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La inmovilización de L - Asparaginasa en materiales de soporte: una revisión

exhaustiva
Ahmet Ulu y Burhan Ates *
Departamento de Química de la Facultad de Ciencias y Artes de la Universidad Inonu, Malatya, 44280, Turquía

RESUMEN: Hay dos principales aplicaciones de L- asparaginasa (L-ASNasa): tratamiento de la leucemia y la industria
alimentaria. Sobre todo, su quimioterapéutico correo ff ect ha despertado el interés de los científicos fi c comunidad y los
científicos individuales. Por lo tanto, para proteger la actividad intrínseca y media de tiempo de L-ASNasa, varios
transportistas y técnicas de inmovilización para la inmovilización de L-ASNasa se han descrito en artículos. Por
desgracia, una revisión completa sobre la inmovilización de L-ASNasa no se ha escrito hasta ahora. En esta revisión,
hemos discutido a fondo los portadores de L-ASNasa ilustrando la inmovilización fi hallazgos incluyendo aplicaciones
tanto en el pasado y presente. Además, hemos puesto de manifiesto las ventajas y desventajas de la enzima
inmovilizada y la relacionó con forma libre. Creemos que esta revisión no sólo proporcionará información de fondo,
sino también orientar a los futuros desarrollos.

■ INTRODUCCIÓN

L- Asparaginasa (L-ASNasa, L- asparagina amino hidrolasa,

EC3.5.1.1) ha sido ampliamente utilizado como un fármaco quimioterapéutico en el
tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (ALL, principalmente en niños) y otras
enfermedades malignas incluyendo Hodgkin ' enfermedad s, leucemia mielocítica
aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia linfocítica crónica,
linfosarcoma
tratamiento, un retículo, y melanosarcoma debido a su alta e quimioterapéutico ff ect
durante años. 1 L-ASNasa ha mostrado lo siguiente quimioterapéutico e ff ect: L- Asparagina
es un aminoácido esencial para el crecimiento de células normales y cancerosas.
Las células normales pueden producir el ácido amino por medio de L- Figura 1. Estructural ilustración de la reacción de L-ASNasa
mecanismo.
asparagina sintetasa, pero si L- nivel de asparagina es insu FFI ciente, se toma de la
sangre. Sin embargo, debido a las células cancerosas no tener L- asparagina
sintetasa, deben utilizar los aminoácidos en la sangre. En presencia de base de la aplicación biosensor se basa en la actividad de L-ASNasa. Los iones
L-ASNasa, L- asparagina se hidroliza en L- aspartato y amoníaco. Así, las células de amonio resultantes de la hidrólisis de asparagina di ff erentiate pH debido al
cambio de color y de la absorción. 7
cancerosas son incapaces de dividirse y mueren. La reacción de hidrólisis de L-
Como se señaló anteriormente, L-ASNasa es un signi fi enzima no puede con una
asparagina es similar al mecanismo de dos pasos de serina proteasas y es como amplia gama de aplicaciones. Se utiliza inclusive en los cánceres de leucemia como
sigue: En primer lugar, el residuo nucleofílico de la enzima se activa con una base agente quimioterapéutico. Sin embargo, existen factores que limitan su
fuerte y ataca el átomo de carbono amida de L- asparagina, resultando en β- acil-enzima quimioterapéutico correo ff ect. Aunque la L-ASNasa se ha producido a partir de una
como un producto intermedio. La segunda etapa de reacción es un ataque sobre variedad de fuentes, tales como bacterias, levaduras, hongos, plantas, y
el carbono éster hecha por un nucleófilo activado por una molécula de agua ( Figura actinomicetos, comercial L-ASNasa ha sido obtenidos a partir de Escherichia coli (E.
1 ). 2 , 3 coli) y Erwinia chrysanthemi. 3 Debido a L-ASNasa es una enzima de origen bacteriano y
de alto peso molecular, se expone al cuerpo ' sistema inmunitario. Por lo tanto, la vida

Otra aplicación importante de la enzima está en la industria alimentaria. La media de L-ASNasa disminuye. Otro factor restrictivo es que, cuando L-ASNasa se

acrilamida se forma en los alimentos cocidos a altas temperaturas. Dado que es un inyecta en el paciente, que puede causar reacciones de hipersensibilidad rigurosos
potencialmente neurotóxico, genotóxico, carcinogénico y tóxico para el sistema tales como fiebre, erupciones cutáneas, reacciones alérgicas, e incluso
reproductivo, 4 hay informes que indican adversa correo ff refleja en la salud humana.
Debido a su actividad para convertir L- asparagina a L- aspartato, L-ASNasa signi fi cativamente
reduce la formación de acrilamida. 5

Recibido: 16 de de abril de, 2017

L-ASNasa también se utiliza en la tecnología de biosensores para detectar los niveles Revisado: 10 de mayo de 2017

de asparagina, tanto en la leucemia y la industria alimentaria. 6 los Publicado: 15 de mayo de 2017

