RESUMO

19ªEXPANDIDO
RAIB 199/056 345

IDENTIFICAÇÃO DE INIBIDORES DE SERINOPROTEASES NAS FRAÇÕES PROTÉICAS DE SEMENTES

DE SENNA OCCIDENTALIS COMO OS PROVÁVEIS FATORES ANTINUTRICIONAIS TÓXICOS PARA
ANIMAIS

F.S. Coelho*, A.P.C. Sanches, F.C.R Pinto**, T. Carvalho, S. Kiyota

Instituto Biológico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal, Av. Cons. Rodrigues Alves,
1252, CEP 04014-002, São Paulo, SP, Brasil. E-mail: kiyota@biologico.sp.gov.br

RESUMO

No presente trabalho, as frações protéicas obtidas de sementes de Senna occidentalis (So)

foram avaliadas quanto à presença de prováveis inibidores de serinoproteases com vistas
à proposição de possíveis mecanismos de ação para as atividades tóxicas observadas nos
ensaios de toxicidade in vivo em aves e camundongos. As atividades de inibição enzimática
dessas amostras foram avaliadas através de microensaios de detecção in vitro empregan-
do três diferentes sistemas enzimáticos: 1) tripsina e N-a-benzoil-DL-arginina-p-
nitroanilida (BAPNA); 2) papaína e azocaseína; 3) quimotripsina e azocaseína. As ativi-
dades inibitórias de proteases das frações protéicas de So foram calculadas em função dos
seus conteúdos protéicos e os resultados foram expressos em constantes de inibição (Ki)
correspondentes a concentrações mínimas de amostras capazes de reduzir a velocidade
dessas reações enzimáticas alterando os parâmetros cinéticos Km (constante de Michaelis-
Mentem) e Vmáx (velocidade máxima) determinados nas mesmas condições experimentais
padronizadas na ausência do suposto inibidor. Os resultados preliminares deste trabalho
evidenciaram a presença de inibidores nas frações protéicas de So que foram capazes de
inibir a tripsina e quimotripsina com valores de Ki variando de 1,2 a 69,2 mg.mL-1 e de 0,6
a 27,7 mg.mL-1, respectivamente. As mesmas amostras não foram capazes de inibir a
papaína. Esses resultados fornecem evidências sugestivas de um provável mecanismo de
ação tóxica em que tais inibidores poderiam atuar ou como fatores antinutricionais e/ou
protegendo os componentes tóxicos das frações protéicas de So contra enzimas proteolíticas
do trato digestivo dos animais tratados.

PALAVRAS-CHAVE: Senna occidentalis, inibidores de proteases, proteínas de sementes,

ensaios enzimáticos, detecção in vitro.

ABSTRACT

SERINOPROTEASES INHIBITORS AS ANTINUTRITIONAL FACTORS TOXIC TO

ANIMALS IN SENNA OCCIDENTALIS SEED PROTEIN FRACTIONS. In the present work,
Senna occidentalis (So) seed protein fractions were evaluated for the presence of protein(s)
component(s) capable of inhibiting proteases, which could help to explain the probable
mechanism of action for toxic activities observed in in vivo toxicity assays using chickens
and mice. Those activities were evaluated by in vitro enzymatic detection microassays
using: trypsin and Ná-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BAPNA); papain and azocasein;
and chymotrypsin and azocasein systems. The proteases inhibitory activities were
calculated as a function of samples protein content and results were expressed by Ki
(inhibition constant) corresponding to sample minimal concentrations capable of reducing
the velocity of enzymatic reactions by altering Km and Vmax, kinetic parameters determined
in the same standardized experimental conditions, in the absence of inhibitors. The
preliminary results from this work evidenced the presence of inhibitors in the So seed

*Bolsista CNPq/PIBIC.
**Bolsista FAPESP.

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protein fractions, which exhibited Ki values varying from 1.2 to 69.2 mg.mL-1 and from 0.6
to 27.7 mg.mL-1 for trypsin and chymotrypsin inhibitions, respectively. These samples
were not capable of inhibiting papain activity. These results provided new insights to
probable mechanism of toxic action of So seed protein fractions, in which serinoproteases
inhibitors could act as antinutritional factors and/or by protecting the toxic components
against proteolitic enzymes in the digestive tract of animals.

KEY WORDS: Senna occidentalis, proteases inhibitors, seed proteins, enzymatic assays, in-
vitro detection.

