ÍNDICES DE KOVATS

Barrera A. Natalia​1​, Bedoya T. Paula1​ ​, Bonilla H. Laura1​

1. Estudiantes Universidad del Tolima - Biología

Es un método de cuantificación de los tiempos de elución relativa de los diferentes

compuestos en cromatografía de gases, de forma que ayuda a identificar positivamente los
componentes de una mezcla.
Para proporcionar un medio fácil de identificar un compuesto desconocido, Kovats propuso
un sistema de índices basado en los n-alcanos como sustancias de referencia, puesto que estos
compuestos son químicamente inertes, solubles en las fases estacionarias comunes y son no
polares. El índice de Kovats, se calcula de la siguiente ecuación:

Figura 1​. Ecuación

donde
I = índice de retención de Kovats
n= número de átomos de carbono en el alcano más pequeño
Rx es el tiempo de retención de la sustancia desconocida X
Rz es el tiempo de retención del alcano normal que tiene z átomos de carbono
Rz+n es el tiempo de retención de un alcano normal teniendo z+n átomos de carbono

EJEMPLOS

1. Cromatografía de gases en Aceites esenciales

Los aceites encuentran aplicación en las industrias tabacalera,textil y de pinturas;
como saborizantes en una gran variedad de productos alimenticios salsas, confitería
,bebidas alcohólicas, gaseosas entre otras.
Para el análisis de los aceites esenciales ( que son mezclas muy complejas) se utilizan
principalmente dos detectores GC: el detector de ionización en llama (FID, Flame
Ionization Detector) y el detector selectivo de masas (MSD , Mass Selective Detector)
. Para hacer la identificación preliminar de los componentes del aceite, se determina
los índices de retención, a menudo llamados los índices de Kovats. ​ ​(Stashenko, 2009)
 Para algunas sustancias presentes en los aceites esenciales se observan índices de
retención muy cercanos, por lo menos en una de las columnas (apolar o polar, con uso
más frecuente figuran las columnas DB-1, DB-5 o DB-WAX o sus análogos
comerciales); además, algunos constituyentes poseen espectros de masas muy
parecidos, tal como se puede observar en la Figura 2.

Figura 2​. Monoterpenoides (óxidos de limoneno, isómeros cis- y trans-), frecuentes

constituyentes en los aceites esenciales. Se observa que el patrón de fragmentación de estos
compuestos es el mismo. pero se notan algunas pequeñas diferencias en las intensidades de
iones-fragmento.

Método​.

El índice de retención de un compuesto X , en la mezcla se determina usando su tiempo de

retención (trx) , con respecto a los tiempos de retención de dos hidrocarburos lineales, uno,
que eluye antes, y el otro que eluye después del compuesto de interés (trn) . Por definición ,
los índices de retención de hidrocarburos lineales son múltiplos de cien Ik= 100 x n , donde n
= es el número de átomos de carbono en el hidrocarburo , como por ejemplo , Ix del hexano
es 600.Si el analisis cromatográfico se hace con la temperatura de la columna se llamará
índice de Kovats (Clásico).​ ​(E. Stashenko, Rene 2010)
Se requiere cumplir con las siguientes condiciones
● Usar columnas capilares preferiblemente más largas (50, 60 m)
 ● Hacer el análisis en dos columnas capilares con f.e. ortogonales (e.g., DB-1o DB-5 y
DBWAX)
● Obtener espectros de masas por EI (70 eV) experimentales y realizar la búsqueda
comparativa en -preferiblemente-, varias bases de datos de espectros de masas
● Calcular los índices de retención lineales en dos columnas, polar y apolar
● Usar los compuestos-patrón para la confirmación estructural adicional.

Tabla 1​. Constituyente del aceite esencial

Tomado de:
https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/10729/MartinezRodriguezRosa03de11.pdf?sequ
ence=3

Tabla 2​. Índices de retención recopilados de la literatura científica, y experimentalmente

obtenidos, para algunos componentes comunes en los aceites esenciales

El análisis de esta información permite confirmar positivamente la presencia en el aceite del

βmirceno, limoneno y de la carvona, identificar tentativamente a la piperitenona y al
βbourboneno.​ ​(E. Stashenko, Rene 2010)
 Tabla 3​. Algunos ejemplos de los índices de retención lineales calculados en las columnas
apolar (DB-5, 60 m) y polar (DB-WAX, 60 m) de los compuestos-patrón y presentes en el
aceite esencial aislado.

