. Luego las características microscópicas , observación
de macroconidias y microconidias y elementos accesorios sirven para definir cada género y
especie.
Observar el desarrollo de los hongos en estudio y anotar las características de sus colonias
desarrolladas en SGA.
MATERIALES
Tubos sellados de SGA con cultivos de :
Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans
Microsporum gypseum, Microsporum canis
Preparaciones en láminas portaobjetos coloreadas con azul de lactofenol.
69
Cándida
albicans
Trichophytonm
entagrophytes
Trichophytonr
ubrum
Trichophyton
tonsurans
Microsporum
gypseum
70
METODOLOGÍA
Examinar al microscopio las láminas preparadas y esquematizar sus observaciones.
71
PRÁCTICA Nº 11
DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTÁNEAS, SISTÉMICAS Y OPORTUNISTAS
DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTÁNEAS
OBJETIVOS
▪ Identificar microscópicamente los agentes etiológicos de las micosis subcutáneas

▪ Describir las características morfológicas de las colonias de los hongos causantes de
las micosis subcutáneas.
INTRODUCCIÓN
Se consideran en este grupo las infecciones fúngicas que afectan el tejido subcutáneo, dermis
y epidermis, causadas por hongos exógenos, saprofitos , cuyo hábitat es el suelo y las plantas.
Las infecciones más frecuentes son :
▪ La esporotricosis debida al Sporotrixschencki, que se produce habitualmente por la

penetración en la piel de astillas, espinas o tierra contaminada; una vez establecida la
infección tiende a permanecer localizada en el tejido subcutáneo y a ser muy persistente. Se
caracteriza por una lesión ulcerada en el punto de inoculación , que va seguida de la
formación de nódulos y abscesos múltiples que siguen las vías de drenaje de los linfáticos
superficiales.
▪ La cromomicosis (cromoblastomicosis), debido a Fonsecaeapedrosoi, Cladosporiumcarrioniiy

Phialophoraverrucosum, que se caracteriza por el desarrollo de una pápula en el sitio de la
inoculación, que más tarde se extiende formando lesiones verrugosas o tumorales ,
semejantes a una coliflor, puede haber infección secundaria y ulceración . Las lesiones , por lo
general, están limitadas a los pies y las piernas, pero pueden afectar la cabeza, la cara, el
cuello y otras superficies del cuerpo; también puede haber abscesos cerebrales.
▪ El micetoma (maduromicosis), debido a Nocardia y Streptomyces, que se caracteriza por

lesiones destructivas localizadas, granulomatosas y supuradas, que habitualmente se
localizan en los pies y las manos. Las lesiones se caracterizan por edema, coloración
purpúrea y deformación tumoral del tejido subcutáneo, con la presencia de surcos sinusales
que drenan pus, que contiene gránulos amarillentos o negros. La infección progresa
gradualmente, atacando los huesos , los músculos y otros tejidos adyacentes, hasta que por
último obliga a la amputación, a veces se produce la invasión más extensa afectando el
cerebro y otros órganos internos .
MATERIALES
▪ Tubos sellados de SGA con cultivos de:
Sporotrixschenki
Phialophoraverrucosum
▪ Preparaciones en láminas coloreadas con azul de lactofenol.
▪ Microscopio
72
METODOLOGÍA
Examinar al microscopio las láminas preparadas y esquematizar sus observaciones.
73
DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS Y OPORTUNISTAS
OBJETIVOS
▪ Identificar microscópicamente los agentes etiológicos de las micosis sistémicas y
oportunistas.
▪ Describir las características morfológicas de las colonias de los hongos causantes de
las micosis sistémicas y oportunistas.
INTRODUCCIÓN
Las micosis sistémicas, son infecciones fúngicas que afectan varios órganos y tejidos. Se
dividen en dos grupos :
▪ las producidas por especies consideradas patógenas con carácter endémico, este
tipo de micosis se transmite por inhalación, ingesta o traumatismos . Blastomicosis
yParacoccidioidomicosis
▪ las producidas por especies oportunistas . Estas patologías se dan en huéspedes
inmunodeprimidos (con transtornos endocrinos, inmunodefiencias, enfermedades
oncohematológicas, alteraciones metabólicas y anatómicas ,
drogadictos endovenosos, pacientes bajo tratamiento prolongado con corticoides o
citostáticos , sometidos a cirugía, dializados , quemados transplantados y
cateterizados) , son causadas por hongos saprofitos del ambiente o comensales del
cuerpo humano. Por ejemplo Cándida y Criptococcus
La infección se adquiere por inhalación de conidios en la fase micelial , desarrollándose en el

huésped un foco pulmonar primario. En
caso del que paciente presente inmunodeficiencia puede producirse una diseminación
sistémica.
El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante la observación de la fase levaduriforme en

los siguientes productos : expectoración, secreción de lesiones mucocutáneas y material de
biopsia. La fase levaduriforme se puede obtener en cultivos enriquecidos, incubados a 37ºC.
Estas pueden ser:
▪ Blastomicosis :Blastomyces dermatitis