INTRODUÇÃO dos, pela primeira vez, da soja (Glycine max). Tais

As leguminosas são fontes importantes de proteí-
nas e peptídeos para a alimentação animal e têm sido
alvo de diversas investigações científicas devido à abun-
dância desses compostos atuando nos mecanismos de
defesa dessas plantas. Dentre eles, destacam-se os
inibidores de enzimas digestivas, lectinas, quitinases,
defensinas, glucanases, etc. que exercem funções im-
portantes de defesa contra o ataque de insetos, preda-
dores e patógenos, tais como, bactérias e fungos (OLI-
VEIRA et al., 2002; ZHU-SALZMAN et al., 1998; DAYLER et al.,
2005; YE & NG, 2005; PELEGRINI & FRANCO, 2005).
Diferentes proteínas atuando com sinergismo bem
como proteínas multifuncionais podem ser encontra-
das em uma mesma espécie vegetal contribuindo na
formação de barreiras de defesa da planta (MELO et
al., 2002).
Os inibidores de proteases são proteínas capazes
de suprimir as atividades proteolíticas de enzimas di-
gestivas de animais, tais como, tripsina, quimotripsina,
amilase, carboxipeptidases, cisteíno-peptidases, etc,
formando complexos estequiométricos estáveis. Quan-
do ingeridos por animais ou pelo homem, esses
inibidores atuam de forma negativa nos processos de
digestão e absorção, diminuindo a biodisponibilidade
dos nutrientes e levando à perda de peso,
hepatotoxicidade, hipertrofia pancreática e morte.
Por outro lado, no que se refere à defesa das plan-
tas, as fitocistatinas se destacam como inibidores de
proteinases cisteínicas que possuem atividades ini-
bitórias contra proteases exógenas de pestes de inse-
tos coleópteros e nematóides. Esses compostos vêm
sendo investigados quanto a sua expressão em plan-
tas transgênicas com a finalidade de aumentar a re-
sistência da planta hospedeira contra o ataque de in-
setos (LECARDONNEL et al., 1999).
Os inibidores de proteases estão amplamente dis-
tribuídos em uma variedade de plantas de diferentes
famílias botânicas, sendo conhecidas, pelo menos, 10
famílias que inibem, especificamente, cada uma das 4
classes de enzimas proteolíticas (serino-proteases,
cisteíno-proteases, proteases aspárticas e
metaloproteases).
Os inibidores de serino-proteases são encontra-
dos principalmente nas leguminosas e foram isola-
inibidores mostraram ser capazes de atuar também
como antinutrientes. Os principais tipos de
inibidores de serinoproteases de soja (SBPI) mais
conhecidos e melhor estudados são os inibidores
Kunitz (KSTI) e os inibidores Bowman-Birk (BBI).
Esses inibidores são proteínas termo-estáveis e re-
sistentes ao aquecimento em temperaturas acima de
70°C. Os KSTIs apresentam massas moleculares en-
tre 19 a 22 kDa que podem conter de 170 a 200 resí-
duos de aminoácidos e uma ou duas ligações
dissulfeto intra-cadeias. Esses KSTIs inibem forte-
mente a tripsina e são fracos inibidores da
quimotripsina. Já os BBIs são proteínas pequenas,
tipicamente, com 60-90 resíduos de aminoácidos,
ricas em cisteína, alto grau de homologia de seqüên-
cias apresentando massas moleculares de 8 a 16 kDa.
Os BBIs possuem várias ligações dissulfeto altamen-
te conservadas formando uma rede que ajuda a man-
ter uma estrutura rígida. Nas dicotiledôneas, a mas-
sa molecular dos BBIs é ~8 kDa, enquanto que, as
monocotiledôneas contem inibidores BBI que po-
dem ser divididos em outras duas classes, uma com
as de ~8 kDa de tamanho que possuem um sítio
reativo com atividade anti-tríptica e outra com as de
~16 kDa com dois sítios reativos. Esses compostos
possuem uma seqüência repetitiva, de 4 e 8 kDa, res-
pectivamente, sugerida como sendo o resultado da
duplicação do gen. Os BBIs inibem fortemente tanto
a tripsina como a quimotripsina em sítios de liga-
ções independentes (ODANI & IKENAKA, 1973; DIPIETRO
& LIENER, 1980).
A Senna occidentalis é uma erva daninha da família
das leguminosas, freqüentemente presentes nas pas-
tagens e nas culturas de cereais, como milho, sorgo e
soja, utilizadas na produção de rações para animais.
A leguminosa tem sido associada a diversos casos de
intoxicação de animais por ingestão espontânea
(COLVIN et al., 1986). Em trabalho anterior, frações
protéicas derivadas do extrato aquoso de sementes
de So mostraram serem capazes de afetar as repostas
imunes humoral e celular de camundongos (PINTO et
al.,2005). Além disso, essas frações foram tóxicas para
o fígado e órgãos linfóides (timo, bursa de Fabricius e
baço) em ensaios de toxicidade in vivo em aves de
corte (PINTO et al.,2006).