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choque anafiláctico. 8 , 9 Además, es un medicamento muy caro, pero se requiere
en terapia, particularmente la LLA infantil. Para superar estas limitaciones, la
inmovilización de la enzima es una de las estrategias más utilizadas.
inmovilización de enzimas se puede considerar como la fijación de enzimas
nativas a di ff Erent matrices de soporte sólido resultante en disminución o pérdida
de la movilidad de la enzima. 10 , 11 versiones inmovilizadas de L-ASNasa se han
mejorado. Gracias a la inmovilización, la enzima inmovilizada mostró un aumento
en la vida media y signi fi cativamente mayor estabilidad a las reacciones alérgicas
en comparación con la enzima libre. Hasta ahora, L-ASNasa se inmovilizó
usando varios métodos químicos / físicos hacia Carrier natural o sintético (de
eritrocitos a poli (etilenglicol) (PEG)). Las matrices portadoras utilizadas para la
inmovilización de L-ASNasa se presentaron en
Figura 2 .
Figura 2. Ilustración de di ff matrices portadoras Erent para la inmovilización de L-ASNasa.
PEG es un polímero sintético que es no tóxico, hidrófilo, y soluble en agua.
Adicionalmente, que mejora la biocompatibilidad,
aumenta el tiempo de circulación de la sangre, y mejora la resistencia a la inespecí fi c
adsorción de proteínas. 12 , 13 Por lo tanto, comúnmente se ha utilizado en la
inmovilización de enzimas como una matriz de soporte. PEG-ASNasa L- (polietileno
glicol L- asparaginasa) es el fi formulación polimérica primer aprobado por la
Administración de Drogas y Alimentos (FDA) para el tratamiento del cáncer y todavía
se utiliza en el tratamiento. PEG-L-ASNasa es un modi fi versión ed de L-
asparaginasa formadas por unión del covalentemente a PEG en el proceso
conocido como PEGilación. 14 El proceso de pegilación se ilustra en la figura 3 . 15 PEGilaciónde actividad antitumoral, la enzima inmovilizada se ~ 20 veces más e ff caz de la libre
se ha desarrollado para disminuir la inmunogenicidad de la enzima y prolongar la
enzima ' s vida media en plasma. Se informó de que la vida media de L-ASNasa
nativa (de E. coli) fue de 1,28 días mediante inyección intramuscular, mientras que
la vida media de PEGilado L-ASNasa fue 5,73 días. dieciséis Además, después de
L-ASNasa se inyectó por vía intravenosa, el tiempo medio de PEGilado L-ASNasa
fue aproximadamente 19 veces mayor que la de no modificada fi ed L-ASNasa. El
incremento fue resultado de una mayor resistencia a la degradación con tripsina de
L-ASNasa. Por otro lado, aunque la hipersensibilidad
1599
revisión
Figura 3. Presentación esquemática de pegilada L-ASNasa.
reacciones a nativo L-ASNasa eran 32%, la reacción de hipersensibilidad
a PEGilado L-ASNasa era sólo el 18%. 17 Se demostró que la
inmovilización realmente mejora la enzima ' estabilidad s y propiedades
biotecnológicas.
Los vehículos para L-ASNasa inmovilización. Hasta ahora, diversos vehículos
tales como materiales orgánicos, inorgánicos, e híbridos han sido utilizados para
L-ASNasa inmovilización en la literatura. Casi todas las matrices de soporte para
L-ASNasa se catalogan en
tabla 1 . El objetivo de esta revisión es dar una visión general porque no hay
documentos sobre este tema. Por lo tanto, para una mejor comprensión, hemos
CLASSI fi ed el tipo de portadora, y las ventajas o desventajas de inmovilizado
L-ASNasa se compararon con el de la libre. Al mismo tiempo, pensamos que es
necesario para resumir la información disponible inmovilización. Por este motivo,
hemos recopilado los resultados más interesantes, pH óptimo y la temperatura, la
constante de Michaelis ( K metro), y propiedades de estabilidad de la L-ASNasa
inmovilizada, y estos resultados se enumeran en Tabla 2 . Estas tablas
proporcionan información importante para los investigadores interesados ​para la
selección del portador / método más apropiado para la inmovilización de
L-ASNasa.
L-ASNasa inmovilización sobre soportes orgánicos. soportes orgánicos están a
la vanguardia de la inmovilización de L-ASNasa. Estos portadores orgánicos se
pueden dividir en dos clases principales como portadores naturales derivados de
fuentes renovables y petrolera-derivan portadores sintéticos. Además, los
nanomateriales orgánicos se consideran una clase adicional. Las fuentes naturales
se han utilizado constantemente en la inmovilización de enzimas. 18 Estos materiales
no son tóxicos, biocompatibles y biodegradables. Además, sus grupos funcionales
reactivos (tales como grupos amino e hidroxilo) hacen posible el acoplamiento de
enzimas y permite de esta manera una mayor carga de enzima. 19 , 20 Por lo tanto, son
materiales prominentes para la inmovilización de enzimas. Los hidratos de carbono
(celulosa, dextrano, almidón, quitosano, quitina y), proteínas (albúmina, gelatina,
colágeno, seda fi bras, y seda fi Broin), y los lípidos son materiales más preferidos por
los investigadores. En la literatura, se han reportado portadores naturales de
L-ASNasa utilizando di ff técnicas Erent inmovilización. Estos portadores están
ordenadas cronológicamente a continuación. Poznansky et al. 21 se muestra ventajas
en el uso de L- ASNasa-albúmina como un agente de quimioterapia. El polímero de
L-ASNasealbumin era más estable a la proteolisis que de enzima libre. En términos
L-ASNasa. Al mismo tiempo, se SIGNI fi cativamente aumentó en la inhibición del
crecimiento celular de las células tumorales pancreáticas humanas. Del mismo
modo, Uren y compañeros de trabajo 22 poli unido covalentemente ( DL alanina)
péptidos a residuos de lisilo en la superficie de Erwinia carotovora L-ASNasa.
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Tabla 1. Varios portadores para la inmovilización de L-ASNasa una

inmovilización inmovilización
portador método refs portador método refs

Orgánico Orgánico

Albúmina reticulación 21 nanopartículas de PLGA encapsulación 68 , 69

Escuela politécnica( DL alanina) péptidos unión covalente 22 nanocápsulas PHVB encapsulación 71

dextrano unión covalente 23 nanopartículas magnéticas de hidrogel atrapamiento 72