La infección comienza habitualmente en los pulmones y se difunde por vía
hematógena causando lesiones destructivas focales en los huesos, piel, próstata y
vísceras, en general no se afecta el tubo digestivo.
Las lesiones cutáneas son particularmente manifiestas , parecen originarse como

metástasis a partir de las lesiones pulmonares primarias que se abren a la superficie
cutánea causando lesiones ulceradas y encostradas. Las lesiones se caracterizan por
inflamación granulomatosa, microabcesos y progresiva destrucción de los tejidos,
las calcificaciones son raras.
▪ Paracoccidioidomicosis o blastomicosis sudamericana (Paracoccidioidesbrasilensis)

Las primeras lesiones aparecen en las mucosa de la boca, o de la nariz y se difunden
por expansión directa, es decir a través de los límites cutáneo-mucosos, afectan la
cara, en ocasiones , la diseminación se produce a través de los tejidos linfáticos
incluyendo el bazo.
74
En el tubo digestivo las lesiones comienza en el tejido linfoide submucoso y puede
originar formación de úlceras e incluso perforaciones; pueden formarse abscesos
subcutáneos que por extensión a la superficie cutánea , puede producir lesiones
deformantes de gran tamaño, encrostadas o ulceradas. Las lesiones cutáneas
constituyen abscesos piógenos y lesiones inflamatorias granulomatosas.
▪ Histoplasmosis :Histoplasmacapsulatum
Causada por la inhalación de esporas que lo conduce a una infección pulmonar,
aparecen lesiones miliares distribuidas por todo el parénquima pulmonar y aumento
de tamaño de los ganglios linfáticos. La infección inicial es benigna puede pasar
completamente inadvertida o manifestarse como un infección respiratoria
autolimitada.
En un pequeño número de individuos la enfermedad progresa se disemina y causa

lesiones en prácticamente todos los tejidos y órganos, aparece fiebre y postración,
así como el aumento del tamaño de hígado , bazo y ganglios linfáticos simulando
tuberculosis miliar ; en ocasiones puede evolucionar como una enfermedad
pulmonar crónica con cavitación, simulando la tuberculosis pulmonar crónica. Las
lesiones de los tejidos se caracterizan por la existencia de una inflamación
granulomatosa.
▪ Coccidiomicosis :Coccidioidesimmitis
La infección se establece por inhalación de esporas transmitidas por el aire
aproximadamente el 60 % se pone de manifiesto únicamente por la adquisición de
una hipersensibilidad de tipo retardado frente a los antígenos del hongo, en un 40 %
se produce neumonitis aguda, acompañada con frecuencia de pleuresía y varias
erupciones cutáneas, alrededor del 5 % desarrollan una enfermedad pulmonar
crónica con cavitación que se asemeja a la tuberculosis pulmonar y conduce
ocasionalmente a la calcificación; en menos del 1 % aparece una diseminación con
lesiones granulomatosas asépticas en muchos órganos y tejidos, entre ellos, la piel,
huesos articulaciones y meninges.
Las lesiones de la neumonitis aguda son histológicamente semejantes a las

causadas por bacterias piógenas , pero en la enfermedad pulmonar crónica y en las
formas diseminadas , la inflamación es granulomatosa.
▪ Criptococosis
Esto ocurre en particular en sujetos con inmunodeficiencia de las células T y se
debe a Criptococusneoformans , este hongo se caracteriza por ser una levadura
encapsulada. Su hábitat es el suelo contaminado con materia fecal de aves.
La criptococosis es una de las enfermedades que sirve para definir el estadio SIDA
en la enfermedad del virus de Inmunodeficiencia Humana. Dentro de las formas
clínicas existe : Criptococosis pulmonar, del SNC, diseminada , cutánea y
mucocutánea.
El producto más frecuente de analizar es el LCR , en el que se observan las típicas

levaduras capsuladas que se destacan por contraste negativo mediante emulsión
con tinta china.
▪ Candidiasis :Cándida spp

Las infecciones caudadas por Cándida son muy variadas, este hongo de tipo
levaduriforme puede llegar a ser patógeno en humanos y animales en los cuales vive
en estado saprofítico . La cavidad bucal y es resto del tracto gastrointestinal son los
territorios preferentes donde C. albicans se encuentra en el 20 % de las personas y
75
en menor proporción otras especies de Cándida.
Por lo menos cinco condiciones favorecen el surgimiento de candidiasis :
▪ Cambios fisiológicos como diabetes y embarazo