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Neste estudo, foi investigada a presença de prová-
veis inibidores de serino-proteases (tripsina,
quimotripsina) e papaína (cisteíno-peptidases) nos
extratos protéicos de sementes de Senna occidentalis (So).
Os resultados preliminares deste trabalho estão
mostrados a seguir e fornecem evidências sugestivas
de um provável mecanismo de ação para as ativida-
des tóxicas das frações protéicas de So observadas
nos animais.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
Extrato bruto protéico de Senna occidentalis (EB) e
suas frações obtidas através da precipitação
fracionada com sulfato de amônio (F25, F50, F75).
As enzimas tripsina, quimotripsina e papaína bem
como os substratos N-abenzoil-DL-arginina-r-
nitroanilida (BAPNA) e azocaseína.
Métodos
Ensaios de cinética e inibição de Tripsina
Os ensaios de atividade da tripsina, na ausência
ou na presença de inibidor, foram realizados empre-
gando: soluções estoque de tripsina (E) 5,0 mg/mL
em tampão de enzima (TE) (Tris-HCl 50 mmol.L-1, pH
7,5, em presença de CaCl2 20 mmol.L-1) e de BAPNA
100 mM em dimetilsulfóxido (DMSO). 10 mL da solu-
ção de tripsina 0,1 mg/mL (correspondente a 1 mg de
enzima) foram pré-ativadas em 450 mL TE, na ausên-
cia de inibidor ou na presença de frações de So em
concentrações variadas (10 – 50 mL), pela incubação
a 37ºC por 10 min. 140 mL de diferentes concentra-
ções de BAPNA (0,25 a 3,2 mmol.L-1) e 200 mL DMSO
25%/TE foram adicionadas aos tubos contendo
tripsina ativada e a mistura reacional em volume fi-
nal de 0,5 mL foi incubada por mais 15 min a 37ºC. A
reação enzimática foi interrompida com a adição de
solução de ácido acético 30% (AcOH 30%) e as
absorbâncias do produto formado (p-nitroanilina)
foram medidas no comprimento de onda de 410 nm.
As velocidades das reações enzimáticas expressas
em mmol.L-1.min-1foram calculadas pela equação de
Lambert Beer considerando a variação DA410 em 15 min
de reação e o coeficiente de extinção molar da p-
nitroanilina e/Tris-HCl = 7680 mol.L-1.cm-1. Os valo-
res de Km e Vmáx da tripsina foram determinados
através dos gráficos de Michaelis-Menten e duplo-recí-
proco de Lineweaver-Burk.
Ensaios de cinética e inibição de Quimotripsina
Os ensaios de inibição de quimotripsina foram
realizados empregando a azocaseína como substrato.
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Soluções estoque da quimotripsina 1,0 mg/mL e
azocaseína 0,4% foram preparadas em TE (Tris-HCl
0,05M, pH 7,5 + CaCl2 0,02M). As reações de inibição
foram realizadas pela pré-incubação da mistura de
solução de quimotripsina (0,1 mg/mL – 10 mL) com
as frações de So diluídas em TE (10 – 50 mL), por
15min, 37º C. Após a incubação, foram adicionados
200 mL de azocaseína 0,2% em TE e a mistura
reacional com volume final de 0,5 mL foi incubada
por mais 30min, 37º C. A reação foi interrompida pela
adição de TCA 10% (150 mL). A mistura reacional foi
centrifugada e os sobrenadantes foram neutralizados
pela adição de NaOH 0,25 mol.L-1 (150 mL). As
absorbâncias foram medidas em comprimento de
onda de 440 nm. Para o cálculo das velocidades das
reações enzimáticas (mmol.L-1.min-1) foram conside-
rados a variação DA440 em 30 min de reação e o coefi-
ciente de extinção molar dos produtos da azocaseína
e/NaOH = 32-38 mol.L-1.cm-1.
Ensaios de cinética e inibição de Papaína
Os ensaios de inibição de papaína empregando a
azocaseína como substrato foram realizados como
descrito a seguir. A solução de papaína 0,2 mg/mL
em TE (Fosfato 0,25M, pH 6,0) foi incubada com uma
solução ativadora (SA) (EDTA 2mM + DTT 3mM) por
10 min, 37ºC. Em seguida, foram adicionadas as fra-
ções de So (10 – 50 mL) diluídas em TE a um volume
final de 400 mL e a mistura foi incubada por mais
10min, 37º C. Após a incubação, foram adicionados
200 mL de azocaseína 0,2% em TE e a mistura
reacional com volume final de 0,7 mL foi incubada
por mais 10 min, 37ºC. A reação foi interrompida pela
adição de TCA 10% (150 mL). A mistura reacional foi
centrifugada e os sobrenadantes foram neutralizados
pela adição de NaOH 0,25 mol.L-1 (150 mL). As
absorbâncias foram medidas em comprimento de
onda de 440 nm. As velocidades das reações
enzimáticas (mmol.L-1.min-1) foram calculadas como
no método anterior, considerando a variação DA440
em 30 min de reação e o coeficiente de extinção
molecular dos produtos da azocaseína e/NaOH =
32-38 mol.L-1.cm-1.
Determinação das constantes de inibição
enzimática (Ki)
Os valores de Ki foram calculados pelas seguintes
fórmulas:
[I ]
Kiapp 
vo  vi
vi
Kiapp
Ki 
Km  S
Km
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onde: inibitórias de tripsina com valores de Ki variando de

