Defina inmunoensayo y qué diferencia hay entre inmunoensayo y las pruebas de rutina en química clínica?

Inmunoensayo es un conjunto de técnicas inmunoquímicas analíticas de laboratorio que tienen en común el usar
complejos inmunes, es decir los resultantes de la conjugación de anticuerpos y antígenos, como referencias de
cuantificación de un analito (sustancia objeto de análisis) determinado, que puede ser el anticuerpo (Ac) o un
antígeno (Ag), usando para la medición una molécula como marcador que hace parte de la reacción con el complejo
inmune en la prueba o ensayo químico.

La técnica se basan en la gran especificidad y afinidad de los anticuerpos por sus antígenos específicos y se usan
los anticuerpos monoclonales (obtenidos en el laboratorio) o de sueros policlonales (obtenidos de animales), siendo
más específicos los monoclonales.

Su gran sensibilidad y especificidad permite la cuantificación de compuestos presentes en líquidos orgánicos en

concentración reducida, del orden de nanogramos/ml o de picogramos/ml.

Por la técnica de medición

Competitivo: el Antígeno (Ag) objeto de la medición compite con un antígeno marcado por un anticuerpo (Ac). Se
mide por la cantidad del antígeno marcado sin conjugar que se considera es inversamente proporcional al analito.

No competitivo (llamado también tipo sándwich): el Ag de la muestra reacciona con dos Ac diferentes que se fijan a
distintas partes del Ag . Uno de los Ac generalmente está en soporte sólido para facilitar la separación de la fracción
ligada, y el otro Ac lleva la marca. Se mide por la cantidad del marcador considerando que es directamente
proporcional a la cantidad del analito.

Por el medio donde se realiza la medición

Homogéneo: En este tipo de ensayo la señal generada por la unión del antígeno y el anticuerpo se mide
directamente en el mismo medio que se utiliza para favorecer la formación del complejo inmune.

Heterogéneo: En este tipo de ensayo la señal generada por la unión del antígeno y el anticuerpo se mide en un
medio diferente que el utilizado para la unión del complejo inmune, generalmente implican una etapa intermedia de
lavado para eliminar interferencias.

Se considera que los inmunoensayos con formato homogéneo no competitivo son los más sensibles y específicos.

Por el marcador

Radioinmunoensayo (RIA) : el marcador es un isótopo radioactivo.

Enzimoinmunoanálsis (EIA): el marcador es una enzima como por ejemplo la técnica de enzimoinmunoensayo
conocido por su abreviatura ELISA.

Fluoroinmunoanálisis: el marcador es una molécula fluorescente, por ejemplo FPIA.

Ensayo Inmunoquimioluminiscente: la marca es en general una enzima capaz de catalizar una reacción
quimioluminiscente. Son tanto o más sensibles que los radioinmunoensayos, y no presentan riesgos de
manipulación de sustancias radioactivas. En contraposición están poco desarrollados y no siempre es posible
aplicarlos.

La química clínica refiere al análisis bioquímico de los fluídos corporales. Utiliza reacciones químicas para
determinar los niveles de diversas composiciones químicas en líquidos corporales. Varias pruebas químicas simples
se utilizan para descubrir y para cuantificar diversas composiciones en sangre y la orina, los especímenes lo más
común posible probados de la química clínica.

Las técnicas tales como espectrofotometría, immunoensayos, y electroforesis también se utilizan en química clínica
para medir la concentración de substancias tales como glucosa, lípidos, enzimas, electrólitos, hormonas, proteínas, y
otros productos metabólicos presentes en sangre humana y orina.

Especímenes probados en análisis clínico

Suero El suero es el espécimen más común probado - es obtenido por la centrifugación de la sangre coagulada. El
suero no contiene ningunos glóbulos o factor de coagulación sino tiene los electrólitos, las hormonas, los antígenos,
los anticuerpos, y otras substancias tales como drogas, microbios, y proteínas no usadas en la coagulación
Plasma El plasma es obtenida por la centrifugación de la sangre uncoagualted. Contiene los glóbulos, los factores de
coagulación, la glucosa, los electrólitos (tales como sodio, magnesio, calcio, cloruro), las hormonas, y las proteínas
(tales como albúminas, fibrinógeno, y globulinas).