El sulfato de dextrano modificación 24 nanopartícula fibroína de seda atrapamiento 74

química
nanofibras PANI unión covalente 75
El quitosano adsorción 25
nanopartículas PVDMA unión covalente 76
NO- carboximetil quitosano modificación 26
Inorgánico
química
gel de sílice adsorción 77 , 78 , 81
ácido colomínico unión covalente 27
celita adsorción 77 , 78
Glioxilo-agarosa unión covalente 28
Fosfato tricálcico adsorción 77 , 78
Agarosa-glutaraldehído unión covalente 29
Carbón activado unión covalente 79
Levan fructosa unión covalente 30
Híbrido
La inulina modificación 31
química PEG-albúmina modificación 82 , 83
química
las células rojas de la sangre encapsulación 33
El calcio alginato-gelatina reticulación 84
El alginato, gelatina atrapamiento 34
Poli (dextrano / L- arginina) -CaCO 3 encapsulación 85
fibroína de seda unión covalente 35 , 38
PEG-quitosano y glicol-quitosano conjugación 86
sericina de seda unión covalente 36 , 37
nanopartículas de quitosano-TPP encapsulación 87
Ácidos grasos unión covalente 40
PMMA-S, de pHEMA-S, y P modificación 88 - 90
BSA reticulación 41
(Maa- co- MMA) -S química
fosfolípido DPPC adsorción 48 una Símbolos: BSA, albúmina de suero bovino; DPPC, dipalmitoilfosfatidilcolina; P
CLAVIJA unión covalente 51 (VP- co- AC), poli ( NORTE- vinylpyrrolidone- co- acroleína); P (VP- co- MA), poli ( NORTE-
tubos de nylon unión covalente 57 vinylpyrrolidone- co- anhídrido maleico); PEG, polietilenglicol; CLAVIJA- sol- P (VMP),
poliacrilamida atrapamiento 58 , 59 polietilenglicol injertado vinilpirrolidona - copolímeros de anhídrido maleico; P (GMA co-
P (VP- co- C.A) unión covalente 60 EDMA), poli (metacrilato de glicidilo co- dimetacrilato de etileno); PLGA: poli ( D, L- lactida
P (VP- co- MAMÁ) modificación 61 co- glicolida); PHBV, poli (3-hidroxibutirato- co- 3-hidroxivalerato); PANI, la polianilina;
química PVDMA, poli (2-vinil-4,4-dimetilazlactona); TPP, tripolifosfato; PMMA, poli
CLAVIJA- sol- P (VMP) modificación 62 (metacrilato de metilo); pHEMA, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo); P (Maa- co- MMA),
química poli (ácido metacrílico co- metacrilato de metilo); S, almidón.
Resina epoxica unión covalente 63

poliimida atrapamiento 64

Amberlite IR-120 iónica de unión sesenta y cinco

P (GMA co- EDMA) unión covalente 66

Los autores observaron que la enzima inmovilizada mostró menos inmunogenicidad
en ratones y 100 veces más larga media-tiempo en plasma de mono rhesus.
Wileman et al. 23 dextrano soluble preparado / L-ASNasa (de
Erwinia carotovora) conjugados utilizando la unión covalente. La modi preparados fi
ed L-ASNasa mantuvo 50% de su actividad inicial y exhibió una notable
resistencia a la proteolisis por tripsina y la quimotripsina y la inactivación por
especí-L ASNase- fi anticuerpo c. En la realización de en vivo pruebas, conejos
podían tolerar dosis múltiples de conjugado L-ASNasa sin desarrollar inmunidad a
la enzima. El equipo de trabajo informó que debido a que el tiempo medio de
modi fi ed L-ASNasa aumenta y disminuye la reactividad de antígeno, que puede
ser utilizado en aplicaciones terapéuticas. Resultados similares se logran
mediante Karsakevich et al. 24 para L-ASNasa inmovilizado sobre sulfato de
dextrano polímero biológicamente activo. Estos resultados son notables en que el
aumento de las propiedades terapéuticas de L-ASNasa y dextrano podrían ser
una alternativa natural a PEG. Quian et al. 25 realizado la inmovilización de E. coli L-
ASNasa en una microesfera quitosano. Los resultados mostraron que la enzima
inmovilizada tenía alta actividad enzimática y era más estable frente a la tripsina,
cuando se compara con la enzima libre. En otro trabajo de Quian et al., 26 NO- carboximetilet al. 28 , 29 coinmovilizadas L-ASNasa (de E. coli) y glutamato deshidrogenasa en
quitosano se utilizó químicamente a L-ASNasa para la aplicación terapéutica.
Como resultado de la inmovilización, la enzima era más de 33 veces más y perdió
completamente su antigenicidad hacia anti-
asparaginasa en comparación con la libre L-ASNasa. Después de la inmovilización
del K metro valores disminuyeron en general y V máx valores aumentaron. Sin embargo,
no hubo ningún cambio en K metro y V máx de las enzimas inmovilizadas. Los autores
afirmaron que la una FFI nidad entre la enzima y el sustrato no era una ff ected por
modi químico fi catión. Por otra parte, la enzima inmovilizada era más estable frente a
la tripsina y α- chyrnotrypsin. Por lo tanto, los autores sugirieron que la inmovilización
permitió una disminución en su antigenicidad y aumento de su vida media
plasmática. La L-ASNasa de Erwinia carotovora se inmovilizó a colomínico ácido
como un ácido polisiálico en la obra de Fernandes y Gregoriadis. 27 la alcanzado K metro
y V máx valores para la L-ASNasa inmovilizado aumentaron en comparación con la
forma libre. Después de incubación de 6 h (h) en el plasma sanguíneo del ratón a 37
° C, mientras que la enzima libre se redujo a 13,5% de su actividad, la enzima
inmovilizada retuvo 65 - 83% de su actividad en condiciones similares. En este
punto, los ácidos polisiálicos tales como ácido colomínico podrían usarse como un
vehículo para mejorar su e ff uso reflexivo en la terapéutica de la L-ASNasa. Balcao
glioxil- de agarosa y agaroseglutaraldehyde. Dedujeron que coimmobilization de
dos enzimas proporcionadas ventajas importantes en comparación con la forma
libre. También en 2001, Vina et al. 30 unido L-ASNasa a biológicamente activo levan
fructosa polisacárido a través de unión covalente.