Kiapp = constante de inibição aparente;
[I] = concentração protéica do inibidor (μg/mL);
v0 = velocidade inicial (Vmax/2) na ausência do inibidor
(mmol.L-1.min-1 para tripsina;
mmol.L-1.min-1 para quimotripsina);
vi = velocidade da tripsina na presença do inibidor
(mmol.L-1.min-1 para tripsina;
mmol.L-1.min-1 para quimotripsina);Ki = constante
inibição (mg/mL);
[S]= concentração do substrato utilizada no ensaio de ini-
bição (mmol.L-1 ou %);
Km = constante de Michaelis-Menten .
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Tabela 1 Pode-se observar, nessa tabela, que to-
das as amostras testadas apresentaram atividades
1,2 a 69,2 mg/mL. Quanto menor o valor de Ki maior
a potência do inibidor, conseqüentemente, maior a
concentração do inibidor na fração. Sendo assim, den-
tre as amostras testadas, F25 mostrou ser a mais po-
tente, exibindo um Ki de 1,2 μg/mL, respectivamente.
As outras amostras inibiram a tripsina com Kis bas-
tante similares entre si (1,2 a 3,4 μg/mL) indicando a
presença de um potente inibidor nessas frações.
Nesses ensaios, foi empregado o fluoreto de
fenilmetanosulfonila (PMSF), um inibidor sintético
inespecífico de serino-proteases disponível comerci-
almente que, nas mesmas condições experimentais,
inibiu quase completamente a tripsina exibindo um
Ki da ordem de ng/mL.
Os resultados obtidos nos ensaios de inibição de
quimotripsina realizados com as mesmas amostras
derivadas dos extratos desementes de So estão mos-
trados na Tabela 2.

Tabela 1 - Resultados da inibição da tripsina pelo extrato bruto So (EB) e frações da precipitação com sulfato de amônio
(F25, F50, F75).
Inibidor (I) Concentração Tripsina BAPNA vi (mmol/L.min) Ki app* Ki **
Protéica (μg) (mmol/L) (μg/mL) (μg/mL)
(μg/mL)
EB 49,0 1,0 0,75 0,85 109,3 69,2
F25 1,9 1,0 0,75 0,61 1,8 1,2
F50 7,1 1,0 0,75 0,44 3,9 2,6
F75 14,3 1,0 0,75 0,33 5,3 3,4
PMSF 10,0 1,0 0,75 < 103 < 10-3 < 10-3
*Kiapp= constante de inibição aparente considerando: [I] = concentração protéica do inibidor na reação (mg /mL); vo
= velocidade inicial na ausência do inibidor (mmol.L-1.min-1); vi = velocidade da reação na presença do inibidor
(mmol.L-1.min-1).
**Ki = constante de inibição calculada considerando: Km = 1,38 mmol.L-1; Vmax = 2,45 mmol.L-1.min-1; S = 0, 75
mmol.L-1