Orina Las pruebas clínicas requieren generalmente una colección de 24 horas de la orina. El contenedor de la
colección contiene generalmente un preservativo.

Líquido espinal cerebroespinal (CSF)La CFS es un líquido sin obstrucción presente en el cerebro y la espina dorsal
que es en gran parte similar al plasma de sangre sin embargo él difiere no conteniendo casi ninguna proteína. Se
analiza generalmente en química clínica para determinar o para eliminar meningitis.

Parámetros dominantes probados y su significación

Hidratos de carbono Los niveles de la glucosa indican la eficiencia de la carrocería en la metabolización de la

glucosa. El ayuno y los niveles al azar de la glucosa en sangre ayudan en la diagnosis de desordenes
endocrinológicos tales como hipoglucemia (azúcar de sangre inferior) y diabetes.

Lípidos Los lípidos están presentes en diversas formas como grasas de cuerpo, como parte de las membranas
celulares, y como esteroles tales como colesterol. Los niveles de lípido pueden ayudar a diagnosticar el hígado y la
enfermedad cardíaca en seres humanos.Por ejemplo, los niveles del colesterol y de los triglicéridos totales en sangre
son un factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular (CVD). La lipoproteína de alta densidad (HDL) es una
buena forma del colesterol que ofrece la protección contra enfermedad cardíaca mientras que la lipoproteína de baja
densidad (LDL) es una forma dañina que es otro factor de riesgo para el CVD.

Enzimas La medición de los niveles de enzimas liberadas por los órganos en la sangre puede indicar problemas con
el órgano determinado. Por ejemplo, los niveles de la cinasa de la creatina de la enzima en la carrocería indican el
corazón o los niveles del daño del músculo esquelético, de la aminotransferasa de la alanina o de la
aminotransferasa del aspartato pueden ayudar a diagnosticar desordenes del hígado, y niveles de la amilasa y de la
lipasa para hacer señales la inflamación del páncreas o el carcinoma pancreático.

Hormonas Las hormonas secretadas por las casquillos del prensaestopas endocrinas de nuestra carrocería regulan
diversos procesos. Un aumento o una disminución de niveles de hormona puede hacer señales las casquillos del
prensaestopas hiperactivas o hypoactive respectivamente. Por ejemplo, el cortisol es una hormona secretada por las
casquillos del prensaestopas suprarrenales, la hormona (T4) estimulante de la tiroxina y de la tiroides (TSH) es
secretada por la glándula tiroides, y la hormona el estimular de folículo (FSH) y las hormonas de incremento son
secretadas por la glándula pituitaria. Por lo tanto la medición de los niveles de estas hormonas puede ayudar a
determinar si están funcionando las casquillos del prensaestopas correspondientes correctamente.

Proteínas La concentración de proteínas en la carrocería puede ser indicativa de desordenes alimenticios y

metabólicos y de algunas formas del cáncer. Por ejemplo, la proteína total y los niveles de la albúmina ayudan a
diagnosticar enfermedad del hígado o de riñón además de la desnutrición. Los niveles de la globulina y la índice de
la albúmina a la globulina pueden ayudar a descubrir la infección, la inflamación, la enfermedad autoinmune, y
algunas formas del cáncer de sangre.

Electrólitos Los niveles de diversos electrólitos tales como sodio, cloruro, potasio, calcio, bicarbonato, fósforo, y
magnesio en la carrocería pueden ayudar a diagnosticar algún riñón y desordenes metabólicos.

Metabilitos Algunos productos metabólicos se pueden medir para fijar el funcionamiento de ciertos órganos.Por
ejemplo, los niveles de urea, de nitrógeno y de creatinina en la sangre son indicadores de la función del riñón.
Semejantemente, los niveles del ácido úrico pueden hacer señales enfermedad de riñón, gota, y daño a otros
tejidos.Los análisis de la sangre y de orina que dan resultados anormales se relanzan generalmente para asegurarse
de que no hay muestra o desvío del laboratorio y también que es seguido por pruebas clínicas especializadas.