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Tabla 2. Obtenido de inmovilización Resultados de inmovilizada L- ASNasa una terminado E. coli ASNasa para el fi remisión primero de todos. 32 Por lo tanto, Kwon
et al. 33 encapsulado L-ASNasa en células rojas de la sangre (RBC) ( Figura 4 ). Su
hipótesis es que RBC superar
pH óptimo parámetro
y la cinético estabilidad estabilidad
matriz portadora temperatura K metro térmica de almacenamientorefs

inulina 8.0, 50 ° do 0,01 mM 65 ° C, 30

m: 66% 55 h: 50% 31
sericina de seda 6.5 - 8.0, 60 ° C 1,2 mM 60 ° C, 30 m: 30% 37 ° C, 8 37
d: 50%

seda fi Broin 6.0 - 8.0, 60 ° C 0,84 mM 60 ° C, 30 38

m: 80% RT, 30 d:
80%

sericina de seda 5.0, 50 ° do 0,159 mM 60 ° C, 30 39

m: 90% 37 ° C, 84
h: 50%

poliacrilamida 7.0 3,3 mm 37 ° C, 15 D: 58

40%

CLAVIJA- sol- P (VMP) 7.0, 40 ° do 60 ° C, 30 m: t 0.5: 53 h 62

30%
Figura 4. Esquema para la actividad catalítica de la carga L-ASNasa en células de sangre rojas.
Amberlite IR-120 8.0, 40 ° do 0,033 mM 60 ° C, 30 sesenta y cinco
m: 100%

seda fi Broin 6.0 - 8.0, 50 ° C 2.4195 50 ° C, 30 D: 90% RT, 10 d: 74

mM 100%
problemas de toxicidad relacionados con la enzima. Debido a su abundante
PANI 8.5, 37 ° do 1,809 mM 60 ° C, 30 75
metro: suministro de sangre, eritrocitos protegerían L-ASNasa de la inactivación por la
~ 70% degradación proteolítica y La vigilancia inmune tal como la destrucción por el
Carbón activado 7.0, 60 ° do 90 ° C, 10 m: 79 sistema reticuloendotelial. Los autores también desarrollaron un nuevo método
62%
que proporciona RBC incorporación de la L-ASNasa usando la membrana de
PEG-albúmina 37 ° C, 50 D: 82
90%
trans- localización de protamina de bajo peso molecular (PBPM). Gracias a un

gelatina 8.5, 50 ° do 60 ° C, 30 m: 84 nuevo método, la vida media de RBC / PBPM-L-ASNasa se prolongó a 4,5 días,
Ca-alginate- 66% mientras que RBC-L-ASNasa fue de 2,4 días. La L-ASNasa producido por Streptomyces
Quitosano-TPP 9.0, 37 ° do 50
6,4
° C, 60 m: 70% 37 ° C, 87 gulbargensis se inmovilizó en gelatina y alginato-gelatina fi bras por entrap- ción. 34 El
d: 50%
rendimiento de actividad obtenidos con gelatina y gelatina alginate- fi fibras fue del
PMMA-S 8.5, 45 ° do 0,0256 4 ° C, 30 D: 88
44% y 69%, respectivamente. Por lo tanto, elegidos alginato-gelatina atrapado
mM 60%

pHEMA-S 8.5, 50 ° do 0,56 mM 4 ° C, 15 D: 89

P (Maa- co- 8.5, 35 - 40 ° C 0,0378
MMA) -S mM
una Las unidades de tiempo: M (minutos), d (días), h (hora). símbolos: K metro
(Michaelis - constante Menten),% (actividad residual), t 0.5: tiempo de vida media, RT: temperatura
ambiente.
El levano polisacárido fue producido por la oxidación con peryodato de levan
Después de la alquilación reductora. La unión covalente era un resultado de la
reacción directa de los grupos dialdehído de levan oxida con ε- grupos amino de
lisina y grupos amino N-terminales de L-ASNasa. La actividad enzimática
residual ( ≥ 55%) de L-ASNasa / polisacáridos conjugados levano se observó a ≤
24% grado de oxidación. Se encontró que el inmovilizado L-ASNasa demostró
una mayor actividad biocatalítica y estabilidad sobre las enzimas libres en
condiciones de ensayo similares.
L-ASNasa para más caracterizaciones. La enzima libre e inmovilizada mostrará la
60% misma temperatura óptima (40 ° DO). Sin embargo, la inmovilización cambió el pH
RT, 30 d: 90 óptimo de la enzima ambos. Seda fi Broin (SF) es una fi proteína fibrosa y se ha
80%
producido a partir de Bombyx mori. A pesar de que generalmente se ha utilizado
en la industria textil, sino que también se ha utilizado como un biomaterial en los
materiales de ingeniería de tejidos humanos, matrices de cultivo de células, y los
portadores para la modi fi cación de enzimas o fármacos debido a su alta
resistencia mecánica, estabilidad térmica, biocompatibilidad, biodegradabilidad y,
además de ser barato y fácil de fi Dakota del Norte. Debido SF tiene una alta
concentración de residuos de aminoácidos hidrófobos, es insoluble en agua.
sericina de seda, seda fi Broin, y seda fi nanopartículas Broin se utilizan
comúnmente para la inmovilización de L-ASNasa en la literatura. Por ejemplo, la
seda fi bioconjugados Broin-L-ASNasa fueron reportados por Wang y Cao. 35 Prepararon
las modi fi ed L-ASNasa por reacción directa de los grupos dialdehído de un
reticulante con el ε-

La inulina es un polisacárido natural producido por muchos tipos de plantas. Para

mejorar las propiedades farmacocinéticas e inmunológicas de L-ASNasa, Tabandeh
y Aminlari 31 sintetizado bioconjugados inulina-L-ASNasa oxidados y examinado su
fisicoquímicas y propiedades inmunológicas. enzima inmovilizada tenía buena, pH,
y la estabilidad de tripsina térmica. además, el K metro valor disminuyó
aproximadamente fi cinco veces. Los resultados indicaron que la una FFI nidad entre
la enzima inmovilizada con su sustrato se aumentó después del proceso de
grupos amino de la lisina y la NORTE- grupos amino terminales de la enzima y se
examinaron los parámetros óptimos de la modi fi enzima ed. Considerando que la
actividad relativa de libre L-ASNasa disminución en el pH por debajo de 6,0 y por
encima de 8,0, modi fi ed L-ASNasa mantuvo su estabilidad de pH 4,0 a 9,0. La
estabilidad térmica de ambos se determinó de 30 a 80 ° C. De acuerdo con los

inmovilización. El tiempo medio de la enzima libre e inmovilizada fue de 20 y 55 h resultados obtenidos, por debajo de 50 ° C, ambas L-ASNases mostraron ~ 90% de