▪ Uso prolongado de antibióticos o fármacos antitumorales e inmunosupresores
▪ Maniobras diagnósticas y terapéuticas agresivas : cateterismo, sondajes
▪ Debilidad general y/o desnutrición
▪ Infección por el virus de la Inmunodeficiencia Humana y drogodependencia.
El diagnóstico de la Candidiasis en el laboratorio incluye la demostración directa de Cándida

mediante coloraciones Giemsa ,Gram en muestras clínicas y cultivo
MATERIALES
▪ Tubos de SGA con cultivos de :
▪ Histoplasmacapsulatum
▪ Cándida albicans
▪ Preparaciones en láminas con azul de lactofenol
▪ Microscopio
METODOLOGÍA
Observar de las muestras macroscópicamente

Realizar preparaciones en láminas con azul de lactofenol y observar al microscopio
(10x y 40x)
76
Tomado de Microbiología Tomo II de Granados 2ª edición
Tomado de Micología Médica Ilustrada Arenas 2ª edición
77
78
79
Tomado de Diagnóstico Microbiológico de
Bailey y Scott 11ª edición
80
PRÁCTICA Nº 12
DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO
OBJETIVOS
▪ Familiarizar al estudiante con las diferentes técnicas de aislamiento de virus

aprovechando las propiedades que presentan
▪ Observar y caracteriza morfológicamente células cultivadas
▪ Explicar la importancia de las técnicas de cultivo de tejidos en virología y en otras
disciplinas científicas.
La demanda de los servicios de los laboratorios de virología clínica, han aumentado en las
últimas dos décadas debido a la disponibilidad comercial de reactivos de alta calidad, el uso
por parte de los médicos de fármacos antivirales específicos, el desarrollo de técnicas de
diagnóstico rápido y la aplicación de los procedimientos de cultivo celular para virología al
diagnóstico de otras enfermedades como infección genital por Chlamydia.
Las enfermedadesvirales que requieren diagnóstico de laboratorio son las enfermedades
de transmisión sexual, las diarreas, las enfermedades respiratorias en niños y adultos, las
meningitis asépticas, las enfermedades congénitas y las infecciones en huéspedes
inmunodeprimidos.
CULTIVO CELULAR
Los cultivos celulares comenzaron a principio del siglo XX, con cultivos de órganos
completos y luego con métodos de células individualizadas : cultivos de células primarias
(células somáticas de un animal de experimentación o tomadas de un paciente humano (que
pueden mantenerse en cultivo durante un período breve de tiempo) o líneas celulares
inmortalizadas, las cuales en condiciones adecuadas pueden continuar creciendo en cultivo
indefinidamente.
En 1952 Renato Dulbecco fue el primero que cuantificó virus animales, utilizando un ensayo
de placas de lisis, técnica para la cual se preparan diluciones del virus con las que se infectan
células crecidas en monocapas, que luego se recubren con agar blando para impedir la
difusión del virus. Éste destruye las células en focos localizados que se observan al teñirse la
monocapa.
MECANISMOS DE LESIÓN CELULAR
La infección viral origina una variedad de cambios que se detectan mediante el examen
visual o bioquímico de las células infectadas, estos cambios se deben a la producción de
proteínas y ácidos nucleicos víricos, y a las alteraciones biosintéticas de las células. En las
células infectadas por virus se reconocen cambios fenotípicos comunes, denominados efectos
citopáticos del virus , los cuales son :
● Forma alterada : las células adherentes que normalmente están pegadas a otras células ( in
vivo ) o a un sustrato artificial ( in vitro ) pueden adoptar una morfología redondeada diferente
de su apariencia aplanada normal . Se eliminan de la células los procesos de ampliación
implicados en la adhesión y la movilidad.
● Despegamiento del sustrato : para las células adherentes , esta fase de daño celular sigue
de la anterior. Ambos efectos son causados por la degradación parcial o la disrupción del
citoesqueleto, el cual se encarga de mantener la forma de la célula.
●Lisis : es el caso más extremo, la célula entera se rompe, se pierde la integridad de la

membrana y la célula se puede hinchar por la absorción de líquidos extracelulares y
81
finalmente estalla. Éste es un caso extremo de daño celular, no todos los virus causan este
efecto, aunque pueden causar otros efectos citopáticos.
La lisis es beneficiosa para un virus ya que constituye un método para liberar nuevas
partículas víricas de una célula infectada.
●Fusión de membranas : las membranas de las células adyacentes se fusionan originando

una masa de citoplasma que contiene más de un núcleo : sincitio, o dependiendo del número
de células que se fusionan : célula gigante. Las células fusionadas tienen vida corta y luego se
lisan.
●Permeabilidad de membranas : diversos virus causan un aumento en la permeabilidad de

membranas, permitiendo la entrada de iones extracelulares como el sodio. La traducción de
algunos ARNm víricos es resístente a altas concentraciones de iones de sodio , permitiendo la
expresión de genes víricos a expensas de mensajeros celulares.
●Cuerpos de inclusión : son áreas de la células en las que se han acumulado componentes
víricos. Se trata frecuentemente de sitios de ensamblaje de viriones y algunas inclusiones
celulares consisten en acúmulos cristalinos de partículas víricas. No está claro si estas
estructuras dañan a la célula, pero frecuentemente están asociadas a virus que causan lisis
celular , como los herpesvirus.
●Apoptosis : la infección vírica puede activar la apoptosis ( muerte célular programada ),