Que es un analito En química analítica, analito es un componente (elemento, compuesto o ion) de interés analítico
de una muestra que se separa de la cromatografía.1 Es una especie química cuya presencia o contenido se desea
conocer, identificable y cuantificable, mediante un proceso de medición química.

En metrología química constituye un tipo particular de mensurando, que es una magnitud, la cantidad del objeto de
medida; es decir, la concentración de analito, la porción que se somete a cuantificación, previa comparación con
un patrón que aporta la información requerida.
En conjunto con los elementos intangibles, el analito y el mensurado son necesarios para la definición y la solución
del problema analítico. Los elementos intangibles requieren planificación del diseño, su evolución y corrección.
La información que se obtiene de la muestra de analito puede ser:
 Cualitativa. Si existe analito en determinada cantidad en la muestra.
 Cuantitativa. La proporción de la sustancia.
 Estructural.
El analito que se determina en una muestra puede ser de naturaleza inorgánica, orgánica o bioquímica. Según
su concentración en ésta, se clasifica como macrocomponente (más de 1%), microcomponente (entre 0,01% y 0,1%)
o trazas (menos de 0,01%).
Para llevar a cabo el análisis químico de la muestra pueden utilizarse distintos procedimientos, tales como el método
electroanalítico o los métodos espectrométricos.
Un antígeno ("anti", del griego αντι- que significa 'opuesto' o 'con propiedades contrarias' y "geno", de la raíz griega
γεν, generar, producir; que genera o crea oposición) es una sustancia que desencadena la formación
de anticuerpos y puede causar una respuesta inmunitaria.1 La definición moderna abarca todas las sustancias que
pueden ser reconocidas por el sistema inmunitario adaptativo, bien sean propias o ajenas.2
3 .Un antígeno suele ser una molécula ajena o tóxica para el organismo (por ejemplo, una proteína derivada de una
bacteria) que, una vez dentro del cuerpo, atrae y se une con alta afinidad a un anticuerpo específico. Cada
anticuerpo es capaz de lidiar específicamente con un único antígeno gracias a la variabilidad que le otorga la región
determinante de complementariedad del anticuerpo dentro de la fracción Fab de los mismos.
Un epítopo o determinante antigénico es la porción de una macromolécula que es reconocida por el sistema
inmunitario, específicamente la secuencia a la que se unen los anticuerpos,1 que son los receptores de las células
B o de las células T en estado soluble. Aunque se piensa que los epítopos provienen de proteínas no propias, las
secuencias que se obtienen del huésped que pueden ser reconocidas son también clasificadas como epítopos.

Los anticuerpos, bien sea libres o fijados a la matriz extracelular, se unen a moléculas antigénicas en una superficie
de unión, para así formar complejos antígeno-anticuerpo. Esas superficies de unión sobre las macromoléculas
constan de complejas secuencias específicas llamadas determinantes antigénicos o epítopos.2 La mayoría de los
epítopos reconocidos por anticuerpos o células B se pueden pensar como relieves de superficies tridimensionales de
una molécula antígeno; estos relieves encajan con precisión y así se unen a anticuerpos. La parte de un anticuerpo
que reconoce el epítopo se llama paratopo.2 La excepción son los epítopos lineales, que son determinados por la
secuencia de aminoácidos (la estructura primaria) en vez de por la forma 3D (estructura terciaria) de una proteína.
De conocerse la secuencia genética de un determinado epítopo que será reconocido por un anticuerpo, es posible
emplear ésta para generar una proteína quimera por fusión del marco abierto de lectura (ORF) de un gen a estudiar
con la secuencia de dicho epítopo; de este modo, el anticuerpo inicial puede ser empleado para detectar la proteína
quimera, lo cual permite detectarla y efectuar análisis sobre ella. Esta estrategia se ha empleado para caracterizar c-
myc, HA, FLAG y V5.
4. 4. Qué son los anticuerpos policlonales
Anticuerpos policlonales son anticuerpos derivados de diferentes líneas de células B, los linfocitos encargados de
la respuesta ante elementos ajenos (antígenos) mediante anticuerpos.
Los anticuerpos policlonales son una mezcla de inmunoglobulinas, secretados en contra de un antígeno específico,
cada una reconociendo diferentes epítopos.
Habitualmente se obtienen de lo que se denomina un antisuero. Obtenido de la inyección reiterada de
un antígeno en un animal, con el fin de generar una respuesta inmune. De este animal se toma una muestra de
sangre y de esta muestra es obtenido el suero que finalmente es purificado para obtener la variedad de anticuerpos
policlonales de interés.

5. Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B.1 Los anticuerpos
monoclonales (en acrónimo mAB, de la frase en inglés con idéntico significado que en español: monoclonal
antibody), son anticuerpos idénticos porque son producidos por un solo tipo de célula del sistema inmune, es decir,
todos los clones proceden de una sola célula madre.2 Es posible producir anticuerpos monoclonales que se unan
específicamente con cualquier molécula con carácter antigénico. Este fenómeno es de gran utilidad
en bioquímica, biología molecular y medicina.
Según su origen, podemos distinguir entre 4 tipos de Anticuerpos Monoclonales, los cuales se diferenciar
principalmente en su composición y diferente antigenicidad que presentan en el organismo.

1. Murinos: Anticuerpos procedentes del ratón.

2. Eficacia terapéutica disminuida (sistema inmune los identifica como extraños y reacciona para destruirlo.
 3. Pueden presentar posibles efectos secundarios como nefrotoxicidad y reacciones alérgicas.

1. Quiméricos: Obtenidos mediante la humanización de los AcMo obtenidos del ratón por Ingeniería Genética
(regiones variables proceden de ratón que reconocen el antígeno específico y las regiones contantes de
los anticuerpos son humanas).
2. Evitan el rechazo del Sistema Inmune al ser introducidos en el organismo.
3. Producen anticuerpos anti-quiméricos

1. Humanizados: El 90% del anticuerpo es de origen humano, por lo que reduce aún más la inmunogenicidad
de los anticuerpos.
2. El 10% restante corresponde a las regiones CDR o hipervariables que son las únicas en este caso que
proceden del ratón.

1. Humanos: La totalidad del anticuerpo es de origen humano.

2. El rechazo del Sistema Inmune es prácticamente inexistente.
Actualmente, existen pocos MoAbs de este último tipo.
En el formato competitivo de un solo paso (ver Figura 1-8), tanto el reactivo del antígeno marcado (Ag*) como la
muestra sin marcar (o analito de la muestra) compiten por una cantidad limitada de anticuerpo

El Ag del espécimen y el Ac marcado pueden añadirse simultáneamente (sistema de un solo paso) o

secuencialmente (sistema de dos pasos). La actividad enzimática es en ambos casos directamente proporcional a la
concentración del Ag del espécimen (Figura 4)

En el formato competitivo de dos pasos, la concentración de anticuerpo del reactivo se encuentra presente en
exceso comparada con la concentración de antígeno. El reactivo del anticuerpo primero se incuba con una muestra
que contenga antígenos de interés, luego en el segundo paso, se agrega el antígeno marcado

Los formatos de ensayo no competitivo también pueden utilizar las técnicas de un paso o de dos pasos, como en el
ensayo competitivo. El formato del ensayo de dos pasos emplea etapas de lavado en el que se aísla y se lava el
complejo sándwich para quitar el exceso del reactivo marcado no unido y cualquier otra sustancia que interfiera. El
formato no competitivo de dos pasos generalmente ofrece la mayor especificidad y sensibilidad de todos los
formatos de ensayo que se tratan en la presente guía

Los inmunoensayos de un paso pueden tener tendencia a las interferencias que afectan tanto la sensibilidad como la
especificidad. En la mayoría de los casos las interferencias se deben a agentes que interfieren en la unión de
anticuerpos con antígenos por varias razones.