en el suero humano, respectivamente. Por otra parte, los bioconjugados de actividad relativa. Sin embargo, libre de L-ASNasa a punto de perder su actividad

inulina-L- ASNasa oxidados muestran una disminución en el título de anticuerpos y relativa a modi fi ed L-ASNasa a 80 ° DO; modi fi ed L-ASNasa demostró ~ 30% de

la inmunogenicidad después de la inyección repetida en conejos. La actividad relativa. modi fi ed L-ASNasa era más estable que libre de L-ASNasa contra la
proteólisis. En la literatura, hay muchas obras similares con el artículo anterior. polvo
inmunogenicidad es un problema importante debido al origen bacteriano de
de sericina de seda, 36 proteína sericina de seda, 37 seda fi Broin, 38
L-ASNasa en aplicaciones médicas. Por desgracia, se informó que pegaspargasa
no ha demostrado superioridad

y péptidos sericina de seda 39 fueron utilizados para L-ASNasa inmovilización

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ción. En todos ellos, la L-ASNasa fue mejorada contra la desnaturalización factores
después de modi fi catión. ashra fi et al. 40 sintetizados conjugados de lípido / L-ASNasa
con el fin de hacer frente a limitaciones de la actividad de la libre L-ASNasa utilizando
(ácido láurico corto, C 12), medio (ácido palmítico C dieciséis), y (ácido behénico largo, C 22) ácidos ampliamente utilizado para la inmovilización de enzimas en ultrafina fi LMS
grasos. Se espera que los lípidos conjugados / LASNase pueden mejorar la
estabilidad, vida media biológica, y la actividad biológica de la LASNase. La unión
covalente se prefiere como el método de inmovilización. El grupo amina de la lisina
en L-ASNasa se conjugó con el grupo carboxílico de los ácidos grasos. En este
trabajo, se fi primero realizado optimizaciones necesarias, tales como relación de
lípido: L-ASNasa, tiempo de reacción y medio de reacción. Entonces, tanto la enzima
libre y los conjugados de lípidos / L-ASNasa sintetizados se caracterizaron por el
grado de conjugación, tamaño de partícula, distribución de tamaño, el potencial zeta y
la actividad enzimática. LASNase libre se comparó con lípidos / LASNase conjugados
de pH correo ff ect, in vitro medio-tiempo (phosphatebu ff solución salina Ered
(abreviada PBS) y plasma), K metro, y la digestión con tripsina. Según los resultados, el
intervalo de pH óptimo de inmovilizado L-ASNasa era más grande que la de la
enzima libre. El intervalo de pH óptimo de la enzima libre fue de 7,5 - 8,5, mientras que
la de modi fi enzima ed era 6,5 - 9.0. El sitio activo de modi fi ed L- ASNasa estaba
protegido contra valores altos / bajos de pH y mejoró la estabilidad del pH a través de
modi químico fi catión. La reducción en el K metro valor era una creciente indicativa de una FFI sintéticos son sus propiedades físicas, naturaleza de los grupos reactivos, y micro
nidad para el sustrato de la modi fi ed L-ASNasa. los K metro valor de todas las modi fi ed
L-ASNasa fue menor enzima libre, pero el ácido behénico / LASNase tenía el más
bajo K metro valores. La vida media de la enzima libre en PBS y plasma se determinó
como 19 y 21 h, respectivamente. bioconjugados de lípidos mejoraron in vitro un
medio en tiempo de L-ASNasa tanto en PBS y plasma. Por ejemplo, la media de
tiempo de modi fi enzima ed se aumentó a 46 h en plasma cuando se usa ácido
palmítico / L-ASNasa. Además, la estabilidad de modi fi ed L-ASNasa fue investigado
frente a la digestión de tripsina. La resistencia de la modi fi ed L-ASNasa a digestión
con tripsina era distintivamente mayor que la de la enzima libre. A pesar de que la
enzima libre mantiene 13,8% de su actividad inicial después de 30 min, la modi fi enzima
ed (ácido behénico / L-ASNasa) mantenida ~ 80% de su actividad inicial. los L- biosensor
asparagina que tiene alta sensibilidad, bajo coste, junto con una buena estabilidad y
selectividad puede contribuir considerablemente a las aplicaciones hacia la comida y
la química clínica. En un estudio reciente, una novela biosensor fue diseñado usando
una nueva forma de L-ASNasa de una cepa de Erwinia carotovora ( EcaLASNase) y se
usó para la determinación de L- asparagina en muestras biológicas (patata y suero
humano). La enzima se inmovilizó por entrecruzamiento con albúmina y
glutaraldehído de suero bovino (BSA). Mientras que la enzima libre perdió totalmente
su actividad después de 8 días de incubación a 4 ° C, la enzima inmovilizada
mantenido a aproximadamente 50% de su actividad intrínseca después de
aproximadamente 30 días bajo las mismas condiciones. El biosensor mostró una alta
sensibilidad para la detección de L-
asparagina con un intervalo lineal de 10 - 200 μ M y un límite de detección de 10 μ
M. Además, el método ' s reproducibilidad y L-
asparagina recuperación media eran 3 - 6% y 101,5%, respectivamente. El biosensor de
microplacas diseñado proporciona un enfoque novedoso para especi fi c, conveniente,
costo-e ff reflexivo, y la medición y el análisis de la rápida L- asparagina. 41
la inmovilización de enzimas en Langmuir y Langmuir -
Blodgett fi LMS de lípidos es una estrategia conveniente para controlar la actividad
catalítica en el nivel molecular. 42 Puesto que la conservación de la actividad se basa
en las interacciones a nivel molecular, el entorno molecular proporcionada por el lípido -
sistema enzimático
1602
revisión
pueden preservar la actividad catalítica después de semanas. 43 , 44 El Langmuir lípidos - técnica
Blodgett tiene ventajas tales como el control preciso de espesor, composición, la
elasticidad de la superficie, y la densidad molecular; Por lo tanto, ha sido