mecanismo implicado en el crecimiento normal y el desarrollo de los organismos.
INMUNODIAGNÓSTICO
■ ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO
La prueba de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) o inmunoensayos ligados a

enzimas (EIAs) en la cual el antígeno o anticuerpo está adsorbido a una fase sólida ,
constituye uno de los primeros inmunoensayos enzimáticos primeramente descritos por
Engvall y Perlmann en 1971 y luego aplicados al diagnóstico microbiológico por Voller y
colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre las técnicas de inmunofluorescencia (IF) de su
mayor sensibilidad ya que , la enzima actúa catalíticamente y de forma objetivable , por lo que
es posible medir la densidad óptica de la coloración final. Las enzimas son seguras, de bajo
costo y estables, si se comparan con los radio-isótopos utilizados en radioinmunoensayo
(RIA).
En la actualidad estas pruebas están tomando un rol importante en los laboratorios
médicos y de investigación, porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es posible
realizar la identificación de muchos virus a nivel de género. Están reemplazando a los RIA en
muchos laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los problemas de manejo, eliminación
y corto tiempo de vida de los materiales radioactivos .
Debido a su objetividad, facilidad de automatización y posibilidad de trabajar con un gran
número de muestras, estos ensayos inmunoenzimáticos están reemplazando parcialmente a
técnicas en el laboratorio como :inmunofluorescencia y aglutinación.
Estos ensayos presentan tres piezas constantes que originan distintos tipos de EIA en
función de cómo se combinen : el analito (antígeno {Ag} o anticuerpo {Ac} ), el conjugado (de
antígeno o de anticuerpo) y el sustrato. Utilizan enzimas como marcadores inmunoquímicos
que permiten valorar las uniones antígeno-anticuerpo que se producen tras un periodo de
incubación, con la adición posterior de un sustrato.
● Fundamento
La prueba de ELISA se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser
de reactividad conocida. El color se genera por la interacción de un sustrato cromogénico y
una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se
coloca el antígeno en la fase sólida, como una capa de captura. Después de la reacción del
82
antígeno con el suero del paciente, la capa de detección puede ser un reactivo
antiinmunoglobulina clase específica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase
específicos
Dentro de los parámetros fisicoquímicos que intervienen en la unión del antígeno con el
anticuerpo tenemos:
▪ Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de átomos en la superficie de

las moléculas generado por un cambio eléctrico. Son fuerzas débiles presentes cuando la
proximidad del Ag y el Ac es grande.
▪ Fuerzas electrostáticas originadas por la fuerza de atracción entre moléculas de carga

iónica opuesta, como sucede con los grupos NH3+ (amoníaco)que reaccionan ávidamente con
el grupo COOH- (grupo carboxilo).
▪ Uniones por puentes de hidrógeno son de carga energética baja entre átomos
electropositivos de hidrógeno y átomos electronegativos de oxígeno o nitrógeno.
● Metodología
Los métodos de ELISA se dividen en :
■ ELISA directo : ensayo ELISA simple de dos capas

Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se
sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados e indican la
presencia de antígeno en la solución analizada. Se debe incluir controles negativos que serán
muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga la certeza
de la ausencia del antígeno buscado y controles positivos (soluciones donde se encuentra el
antígeno buscado, o bien se le ha añadido).
■ ELISA indirectoLas placas ELISA se preparan de igual forma que en el método directo, los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La
detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión
de dos o más anticuerpo secundarios por cada primario.
■ ELISA sándwich : ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos

Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo
anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la
que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una
solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de
antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la
amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
Fijación del Antígeno a la fase sólida :

La reacción inmunológica tiene lugar en la fase sólida, ésta puede ser de plástico, vidrio o
nitrocelulosa. Los más usados son los de plástico, dentro de éstos los de
poliestirenogammairradiados y los de cloruro de polivinilo ya que tienen mayor capacidad para
formar enlaces estables que los de poliestireno no tratados.
El antígeno diluido en buffer es adherido a la fase sólida por enlaces electrostáticos entre los
83
sitios activos del plástico y regiones de la proteína responsables de esta interacción. El buffer
puede ser carbonato a pH 9,6 o buffer fosfato salino ( PBS 1X ) a pH 7,4.
La estabilidad de los enlaces electrostáticos, el tiempo de incubación y la temperatura son

factores importantes a tener en cuenta para evitar pérdidas de las proteínas y que pueden
afectar la sensibilidad del ensayo.
▪ Reacción con anticuerpo :
La reacción del antígeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las
fisiológicas : pH 7,4, temperatura de 37ºC y concentración salina equivalente a 0.15M de
cloruro de sodio (NaCl). El tiempo puede variar entre 1 a 3 horas.
Moléculas no específicas en solución pueden adherirse a la fase sólida afectando el resultado