Efecto hook

La posibilidad de que exista un efecto “hook” en concentraciones elevadas es un fenómeno inherente a los diseños
de los ensayos “sándwich” de un paso. Las concentraciones muy elevadas de antígeno en la muestra del paciente
se unen a todos los sitios disponibles saturándolos, tanto en el anticuerpo- fase sólida como en el anticuerpo-
conjugado marcado y así evitar la formación “sándwich”. Bajo estas condiciones, el nivel medido de analito puede
ser significativamente más bajo que el nivel real presente en la muestra. El efecto “hook” en concentraciones
elevadas se refiere al “gancho” que se observa en la curva de respuesta a la concentración cuando la información se
traza como una señal versus la concentración de analito (Figura 3-4). Este efecto” hook” en concentraciones
elevadas también se denomina efecto prozona.

Anticuerpos Humanos Anti-Ratón (HAMA) Otra forma de interferencia en los inmunoensayos es la presencia de
anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA). Estos anticuerpos pueden estar presentes en la sangre humana como
consecuencia de la respuesta inmunológica del cuerpo al estar expuesto a antígenos de ratón. Existen varias
razones para que un sistema inmunológico humano produzca anticuerpos para “combatir” antígenos invasores que
derivan de la exposición a ratones. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales del ratón se usan en algunos
tratamientos para el cáncer. Un sistema inmunológico humano también puede producir una respuesta a los ratones
si el paciente está en contacto con ellos. También es común la exposición ambiental a los ratones.

Las muestras de pacientes que contienen HAMA pueden producir resultados falsamente elevados (falso positivo) o
reprimidos (falso negativo) en los inmunoensayos que utilizan anticuerpos monoclonales de ratón. Los ensayos
sándwich por lo general son los más susceptibles a la interferencia HAMA. Para evitar los efectos prozone (efectos
“hook” en concentraciones elevadas), se pueden diseñar los ensayos usando un formato de ensayo de dos pasos, el
cual usa pasos de lavado para eliminar el exceso de antígeno. GDS_0418723_McClelland_v4 95 Anticuerpos
Humanos Anti-Ratón (HAMA) Falsos Positivos Debidos a HAMA: En el caso de falsos positivos, se forma un ensayo
sándwich y así se produce la señal, aunque no haya presente analito del paciente (Figura 3-5). HAMA se une tanto
al anticuerpo de captura de fase sólida como al reactivo de anticuerpo marcado. Por lo tanto parece como si el
analito estuviese presente en la muestra del paciente, causando el complejo. Figura 3-5 Cómo HAMA genera un
falso positivo GDS_0418723_McClelland_v4 96 Anticuerpos Humanos Anti-Ratón (HAMA) Falsos Negativos
Debidos a HAMA: HAMA puede provocar resultados del ensayo falsos negativos por medio de dos mecanismos:
uniéndose y bloqueando al anticuerpo de captura de fase sólida, o uniéndose y bloqueando al reactivo de anticuerpo
marcado. Figura 3-6 Cómo HAMA genera un falso negativo GDS_0418723_McClelland_v4 97 Anticuerpos Humanos
Anti-Ratón (HAMA) Los fabricantes utilizan varias técnicas para minimizar el impacto de HAMA incluyendo: –Diseño
real de dos pasos para eliminar las interferencias – Bloqueadores para reducir o eliminar las interferencias ocupando
los puntos de unión en los anticuerpos HAMA. Los bloqueadores son únicos para la formulación de cada ensayo y
algunos ejemplos pueden ser detergentes, proteínas depuradas y suero animal
Ria es un tipo de inmunoensayo o método radioinmunométrico que se basa en la formación específica de los
complejos antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los
métodos radiológicos. La técnica ha sido prácticamente reemplazada por el método ELISA el cual mide la unión Ag-
Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías. Casi todas las moléculas pueden ser antigénicas y esto se usa
para que los anticuerpos puedan unirse a esa molécula y marcarla radiactivamente. Una buena manera de provocar
que una molécula sea antigénica está basada en que un hapteno combinado con un coadyuvante da respuesta
inmune. Un coadyuvante muy usado es la albúmina de suero bovino o BSA, por lo que al conjugar un hapteno con
BSA e introducirlo en otra especie aparecerán anticuerpos contra el hapteno.