Tabela 2 - Resultados da inibição da quimotripsina pelo extrato bruto So (EB) e frações da precipitação com sulfato de
amônio (F25, F50, F75).
Inibidor (I) Concentração Quimotripsina Azocaseína vi (mmol/L.min) Ki app* Ki **
Protéica (μg) (%) (μg/mL) (μg/mL)
(μg/mL)
EB 35,0 1,0 0,2 0,47 31,7 27,7
F25 5,1 1,0 0,2 0,48 4,8 4,2
F50 1,4 1,0 0,2 0,34 0,7 0,6
F75 10,3 1,0 0,2 0,48 9,4 8,2
PMSF 10,0 1,0 0,2 0,48 9,1 8,0
*Kiapp= constante de inibição aparente considerando: [I] = concentração protéica do inibidor na reação (mg/mL); vo =
velocidade inicial na ausência do inibidor (mmol.L-1.min-1); vi = velocidade da reação na presença do inibidor (mmol.L-
1
.min-1).
**Ki = constante de inibição calculada considerando: Km = 1,37%; Vmax = 1,99 mmol.L-1.min-1; S = 0,2%.

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Os resultados dessa tabela são semelhantes aos
apresentados na Tabela 1, sendo que a fração F50
exibiu atividade inibitória de quimotripsina mais
potente com um Ki de 0,6 mg/mL que foi inferior ao
observado para o PMSF (Ki = 8,0 mg/mL). Já as ati-
vidades inibitórias de quimotripsina observadas
para o extrato bruto de So bem como para as outras
frações protéicas (F25 e F75) foram comparáveis à
do PMSF, que foi menos potente do que para a
tripsina.
O extrato bruto e as frações protéicas de So foram
testados quanto à presença de possíveis fitocistatinas,
que são inibidores de enzimas digestivas envolvidas
com um dos mecanismos de defesa das plantas con-
tra o ataque de insetos.
Os valores de Km e vmáx encontrados nos ensai-
os para a detecção desse tipo de inibidores utilizan-
do a papaína 0,2 mg/mL em tampão fosfato e con-
centrações variáveis do substrato azocaseína (0,05 a
1,0%) foram: 0,92 e 5,71 mmol.L-1.min-1, respectiva-
mente.
Nenhuma das amostras apresentou atividades
inibitórias de papaína significativas (dados não mos-
trados).
Os resultados obtidos nesses ensaios com as fra-
ções protéicas de sementes de So foram indicativos
da presença de inibidores com atividades semelhan-
tes às encontradas para os inibidores protéicos
Bowman-Birk (BBI) isolados da soja (Glycine max)
que, como descrito anteriormente, inibem fortemente
tanto tripsina quanto a quimotripsina e também são
capazes de atuar como antinutrientes (DIPIETRO &
LIENER, 1980).
CONCLUSÕES
Neste trabalho foi evidenciada a presença de
inibidores nas frações protéicas de So que foram ca-
pazes de inibir as atividades proteolíticas da tripsina
e quimotripsina. As mesmas amostras não foram ca-
pazes de inibir a atividade da papaína.
Os resultados obtidos neste trabalho fornecem
evidências sugestivas de um provável mecanis-
mo de ação para as atividades tóxicas das fra-
ções protéicas de So observadas em aves e camun-
dongos. Os inibidores específicos de serino-
proteases presentes nessas frações poderiam es-
tar atuando ou como fatores antinutricionais e/
ou como protetores dos componentes tóxicos con-
tra as ações de enzimas proteolíticas do trato di-
gestivo dos animais. Estudos estruturais utilizan-
do os componentes protéicos isolados dessas fra-
ções, que possibilitem correlacionar a toxicidade
e a capacidade de inibição de serino-proteases,
estão em andamento.
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AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à FAPESP pelo apoio finan-
ceiro concedido ao projeto (FAPESP Proc. 03/09282-
7) e bolsa de Iniciação Científica (a FCRP – Proc. 04/
11934-5) e ao CNPq pela bolsa de Iniciação Científica
(a FSC PIBIC/IB - Proc.107793/2006-7).
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