particularmente en aplicaciones de sensores. 45 - 47 Rocha Júnior y Caseli 48 puesto de
manifiesto que los lípidos de Langmuir y Langmuir - Blodgett ultrafino fi LMS se han
utilizado para la inmovilización de L-ASNasa a través de la adsorción. En el estudio,
L-ASNasa se inmovilizó sobre monocapas de Langmuir de la
dipalmitoilfosfatidilcolina fosfolípidos (DPPC), que fue elegido debido a la abundancia
en varias células. La enzima inmovilizada en el lípido ultrafina fi LMS conservan más
del 78% de la actividad enzimática después de 30 días, mientras que medio
homogéneo conserva menos del 13%. Por lo tanto, el lípido fi LMS son una matriz de
soporte adecuada para proteger la actividad de L-ASNasa y también pueden ser
considerados para la detección de asparagina.
El segundo tipo de fuentes orgánicas utilizadas para la inmovilización de
L-ASNasa es portadores sintéticos. Las principales ventajas de portadores
y macro-medio ambiente. 49 Sin embargo, ellos no son renovables, no degradable,
y causar complicaciones graves en el cuerpo cuando se utilizaron. Por lo tanto, se
prefieren portadores sintéticos de biocompatibilidad para las enzimas, que se
utilizan como fármacos en el cuerpo. Debido a que es un polímero no iónico con
alta solubilidad acuosa y la biocompatibilidad, el portador sintético más importante
es PEG para L-ASNasa. 50 PEGL-ASNasa (pegaspargasa) es una forma LASNase
bioconjugadas comercial que se ha utilizado en terapia desde 1994. 31 Hay muchos
estudios sobre este soporte. Por ejemplo, en la obra de Soares et al., 51 se trata de
averiguar es estabilidad y actividad cambios PEG-L-ASNasa en di ff pH Erent y la
temperatura. trabajadores similares se reportaron un aumento en la estabilidad de
la enzima inmovilizada con PEG-modificado fi catión. 52 - 56 El trabajo demostró que la
actividad de inmovilizado L-ASNasa se mejoró notablemente en comparación con
la forma libre. Dado que el correo ff ect de PEGilación es un proceso probado, que
no era necesario dar una descripción de esta información. Nos centramos en los
portadores sintéticos aparte de PEG para la L-ASNasa. Con el fin de comparar los
parámetros de inmovilización y las propiedades cinéticas de la libre e inmovilizada
L-ASNasa, se inmoviliza en tubos de nylon mediante la unión por Allison et al
covalente. 57 Después de la inmovilización, el pH óptimo de la enzima no cambiar,
pero el rango de actividad óptima era limitado. Del mismo modo, la inmovilización
condujo a un gran aumento en la estabilidad térmica de la enzima. Además, una
disminución de la K metro se controló en comparación con la enzima libre. Mori et al. 58
preparado L-ASNasa atrapado en la red de gel de poliacrilamida. La L-ASNasa
inmovilizada mostró la mayor actividad catalítica cuando L- glutamina (23,7 μ mol /
min) y L- asparagina (22,6 μ Se han usado mol / min). La actividad máxima del libre
L-ASNasa fue a pH 8,0, mientras que inmovilizada L-ASNasa exhibió actividad
máxima a pH 7,0. Generalmente, el
K metro valor disminuye después de la inmovilización. sin embargo, el K metro de inmovilizó
L-ASNasa aumentó 200 veces en este trabajo. Los autores afirmaron que un
enrejado en gel de poliacrilamida semipermeable impide que la tasa de
permeabilización del sustrato. El inmovilizado L-ASNasa retuvo 40% de su actividad
original a lo largo de 15 días en condiciones de almacenamiento (pH 7,0, 37 ° C) y
mostró más resistencia que libre de L-ASNasa contra enzimas proteolíticas. Por otra
parte, con el fin de examinar el correo ff cacia de la L-ASNasa atrapado en la sangre,
un equipo de trabajo examinó asparagina, glutamina, y los niveles de concentración
de amoníaco en el
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Química bioconjugado
sangre fresca. Se informó de que los dos sustratos se scavenged por la L-ASNasa
atrapado en gel de poliacrilamida. Galaev et al. 59 también inmovilizada L-ASNasa en
gel de poliacrilamida. En comparación con la forma libre, inmovilizado L-ASNasa
está representada más estabilidad al pH, la desnaturalización, y la enzima
proteolítica, un aumento de 200 veces en la K metro. Por otra parte, inmovilizado
L-ASNasa hidroliza tanto L- y RE- isómeros de sustrato, pero el LASNase libre era
altamente estereoespecificidad fi do. Karsakevich et al. 60 copolímeros de
vinilpirrolidona y acroleína preparados para E. coli inmovilización L-ASNasa. Debido
a las interacciones entre la enzima y el portador, el inmovilizado L-ASNasa exhibió
pH y estabilidad térmica. Un estudio bastante similar fue reportado por Qian y
compañeros de trabajo 61 ese E. coli LASNase se inmovilizó sobre poli ( NORTE- vinylpyrrolidone-
co- anhídrido maleico) (P (VP- co- MAMÁ)). Después de la inmovilización, L-ASNasa
mostró más estabilidad a varios pH, la temperatura, y la estabilidad de
almacenamiento cuando se compara con la enzima intrínseca. El pH óptimo de la
enzima inmovilizada se movió ~ 0,8 unidad de pH más que la de la enzima libre
debido al microambiente polianiónico que rodea la enzima. La temperatura óptima
de la L-ASNasa inmovilizado se ~ 10 ° C más alta que la de la forma libre. Además, el
inmovilizado L-ASNasa fue notablemente resistente a la digestión de tripsina; libre
de L-ASNasa a punto de perder la totalidad de su actividad inicial.
Un trabajo similar se informó para inmovilizada L-ASNasa en vinilpirrolidona
polietilenglicol injertado - anhídrido maleico (PEG- sol- P (VMP)) copolímero por Qian
et al. 62 El objetivo del estudio era para disminuir la antigenicidad y para mejorar el
medio tiempo de la L-ASNasa en el suero. En primer lugar, PEG sol- P copolímero