Conclusión
A pesar de una inmensa fortaleza analítica y de la confiabilidad de la cual goza hoy en día la
técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, es importante
vislumbrar claramente sus alcances y también sus limitaciones. Las limitaciones principales
son marcadas por el tipo de muestra a analizar (peso molecular, volatilidad, termoestabilidad
y polaridad de sus componentes). Pero existen también algunos problemas de fondo,
objetivos. Entre ellos, se destacan estos dos:
(1) la coelución de componentes en la columna y
(2) la identificación inequívoca de los componentes.

Un conjunto de métodos analíticos instrumentales (UV, IR, NMR, MS, otros) para establecer
la estructura molecular, implica el aislamiento de la sustancia pura, pero en muchos casos,
esto no es posible; por ejemplo, en las muestras forenses, ambientales, alimentos, sabores y
fragancias, aromas, feromonas, entre otras. Frecuentemente es necesario hacer la
identificación por GC-MS de un componente in situ, directamente en la mezcla.Ello, implica
varios pasos obligatorios, a saber: análisis en columnas ortogonales, polar y apolar, cálculo de
los RI, obtención de los espectros de masas (EI, 70 eV) y la comparación de todos estos datos
obtenidos con los de las bases de datos, compendios, libros o artículos.

Para la cuantificación de los componentes es obligatorio el uso de patrones y calibraciones, la

cuantificación en general se hace por GC-FID (caso de aceites esenciales), la identificación,
con base en los espectros de Algunos aspectos prácticos para la identificación de analitos
Elena Stashenko, Jairo Martínez 46 www.scientiachromatographica.com masas obtenidos por
MSD. Si no hay información de referencia, ni sustancias patrón certificadas, analizando los
patrones de fragmentación en el espectro de masas,se pueden hacer algunas suposiciones
sobre la estructura del analito.
2. Cromatografía de gases en alcoholes.
Se lleva a cabo por medio de un cromatógrafo de gases que consta de diversos
componentes como el gas portador, el sistema de inyección de muestra, la columna y
el detector.
❖ Gas portador: Debe ser un gas inerte para prevenir que reaccione con el analito
o la columna. Normalmente se utiliza Helio (He), Argón (Ar), Nitrógeno (N),
Hidrógeno (H) o Dióxido de carbono (CO​2​), la elección del gas muchas veces
depende del tipo de detector empleado. El gas se puede almacenar en balas o
en un generador en el caso del nitrógeno y el hidrógeno. Posteriormente se
encuentra un sistema de manómetros y reguladores de flujo para asegurar un
flujo constante y finalmente, un sistema de deshidratación del gas como un
tamiz molecular.
❖ Sistema de inyección de muestra: Se inyecta la cantidad adecuada de analito y
se introduce de forma rápida para evitar el ensanchamiento de las bandas de
salida.
El método más utilizado se emplea con ayuda de una microjeringa para
introducir el analito en una cámara de vaporización instantánea.
Se emplean dos tipos de columnas: las empaquetadas o de relleno y las
tubulares abiertas o capilares. La longitud de las columnas varía de 2 a 50
metros y está construída en acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón.
Debido a la necesidad de ser introducidas en el horno, las columnas se
enrollan en forma helicoidal con diámetros de 10 a 30 cm, dependiendo del
tamaño del horno.
La temperatura es una variable importante, ya que de ella depende el grado de
separación de los diferentes analitos. La temperatura adecuada depende del
punto de ebullición del analito(s).

Figura 3.​ Inyector cromatografía de gases.

 ❖ Detectores:​ Es la parte del cromatógrafo que se encarga de determinar el
momento en que el analito ha salido de la columna. Un detector ideal se
caracteriza por:
➢ Sensibilidad
➢ Respuesta lineal al analito
➢ Tiempo de respuesta corto
➢ Intervalo de temperatura de trabajo amplio
➢ No debe destruir la muestra
➢ Estabilidad y reproducibilidad
➢ Alta fiabilidad y manejo sencillo
➢ Respuesta semejante para todos los analitos
➢ Respuesta selectiva y altamente predecible

Métodos.