final del ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reacción un exceso
(0,1% a 1%) de una proteína inerte para que compita eficientemente por los sitios de unión
inespecíficos en la fase sólida. Esta proteína puede ser seroalbúmina bovina, caseína, suero
entero, gelatina u otros.
También es necesario añadir al medio Tween 20 (Monolaurato de polioxietilenosorbitán{

surfactante } )para evitar uniones inespecíficas de macromolécula. Por este motivo es
agregado en los tampones de dilución y de lavado.
▪ Adición del conjugado enzimático :
El conjugado enzimático se prepara por unión covalente de una enzima con el anticuerpo; esta
enzima puede ser peroxidasa de rábano (Horseradishperoxidase
{ HRP } ), fosfatasa alcalina (AlcalinePhosphatase { AP } ) o beta-galactosidasa. Los criterios a
tomar en cuenta en la selección de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad,
disponibilidad, viabilidad de conjugarla eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y
costo.
Las condiciones de reacción entre el conjugado y el complejo formado por la unión antígeno-
anticuerpo son similares a las descritas en la etapa anterior.
▪ Adición del sustrato:
La elección del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El

sistema AP hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de
color amarillo. El sistema HRP reduce al sustrato peróxido de hidrógeno produciendo oxígeno
que oxida a otros compuestos cromógenos tales como:
♦Tetrametilbenzidina (TMB) : la oxidación genera un producto de color azul oscuro.
♦ o-phenylenediamine (OPD): es oxidado a un producto coloreado que puede variar de color

naranja a pardo oscuro.
♦ Ácido azino-(3-etil)-benzo-sulfónico (ABTS) : la oxidación genera un producto que puede

variar del color al azul.
La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la
reacción.
La lectura se realiza en un espectrofotómetro a 405 nanómetros
84
PRUEBA RÁPIDA PARA VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA
Uno de los pilares básicos de la lucha contra el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida
(SIDA) es la detección precoz de las personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH). El diagnóstico precoz ofrece la posibilidad de beneficiarse de la terapia
antirretroviral en las etapas precoces de la infección, así como intentar modificar las conductas
que favorecen la transmisión del virus a otras personas.
♦ Descripción de las pruebas de detección rápida del VIH
Son ensayos de lectura visual que pueden realizarse con equipamiento mínimo y generan un
resultado en menos de 15 minutos en comparación con la prueba estándar de cribado con
técnicas de EIA, de las cuales no se dispone del resultado hasta al cabo de unas horas o días.
Tanto la prueba de detección rápida como el EIA detectan anticuerpos específicos del VIH.
Se han establecido los diferentes criterios que debería cumplir una prueba de detección rápida
del VIH:
▪ Presentar alta sensibilidad y especificidad (>99%)

▪ Ser reproducible
▪ Ser fácil de aprender, realizar e interpretar
▪ Ser precisa
▪ Ser de fácil almacenamiento
▪ No requerir equipamiento adicional
▪ No tener carácter invasivo
Durante la realización de las pruebas de detección rápida, se recomienda que los pacientes
reciban información y asesoramiento sobre la enfermedad y la infección. Si la prueba es
negativa, se considera un negativo definitivo a no ser que haya posibilidades de que se
encuentre en el período ventana de exposición (primeros 3 a 6 meses de post exposición) . Si
el resultado es positivo, se considera un resultado preliminar que debe confirmarse con
técnicas de EIA y con la prueba Western blot .
Los resultados indeterminados se deberían repetir en un mes. La mayoría de las pruebas de
detección rápida del VIH se comercializan con un equipo o kit que incluye todo lo necesario
para realizar la prueba y no requiere un equipamiento especializado. En general, disponen de
un control de procedimiento incorporado en el equipo o kit. Para la muestra, se puede utilizar
sangre entera (más fácil de realizar), plasma o suero, y los resultados se interpretan
visualmente.
♦ Capacidad diagnóstica de las pruebas de detección rápida del VIH
Es difícil realizar una comparación de la capacidad diagnóstica de las numerosas