(VMP) se sintetizó a través de copolimerización por radicales. Entonces, E. coli L-ASNasa determinar estos microrreactores enzimáticas, se calcularon las constantes
era químicamente modi fi ed con estos copolímeros. Para investigar los parámetros
de inmovilización, PEG sol- P (VMP) -4 modi fi ed L-ASNasa fue seleccionada como
vehículo, ya que dio los mejores resultados. enzima inmovilizada era más estable
que la enzima libre, especialmente en medio alcalino. No obstante, enzima
inmovilizada respondió con mayor sensibilidad que la enzima libre a la
temperatura. Por esa razón, los autores afirmaron que el movimiento térmico de
las cadenas de polímero en la enzima inmovilizada haría una ff ect la conformación
de la enzima mucho más vigorosamente a temperatura más alta. La enzima
inmovilizada también mostró una mejora de la digestión con tripsina.
Adicionalmente, en vivo un medio en tiempo de la enzima libre e inmovilizada fue
de 1,2 y 53 h en el plasma de conejos, respectivamente. La L-ASNasa se
inmovilizó covalentemente a una resina epoxi por Almendral et al. 63 El estudio se
basó en la determinación del espectro- fotométrico L- asparagina por Florida análisis
de inyección de flujo. El reactor se usa durante más de 5 meses y retenido
~ 88% de su actividad después de 700 determinaciones de origen. Por consiguiente,
los autores afirmaron que este enzimática
procedimiento de inmovilización fue más simple, estable, económico y operacional
que otros métodos. Uno de los fi intentos primeros en el desarrollo de biosensores
basados ​en L-ASNasa fue hecha por Erdogan et al. 64 Desarrollaron biosensor
amperométrico basado poliimida para la determinación de
L- asparagina en muestras de suero. Las poliimidas son atractivos debido a sus
excelentes propiedades mecánicas térmico, químico, eléctrico, y. Por lo tanto, una
membrana de poliamida se evaluó como portador para L- biosensor asparagina. El
diagrama esquemático de este proceso se ilustra en la Figura 5 . Los datos
experimentales demostraron que los biosensores propuestos mostraron una amplia
gama de detección lineal (15 - 113 μ M), reproducibilidad aceptable, alta sensibilidad,
estabilidad a largo plazo, y bajo límite de detección (1 × 10 - 6 METRO).
revisión
Figura 5. Diagrama esquemático de electrodo L-ASNasa / poliimida / Pt.
El-Refai et al. sesenta y cinco informado de una inmovilización con éxito y la mejora de
la estabilización de L-ASNasa sobre Amberlite IR-120 mediante la unión iónica. La
inmovilización no cambió pH óptimo (8,0) y temperatura (40 ° C) en comparación
con la enzima libre, pero mostraron una mayor termoestabilidad como resultado de
la inmovilización. La enzima inmovilizada retuvo la actividad 100% cuando se
expuso a 60 ° C y también retienen 70% de su actividad relativa a pH 9,0 durante
50 min. K metro era 0,0259 mM y 0,033 mM para libre e inmovilizada L-ASNasa,
respectivamente. V máx para la soluble y la enzima inmovilizada fue 757,6 U / mg de
proteína y 581 U / mg de proteína, respectivamente. Qiao et al. preparado
reactores monolíticos para L-ASNasa utilizando poli (glicidil metacrilato co- dimetacrilato
de etileno) (P- (GMA co- EDMA)) materiales. 66 , 67 Después, L-ASNasa se inmovilizó
covalentemente a la monolito polimérico y revestimiento en el capilar. Para
cinéticas. Los datos cinéticos eran K m =
3.8 μ METRO, V max = 106.2 μ M min - 1 para el monolito y K m = 7.7 μ METRO,
V max = 157,4 μ M min - 1 para el recubrimiento de reactores enzimáticos, respectivamente.
Además, la cantidad de L- aspartato en la salida del reactor se determinó periódicamente
utilizando la electroforesis microchip - inducida por láser Florida método de fluorescencia.
Después de 21 días, la disminución de L- valores aspartato no se detectó, pero se observó
una media disminución a los 28 días. Además de los materiales anteriormente
mencionados, algunos de los nuevos tipos de nanomateriales orgánicos (tales como
nanopartículas, nano fi ber, nanocompuesto, y nanoesferas) han sido atractivo debido al
tamaño sintonizable de poro, área de superficie alta, y e ff carga enzimática reflexivo. Por
lo tanto, ellos han demostrado una enorme promesa en la preparación de enzimas
inmovilizadas en los últimos años. En la literatura, se informó de muchos
nanotransportadores de base orgánica para la inmovilización de L-ASNasa.
Por ejemplo, L-ASNasa se inmovilizó sobre poli (lactida co-
glicolida) (PLGA) nanoesferas y se determinó que era en Florida las propiedades del
polímero uir tales como la carga de la enzima, la actividad, y in vitro liberar por Gaspar
y compañeros de trabajo. 68 Nanoesferas fueron fabricados por evaporación del
disolvente agua-en-aceite-en-agua. Entonces L-ASNasa fue inmovilizado por
encapsulación y su unión con fi confirmada por microscopía electrónica de transmisión
(TEM). En otro trabajo similar, 69 nanoesferas PLGA fueron explotadas para la
inmovilización de L-ASNasa a través de la encapsulación. También, Vasudev et al. 70 principalmente
mostró el correo ff ect de la PEGilación sobre la carga de la enzima, la actividad, y in
vitro lanzamiento. Por lo tanto, formularon pegilado L-ASNasa cargado nanopartículas
de PLGA y se comparan a la no modificada fi contraparte ed. Se encontró que la
PEGilación protegida la enzima contra la desnaturalización durante la encapsulación.
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Química bioconjugado
En otro estudio, Baran et al. 71 investigado la en vivo el medio tiempo del inmovilizado
L-ASNasa en poli recubierto heparina (3hydroxybutyrate- co- 3-hidroxivalerato) (PHBV)
nanocápsulas. Se aumentó el objetivo de su estudio en vivo un medio en tiempo de