Tabla 4. ​Procedimiento para obtener la cromatografía de gases en alcoholes.

Resultados.
En el análisis cromatográfico de gases se utilizó estándares para preparar el Mix con tres
diferentes porcentajes (metanol, etanol y propanol) 100 ​µL​/50 ml donde se llegó a identificar
los componentes principales en el vino y el alcohol.

● Se calculó la cantidad de volumen que se utilizara para hacer los cálculos en la

cromatografía de gases.
 Figura 4.​ Cantidad de volúmenes a utilizar.

● Mix Standar 0,2%

Se utilizó Standares para preparar el Mix 0,2% (Metanol, Etanol y Propanol)
100 ​µL​/50 ml.

Gráfica 1. ​Mix Standar 0,2%

 ● Mix Standar 1,4%
Se utilizó Standares para preparar el Mix 1,4% (Metanol, Etanol y Propanol)
100 ​µL​/50 ml.

Gráfica 2. ​Mix Standar 1,4%

● Mix Standar 1%
Se utilizó Standares para preparar el Mix 1% (Metanol, Etanol y Propanol)
100 ​µL​/50ml.

Gráfica 3. ​Mix Standar 1%

 ● Gráfico de los experimentos.
Para realizar la curva de calibración se usó una solución de etanol, metanol y
propanol como patrón interno, se les midió el área a diferentes
concentraciones y se hizo la relación de área entre los dos picos. Los datos
para esta se muestran en la gráfica relación de área vs porcentaje de etanol
(v/v).

Gráfica 4. ​Relación de área vs. porcentaje de etanol.

3. Determinación de pesticidas en vegetales mediante cromatografía de

gases-espectrometría de masa/masa (GC-MS/MS)

La intensiva aplicación de pesticidas en cultivos de vegetales propicia su persistencia en

estos, y dependiendo de la concentración y toxicidad del pesticida puede llegar a perjudicar la
salud de los consumidores. (Ramírez, 2009). Por tanto, la Comunidad Europea (CE) y
gobiernos como Japón y Estados Unidos entre otros, han establecido los límites máximos
residuales (LMRs) para regular cada pesticida de los alimentos naturales.

Objetivo:
- Determinación de los pesticidas: Captan, (degradado a tetrahidroftalimida (THFI)),
carbofurán, endosulfán, malatión y metamidofos en calabacita, tomate verde y jitomate
saladette sobrepasaba los LMRs establecidos por la CE.
 Tabla 5. ​Características de los pesticidas de importancia utilizados en la investigación.
Tomado de: Ramírez, 2009.

Metodología:

Se realizó una extracción de los pesticidas con acetato de etilo como disolvente, debido a que
es la más empleada en el análisis multi-residuos de pesticidas en vegetales, además esta
técnica es relativamente sencilla, rápida y se recupera un porcentaje alto de los residuos de
pesticidas presentes en los vegetales (Garrido-Frenich, A. et al., 2004 y 2005; MartínezVidal,
J. L. et al., 2002 y 2006). y una separación y cuantificación empleando cromatografía de
gases acoplada a espectrometría de masa/masa (GC-MS/MS).

● Extracción con disolventes orgánicos:

1. Las muestras sólidas se homogenizan antes de la extracción mediante la molienda,
mezclado, agitado, aplastado, macerado, presurizado y pulverizado.
2. Después, una porción se licúa o agita con un disolvente orgánico o con una mezcla de
diferentes disolventes orgánicos.
 3. Después de agitar correctamente, puede centrifugarse y la fase orgánica se evapora
para obtener un volumen pequeño, o a la fase orgánica se le agrega sulfato de sodio
anhidro (Na2SO4) para eliminar el agua presente en la muestra.
4. En el primer caso, el residuo se re-disuelve en una mezcla de disolventes orgánicos y,
posteriormente se inyecta en el sistema de GC. En el segundo caso, el Na2SO4 se
separa, mediante la centrifugación o filtración, y el sobrenadante se concentra o
inyecta directamente en el cromatógrafo de gases.