pruebas de detección rápida comercializadas ya que son, muy distintas entre ellas. Los
principios de acción más frecuentes en estas pruebas son la aglutinación, la
inmunoconcentración(flowthrough), la inmunocromatografía(lateral flow) y la fase sólida
(solidphase).
El método de producción y de combinación específica de los antígenos varía entre las distintas
pruebas de detección. La mayoría incluye uno o más antígenos del virus VIH-1 (gp41, gp120,
gp160) y VIH-2 (gp36). Otros incorporan el antígeno core (p24).
Actualmente, existe controversia en la duración del período ventana entre 3 ó 6 meses. En
general, se recomienda el alta médica a los 6 meses después de una actividad de riesgo de
infección.
■ PRUEBA DE INMUNOFIJACIÓN DE DOT-BLOT
85
Prueba para la detección del VIH en la cual los antígenos virales se encuentran unidos a una
membrana de nitrocelulosa dentro de un contenedor plástico. Los antígenos utilizados son
recombinantes o sintéticos. Se utilizan conjugados de anti-inmunoglobulina ligados a una
enzima que se fija al anticuerpo del paciente. La adición del sustrato permite la visualización
del color en el papel.
Su ventaja y principal indicación es la posibilidad de identificación entre los dos tipos de virus .
Las pruebas son rápidas y fáciles de realizar, pero son costosas. Muchas producen resultados
en 5 ó 15 minutos.
TÉCNICAS DE INOCULACIÓN EN ANIMALES DE LABORATORIO

Este fue el primer método que se utilizó para el aislamiento de virus , demostrándose la
reacción positiva por la muerte y los cambios histológicos o clínicos. Existen factores negativos
en el uso de animales de laboratorio : el confinamiento de los mismos de tal manera que no se
pueda impedir una infección cruzada a otros animales y al personal de laboratorio, la
presencia de enfermedades víricas latentes en los animales de experimentación que pueden
activarse por el mismo trauma que supone la inoculación con la consiguiente interferencia a la
hora de la interpretación de los resultados .
Debe elegirse cuidadosamente el tipo y la edad del animal que va a utilizarse , así como la vía
de inoculación, ya que cada especie tiene su propia sensibilidad y cada virus sus propios
requerimientos respecto a un tipo de células . El animal más utilizado es el ratón de menos de
dos días de edad especialmente como animal de rutina con fines diagnóstico siendo el que
proporciona el principal método de aislamiento de los virus Coxsakie A.
► el ratón lactante se utiliza en virología para :
♦ Inocular por vía intracerebral (0,06 ml) :Herpes simple
♦ Inocular por vía subcutánea (0,06 ml) : infección por Coxsakie, Arbovirus y
Reovirus
♦ Inocular por vía intradérmica (0,02ml) virus Coxsakie
► el ratón adulto se utiliza :
♦ Inocular por vía intracerebral (0,03ml) o intraperitoneal hasta 2 ml de
encefalitis
♦ Inocular por vía intracerebral : rabia, coriomeningitis linfocitaria
♦ Inocular por vía intranasal( 0,05 ml): Influenza A,B y C
♦ Inocular por vía intraperitoneal o intracerebral para obtención de
inmunosueros.
► la cobaya se utiliza para :
♦ Inocular por vía intraperitoneal hasta 5 ml de coriomeningitis linfocitaria
♦ Inocular por vía intraperitoneal o intramuscular para obtención de
inmunosueros hasta un ml.
► el conejo se utiliza para :
♦ Inocular por vía intradérmica Herpes tipo B
♦ Inocular por vía intradérmica para la obtención de vacunas
♦ Inocular por vía intravenosa hasta 2 ml o intramuscular hasta 2 ml o
intraperitoneal hasta 2 ml para la obtención de inmunosueros.
Materiales : jeringa con aguja de 1 ml, embudo de cristal, tubos de ensayo, algodón.
Reactivos : alcohol etílico de 70º, éter etílico, solución de inoculación

Técnica :
a) Anestesiar al ratón con un algodón empapado de éter etílico colocado en el interior
de un embudo invertido , introducir en él el ratón.
b) rasurar la zona a inyectar e inyectar la solución de inoculación en el lugar de
inoculación que puede ser : IC intracraneal, IM intramuscular, IN intranasal, SC
subcutánea, ID intradérmica, IV intravenosa, IP intraperitoneal.
86
Interpretación de los resultados : Se manifiesta la infección en el ratón ,se observará ésta por
la sintomatología , la muerte o la elevación del título de anticuerpos. Se observará durante dos
o más semanas el animal inoculado
Tomado de Microbiología Granados 1aedición
TÉCNICAS DE INOCULACIÓN EN EMBRIÓN DE POLLO

Existen varios métodos de inoculación de huevos fértiles , dependiendo del virus que desea
cultivarse. Una vez inoculados, los huevos se incuban a temperaturas entre 35 y 38ºC (
dependiendo del virus). Antes
de proceder a la inoculación de un huevo debe limpiarse cuidadosamente su superficie con
alcohol.
● Inoculación corio-alantoidea
♦ Edad del embrión : 10 a 12 días
♦ Método :
Examinar el huevo en ovoscopio provisto de lámpara de 100 vatios . Ésta técnica llamada de
iluminación permite apreciar los vasos sanguíneos del embrión , la cámara de aire con claridad
a través de la cáscara. Con un lápiz se delimitar la cámara de aire así como también el punto
en que el corio-alantoides es bien notorio y desarrollado. Practicar una cámara de aire artificial
de la siguiente manera:
a) Quitar un pequeño triángulo de cáscara de encima del corio-alantoides sin dañar la
fárfara
b) Utilizando una aguja de disección incidir cuidadosamente la fárfara sin dañar la
membranacorio-alantoidea que está debajo.
c) Realizar una pequeña abertura en la cámara de aire y valiéndose de un gotero
realizar una succión suave en el agujero hecho anteriormente. La membrana corio-
alantoidea se separa de la fárfara efectuándose entonces la inoculación a través de
la hendidura de la misma.
Sellar la abertura e incubar durante 2 a 4 días examinando diariamente
● Inoculación en saco amniótico