Marcador: isótoposradioactivos

Tipo de respuesta primaria

Uso aún se usan en la actualidad, particularmente para la detección de cantidades muy bajas de analitos

EIA: En EIA, las marcas de las enzimas se usan en lugar de las marcas radioactivas. Las marcas típicas de enzimas
son., EIA típicamente usa un cambio de color, emisión de luz, u otra señal. Se requiere un equipo específico para
obtener la concentración de enzimas presentes midiendo el cambio específico que ocurrió.

Marcador la fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, y la galactosidasa B

uso

FPIA Inmunoensayo por Polarización de Fluorescencia (FPIA) es un tipo de inmunoensayo homogéneo competitivo
por fluorescencia. Con la unión competitiva, el antígeno de una muestra y el reactivo marcado antígeno-fluoresceína
(AgF) compiten por los puntos de unión en el anticuerpo. Como inmunoensayo homogéneo, la reacción se lleva a
cabo en una solución de reacción simple, y el complejo Ab-AgF no requiere un paso de lavado para separarlo de la
marca AgF “libre”

FPIA utiliza tres conceptos claves para medir analitos específicos en un formato homogéneo: fluorescencia, rotación
de moléculas en la solución y luz polarizada. Fluorescencia: La fluoresceína es una marca fluorescente. Absorbe la
energía de la luz a 490nm y libera esta energía a una longitud de onda superior (520nm) como luz fluorescente
(Figura 2-3) Las moléculas más grandes rotan más lentamente en la solución que las moléculas más pequeñas. Este
principio puede utilizarse para distinguir entre la molécula más pequeña antígeno-fluoresceína: AgF, que rota
rápidamente, y los complejos Ab-AgF más grandes , que rotan lentamente en la solución.

Uso FPIA se utiliza para proporcionar una medición exacta y sensible de pequeños analitos de toxicología como
pueden ser las drogas terapéuticas, y las drogas de abuso, toxicología y algunas hormonas. La aplicación de FPIA al
sistema TDx ® de Abbott automatizó en gran medida los inmunoensayos manuales de otros tiempos que requerían
mucha mano de obra.

MEIA El Inmunoensayo por micropartícula (MEIA) es una técnica de inmunoensayo que utiliza el aislamiento de
complejos anticuerpo/antígeno en una superficie de fase sólida de pequeñas esferas denominadas micropartículas.
MEIA se ha adaptado ampliamente para automatizar la medición de moléculas grandes

Los componentes de MEIA incluyen ,en suspensión en un buffer específico optimizado para el ensayo, lo siguiente:
(Figura 2-7): – Fase Sólida Micropartícula-Anticuerpo : Micropartículas de látex que están recubiertas con un
anticuerpo para unirse al analito específico que está siendo medido – Conjugado Anticuerpo-Enzima: Enzima
Fosfatasa Alcalina unida al anticuerpo – Sustrato de Enzima: Fosfatasa 4-Metil Umbelliferona Fluorescente (MUP)
en solución, la que está disponible para una reacción con la enzima en el anticuerpo.

Uso análisis cardíaco, de fertilidad, de cáncer, metabólico, de hepatitis, y de tiroides.

QL es el fenómeno por el que, en ciertas reacciones químicas, la energía liberada no sólo es emitida en forma de calor
o de energía química, sino también en forma de luz.

La quimioluminiscencia es un fenómeno que se produce cuando, en una reacción química, los electrones saltan de
las capas más altas de los átomos a las más bajas.

Uso control de calidad de productos cárnicos y residuos, existiendo igualmente aplicaciones en la medida del ozono
ambiental