Ya que las muestras alimenticias son complejas, suelen ser necesarios pasos de limpieza, para
eliminar pigmentos, proteínas, azúcares y ácidos grasos que interfieren con la detección de
pesticidas a niveles de trazas y se incluyen para evitar contaminación del sistema de GC, de
esta manera se reduce la cantidad de interferencias que provocan pérdida de resolución,
aunque aumenta el costo del análisis (Columé, A. et al., 2001).

● Técnicas de separación cromatográficas: Elección entre GC Y HPLC

La GC se emplea principalmente para pesticidas que se vaporizan fácilmente sin
degradarse, con puntos de ebullición por debajo de los 250°C y polaridades bajas
intermedias en el análisis. En cambio, HPLC se utiliza para pesticidas muy polares
que no son fácilmente vaporizables, con puntos de ebullición por encima de los 200°C
y que son lábiles térmicamente (Wylie, P. et al., 2008; Dömötörova, M.; Matisová, E.,
2008).

● Columnas capilares en análisis de pesticidas mediante GC

Involucra el uso de columnas capilares, las cuales poseen diámetros internos (d.i.)
menores a 1 mm, paredes generalmente recubiertas de una película de fase
estacionaria. El uso de columnas capilares permite una mejor resolución y separación
rápida de componentes comparadas con las columnas empacadas (d.i. mayores a 1
mm)

Tabla 6. ​. Algunas columnas capilares empleadas en el análisis de residuos de pesticidas en

alimentos. Tomado de: Ramírez, 2009.
Las columnas capilares empleadas en la GC para el análisis de pesticidas en alimentos
habitualmente poseen una fase estacionaria generalmente de polímeros de polisiloxano o
polietilenglicoles. Además, debido a que los pesticidas en la muestra son de polaridad baja,
las columnas capilares son de polaridad baja y se prefieren aquellas con menor sangrado (ms)
y superficies inertes.

Tabla 7. ​Cantidad de muestra vegetal utilizada para el análisis. Tomado de: Ramírez, 2009.

Resultados:
La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masa/masa o en cascada con triple
cuadrupolo (GC-MS/MS-QqQ) permitió separar, identificar y cuantificar inequívocamente
los residuos de captan, carbofurán, alfa-endosulfán, malatión y metamidofos en las muestras
de calabacita, tomate verde y jitomate saladette.
Para cada compuesto, se crearon métodos de identificación y cuantificación. Para la
identificación se consideraron características de los iones producto calificadores: tiempos de
retención, porcentaje de incertidumbre y número de iones calificadores detectados. Para la
cuantificación del ión cuantificador se utilizó el método de adición estándar, empleando
cafeína como estándar interno, se evaluó el área e intensidad del pico del ión cuantificador.

Tabla 8. ​ Características del ión cuantificador y calificador de la cafeína en los vegetales

estudiados. Tomado de: Ramírez, 2009.
En la Tabla 8. se observa que en la curva de calibración STA, el porcentaje de incertidumbre
más bajo para el ión calificador (137 m/z) fue 20.5% en el jitomate saladette A y el más alto
de 32.7% en el jitomate saladette. Y que para la curva de calibración STB, el ión calificador
(137 m/z) tuvo porcentajes de incertidumbre entre 18.6-50.6 %, el porcentaje más bajo
corresponde a la calabacita y el más alto al jitomate saladette orgánico. Además, en todos los
vegetales, el ión cuantificador (109 m/z) tuvo áreas por encima del valor mínimo de
abundancia requerido (500).

Figura 5. ​Cromatograma de la solución de trabajo de 1.0 ppm de cada pesticida y 2.0 ppm de
estándar interno (cafeína) mostrando las relaciones S/R (Señal a ruido)
El valor de la relación S/R más bajo fue de: 48 para THFI.
Tomado de: Ramírez, 2009.