♦ Edad del embrión: 7 a 14 días
♦ Método
Proceder como para la inoculación corio-alantoidea. Cuando la membrana corio-alantoidea
aparezca se aumenta el tamaño del orificio . A través de la membrana corio-alantoidea y
utilizando unas pinzas estériles se extrae una parte de la membrana amniótica. Inocular en la
cavidad amniótica, sellar e incubar.
87
● Inoculación de saco alantoideo
♦ Edad del embrión : 10 días
♦ Método
Se procede como en la inoculación corio-alantoidea pero sin extraer la membrana. Inocular
directamente en la cavidad alantoidea . Con el agujero realizado en la cámara de aire se evita
el reflujo del inóculo motivado por la presión. Sellar e incubar.
● Inoculación en saco vitelino
♦ Edad del embrión: 3 a 8 días
♦ Método
Se efectuará la inoculación directa a través de la cámara de aire, puesto que a la edad
señalada el saco vitelino rellena casi por completo el huevo. Sellar e incubar.
♦ Examen
Colocar el huevo en una placa de Petri, sobre algodón empapado en desinfectante.
Utilizando tijeras y pinzas estériles eliminar la cáscara de encima de la cámara de aire. Extraer
la membrana interna (fárfara) y colocarla en agua destilada estéril.
Examinarla para apreciar lesiones.
La identificación de virus aislados en huevos puede hacerse por técnicas de neutralización
o de fijación del complemento con sueros específicos. Es posible neutralizar tanto el efecto
particular producido por el virus como la formación de placas o muerte del embrión, como en el
caso de los myxovirus, neutralizar o inhibir la propiedad de estos virus de aglutinar los
hematíes. Las pruebas de fijación de complemento tienden a dar reacciones de grupo más
que específicas de tipo.
Tomado de Manual de Técnicas de Microbiología Médica Baker
Fuentes de Información
■ Arenas R. Micología Médica Ilustrada.2ª edición.2005. Editorial McGraw Hill

■ Bailey & Scott.Diagnóstico Microbiológico .11ª edición 2004.Editorial Médica
Panamericana.
■ Granados R. Microbiología Tomo II.2ª edición.2003.Editorial Thomson Paraninfo
■ Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología Médica 18ª edición 2005 Editorial
Manual Moderno
■ Koneman Diagnóstico Microbiológico 6ª edición .2008.Editorial Médica
Panamericana
■ Murray P. Microbiología Médica.5ª edición 2008.Editorial Elsevier
■ Sherris Microbiología Médica. 4ª edición.2005.Editorial Mc Graw Hill
■ Baker F.J, Breach M.R. Manual de Técnicas de Microbiología Médica.1990.Editorial
Acribia
88
■ Cann A Principios de Virología Molecular. 4ª edición.2005. Editorial
Acribia
■ Organización Panamericana de la Salud. Oficina Sanitaria Panamericana Regional
de la Organización Mundial de la Salud. Garantía de calidad en el diagnóstico
serológico de la Infección por el virus de la inmunodeficiencia humana . Publicación
Nº 42
■ Ministerio de Sanidad y Política Social. Cataluña .España. Prueba de detección
rápida de la infección por VIH. AATRM Núm. 2007/3
■ CristhopherDonat’s Cruz Malpica. Estandarización de la prueba de Ensayo
Inmunoenzimático para la detección de anticuerpos IgG en sueros humanos para
el virus Phlebotomusfever. Tesis para optar el título de químico farmacéutico.
Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de farmacia y Bioquímica
2001
http://sisbib.unmsm.edu.pe/Bibvirtual/tesis/Salud/Cruz_M_C/generalidades.htm
■ Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
Procedimientos en Microbiología Clínica.
www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap6.htm
■ Moura AC Diversidade genética, densidadepopulacional e potencial de promoҫão de
crescimento de rizobactériasassociadasaocacaueiro [Tesis Maestría].Bahia :
Universidade Federal do Rencôcavo ; 2007.
■ Chaves L Aspectos bioquímicos e moleculares de bacterias isoladas de terrapreta
antropogênica (TPA) naregião da Amazônia Brasileira.[Tesis Maestría] Piracicaba :
Universidade de Sâo Paulo; 2007
89

Guia de Practicas de Microbiologia 2019 1

Caricato da

Informazioni sul documento

Titolo originale

Copyright

Formati disponibili

Condividi questo documento

Condividi o incorpora il documento

Opzioni di condivisione

Hai trovato utile questo documento?