Figura 6. ​Cromatograma de la solución de trabajo 0,5 ppm de cada pesticida y 0,5 ppm de
estándar interno (cafeína) mostrando las relaciones S/R.
El valor más bajo de la relación S/R obtenido en esta solución fue de 13 para THFI.
Tomado de: Ramírez, 2009.
En todos los vegetales estudiados se detectaron residuos de al menos tres de los cinco
pesticidas estudiados:

- La concentración del metamidofos en tomate verde fue 15 veces el LMR, y en jitomate

saladette A (JSA) y B (JSB) fue 15 y 42 veces, respectivamente.
- La concentración de THFI en JSA fue 258 veces el LMR; en calabacita, tomate verde, JSB
y jitomate saladette orgánico (JSO) solamente se identificó.
- El malatión se cuantificó en calabacita, tomate verde, JSA y JSO (25.5, 1.3, 1.2 y 1.9 veces
el LMR, respectivamente); mientras que en JSB estuvo en el LMR.
- La concentración del endosulfán en JSB fue 10.9 veces el LMR, y en calabacita y JSO sólo
se identificó.

En los vegetales estudiados, los residuos de pesticidas cuantificados cuyas concentraciones

rebasaron el correspondiente LMR establecido por la CE, no pueden considerarse como
seguros para los consumidores, ya que dichas concentraciones pueden afectar su salud
causando daño neurológico crónico, disfunción de los sistemas inmune, reproductivo y
endocrino, entre otros, además la acumulación de estos pesticidas está relacionada con
enfermedades como el cáncer (Dömötörova, M.; Matisová, E., 2008).

Conclusiones.
● La cromatografía de gases es la mejor y más confiable vía para obtener la
composición real de una mezcla, estos datos pueden ser de gran utilidad debido a que
se pueden calcular diferentes propiedades de la mezcla partiendo de las propiedades
de cada componente.
● La elución es un proceso en la cual los solutos son lavados a través de una fase
estacionaria por el movimiento de una fase móvil. Un eluyente es un disolvente que se
usa para llevar los componentes de una mezcla a través de una fase estacionaria.
(Vega, J., & Muñoz, A., 2014)

REFERENCIAS
http://blog.utp.edu.co/docenciaedwin/files/2014/03/An%C3%A1lisis-Cualitativo-y-Cuantitativo.pdf
http://cenivam.uis.edu.co/cenivam/documentos/libros/1.pdf

Determinación de alcoholes por cromatografía de gases. (2014). Recuperado de:

https://es.slideshare.net/vegabner/determinacin-de-alcoholes-por-cromatografa-de-gases-41437838

Stashenko, E. (2009). ​ACEITES ESENCIALES​. [ebook] Bucaramanga. Available at:

http://cenivam.uis.edu.co/cenivam/documentos/libros/1.pdf
Vega, J., & Muñoz, A. (2014). Determinación de alcoholes por cromatografía de gases. Retrieved
from
https://es.slideshare.net/vegabner/determinacin-de-alcoholes-por-cromatografa-de-gases-41437838

Ramírez Milla Lucía Georgina (2009) TESIS: Determinación de pesticidas en vegetales mediante
cromatografía de gases-espectrometría de masa/masa (GC-MS/MS). UNIVERSIDAD
TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA Huajuapan de León, Oaxaca, México. Noviembre de 2009.

Garrido-Frenich, A.; González-Rodríguez, M. J.; Arrebola, F. J.; Martínez-Vidal, J. L. 2005.

“Potentiality of gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry in vanguard and
rearguard methods of pesticide residues in vegetables”. Analytical Chemistry. 77, 4640-4648.
​Bhanti, M.; Taneja, A. 2007. “Contamination of vegetables of different seasons with
organophosphorous pesticides and related health risk assessment in northern India”.
Chemosphere. 64, 1, 63-68. 70

Columé, A.; Cárdenas, S.; Gallego, M.; Valcárcel, M. 2001. “Semiautomatic multiresidue gas
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pesticides”. Analytica Chimica Acta. 436, 153-162.

Wylie, P.; Zweigenbaum, J.; Churley, M.; Meng, C-K.; Zhe, C. 2008. “Comprehensive
screening, confirmation, and quantification of organic pesticides in foods by GC-MS and
LC-MS”. Current Trends in Mass Spectrometry. 33-38.

Dömötörova, M.; Matisová, E. 2008. “Fast gas chromatography for pesticide residue
analysis”. Journal of Chromatography A. 1207, 1-16.