Questo contenuto è inappropriato?

Copyright:

Formati disponibili

Guia de Practicas de Microbiologia 2019 1

Caricato da

Copyright:

Formati disponibili

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

PRIMER SEMESTRE ACADÉMICO

El Manual de Prácticas de Microbiología tiene como objetivo orientar a los alumnos a un

Los avances tecnológicos con aumento de la automatización, el desarrollo de la biología

Tenemos el convencimiento que ésta orientación académica proporcionará a los alumnos

Se da una relación concisa de los métodos de laboratorio empleados en el estudio de las

Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodológicamente a fin de facilitar la

Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prácticas , no es una compilación

El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difícil, debido al tamaño

SEMANA FECHA TEMA

9na 30 abril SEMANA DE EXAMENES PARCIALES

Práctica de Laboratorio Nº9:

Con tal motivo, en el Laboratorio de Microbiología se consideran cuatro niveles de seguridad

▪ Nivel 1 : Microorganismos no patógenos y patógenos oportunistas

1. Los alumnos ingresarán a la Sala de Prácticas solamente con el uniforme obligatorio y el

4.La evaluación de los alumnos de las asignaturas correspondientes al Departamento de

5. Por razones de seguridad, ningún material de prácticas saldrá de la sala de trabajo. En

6. Uno de los instrumentos de trabajo , el asa o mango de Kolle , terminado el ejercicio

En el campo de la microbiología médica se requieren de conocimientos básicos,

▪ Asa y aguja de siembra : Muy usada en la práctica microbiológica, hecha de alambre de

▪ Centrífuga : Aparato diseñado para acelerar la separación de partículas sólidas suspendidas

▪ Crioviales : Pequeños tubos cónicos de polipropileno resistentes a muy bajas temperatura

▪ Estufa : Aparato de dimensiones diversas , donde se incuban los cultivos, generalmente a

▪ Gradilla : Soporte para tubos de ensayo.

▪ Jarra de anaerobiosis : Instrumento útil para el aislamiento de bacterias anaerobias ya que

▪ Matraces y balones : Recipientes volumétricos de gran utilidad para la preparación y

▪ Medios de cultivo : Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de microorganismos

▪ Microscopio : Instrumento óptico utilizado para la observación de microorganismos que no

▪ Pipetas Pasteur : Varillas de vidrio de 4 mm de diámetro y de 20 a30 cm de longitud. Se les

▪ Pipeteadoresautomáticos : Pipetas que absorben de forma automática sin necesidad de uno

Autoclave Cabina de Flujo laminar

▪ Realizar los procedimientos adecuados para asegurar las medidas de bioseguridad

En términos de la efectividad del Laboratorio de Microbiología , nada es más importante que la

▪ La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.

▪ Cuando se va a proceder a tomar un espécimen clínico, es importante evitar la

▪ Seleccionar el lugar anatómico correcto de donde se obtendrá el espécimen y utilizar la

▪ Nunca refrigerar una muestra por anaerobios.

▪ Coleccionar un apropiado volumen de la muestra.

▪ El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su grado de

▪ Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibióticos o agentes antimicrobianos.

▪ Colocar la muestra en un recipiente estéril y adecuado para su transporte como cajas,

CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA

▪ Hoja de solicitud de análisis no llenada correctamente

Las muestras más frecuentes en los estudios microbiológicos son :

▪ Lavarse las manos

▪ Muestra evacuada : La persona debe defecar en un recipiente limpio y seco, teniendo

La sangre de los individuos sanos es estéril. Una presencia repentina de bacterias

▪ Los hemocultivos se obtendrán antes de iniciar la terapia antibiótica, el incumplimiento de

■ MUESTRAS FARINGEAS Y AMIGDALARES :

Más del 70 % de procesos están ocasionados por virus : rinovirus , coronavirus,

▪ Las muestras de exudado faringo-amigdalar se obtienen con la ayuda de un depresor lingual,

El estudio bacteriológico de los catéteres , nos va a permitir en ocasiones conocer el agente

▪ Desinfectar con alcohol al 70 % una zona de la piel de unos 10 cm correspondientes

El fundamento es la búsqueda de agentes patógenos u oportunistas, que pueden estar

▪ La obtención de estos líquidos es un procedimiento médico

■ LÍQUIDO CÉFALORRAQUIDEO (LCR)

▪ La toma de la muestra la realiza el médico tratante o el patólogo clínico del

▪ Centrifugar a 1 500 hasta 3 000 revoluciones durante 15 a 20 minutos.

■ EXTRACCIÓN DE SANGRE PERIFÉRICA :

▪ Explicar la coloración Azul de metileno.

Debido al pequeño tamaño de los microorganismos , se requiere de un microscopio óptico, ya

Las coloraciones son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la

Los colorantes aumentan el contraste combinándose químicamente con el protoplasma