LASNase y la disminución de la inmunogenicidad, así como la toxicidad. Con base en los
resultados de la actividad de la enzima en la sangre, en vivo un medio en tiempo de
encapsulado L-ASNasa era ~ 6,5 h, mientras que la de la no modificada fi ed L-ASNasa fue
entre 3 y 4 h. Además, los autores informaron que encapsulado L-ASNasa demostró
ningún efecto adverso correo ff ECTS y síntomas de anafilaxis después de la inyección a
los ratones, mientras que no modificada fi ed L-ASNasa llevó a reacciones de
hipersensibilidad.
Teodor et al. 72 preparados nanopartículas magnéticas de hidrogel utilizando
nanopartículas magnéticas y capas sucesivas de quitosano y ácido hialurónico. A
continuación, inmovilizados L-ASNasa en las nanopartículas magnéticas de hidrogel por
atrapamiento y se desarrollaban comportamiento de hinchamiento, comportamiento de
degradación, y la liberación de L-ASNasa de 7,0 a pH 4,5. Entrega de L-ASNasa se
determinó usando proteínas y ensayo de actividad de L-ASNasa. La liberación de
L-ASNasa es enormemente larga duración compara con la forma libre. La actividad
residual de la L-ASNasa inmovilizado permaneció igual después de 6 meses a partir de
la inmovilización durante el almacenamiento a 4 ° C. En consecuencia, preparado
nanotransportador biocompatible podría ser utilizado para la inmovilización de L-ASNasa.
El mismo grupo de investigación también informó de un polímero biocompatible para
agentes activos biológicos tales como la L-ASNasa en otro estudio. 73
Zhang et al. 74 seda preferida fi nanopartícula Broin (SFN) como portador natural
para la inmovilización de L-ASNasa. bioconjugados SFN / L-ASNasa eran brie Florida
y obtiene como sigue. La seda líquida se mezcló con L-ASNasa y se introdujo
rápidamente en exceso de acetona. Los bioconjugados / L-ASNasa SFN obtenidos
se preparan fácilmente mediante el aislamiento a partir de solución de acetona
mediante centrifugación. Posteriormente, modi fi se utilizó enzima ed para determinar
exhaustivamente los parámetros de inmovilización de rutina (de pH, estabilidad
térmica, estabilidad cinética y almacenamiento, etc.) de modi fi ed L-ASNasa y se
comparó con la enzima libre. El pH óptimo fue similar para los dos y fue de entre 6,0
y L-ASNasa inmovilización sobre portadores inorgánicos. A pesar de que los
8.0. Aunque el pH óptimo no cambió, la estabilidad del pH de modi fi ed
L-ASNasa mejorada sobre la de libre L-ASNasa. Lo mismo también es
cierto para temperatura óptima. La temperatura óptima fue de 50 ° C gratis y
modi fi enzima ed. Cuando L-ASNasa se atrapó en seda fi Broin, la una FFI nidad aplicaciones fuera de la medicina.
entre L-ASNasa y L- asparagina aumentó debido a que el sitio activo de
L-ASNasa no era una ff reflejada. por lo tanto, el K metro
valor de modi fi ed L-ASNasa fue inferior en 2,5 veces de la libre. Aunque libre de
L-ASNasa mostró actividad enzimática relativa del 60% durante 10 d en 4 ° C, SFN /
L-ASNasa retenido el 100% de su actividad original durante 10 d a temperatura
ambiente. Además, la enzima inmovilizada es más resistente al calor y a la digestión
por tripsina. nano polianilina fi BER (PANI) es otro nanotransportador para la
inmovilización de L-ASNasa por unión covalente. La polianilina tiene gran importancia
en los dispositivos de almacenamiento de energía, sensores y materiales biológicos
debido a la biocompatibilidad, alta resistencia a los factores ambientales, de alto
rendimiento, y la preparación fácil. En primer lugar, PANI se sintetizó y se caracteriza.
entonces L-ASNasa se inmovilizó covalentemente con nano polianilina fi (fibras Figura
6 ). Para evaluar la presencia de unión de la enzima, utilizaron FTIR, SEM, TEM, la
espectroscopia de rayos X de fotoelectrones (XPS), y DRX. Todos los resultados
indicaron que la interacción electrónica de LASNase y PANI. También, la presencia
de L-ASNasa era Veri fi ed en términos de actividad catalítica. enzima inmovilizada
mostró más actividad que la enzima libre y era menos una ff ected por
1604
revisión
La Figura 6. Representación esquemática de la inmovilización de la enzima L-ASNasa en nano
polianilina fi ber.
factores medioambientales. La base de los resultados de pH, pH óptimo fue de 8,5 por
tanto libre como inmovilizada L-ASNasa. Sin embargo, L- libre ASNasa exhibió ~ 30%
de actividad, mientras está inmovilizada L-ASNasa exhibió aproximadamente 70% de
actividad. Además, enzima inmovilizada era más estable que el uno libre para todos
los valores de pH (de 7,5 a 9,5). Se encontró que la temperatura óptima para ser 37 ° C
para ambas formas. Además, K metro valor de inmovilizado L- ASNasa era signi fi cativamente
menor que el de la libre L-ASNasa, después de la inmovilización. 75
Varios trabajadores diseñaron un reactor enzimático para L-ASNasa. Se
prepararon nanopartículas magnéticas funcionalizadas por poli
(2-vinil-4,4-dimetilazlactona) (PVDMA) usando una adición sible reversión - cadena
de fragmentación técnica de polimerización de transferencia. 76 L-ASNasa se
inmovilizó sobre un reactor de enzima fabricado ( Figura 7 ). El reactor
L-ASNasa preparado mostró alta capacidad de carga de 318,0 μ g mg - 1 nanopartículas
magnéticas. enzima inmovilizada retuvo 95,7% de su actividad original después
de su 10 uso repetido y más de
actividad 72,6% después de 10 semanas de almacenamiento. El trabajo indica que la
estabilidad y la actividad de la enzima se podrían mejorar aunque la inmovilización a
las nanopartículas magnéticas y el portador diseñado podría ser utilizada en varios
enfoques biológicos y clínicos.
portadores inorgánicos son de bajo costo y de fácil acceso, que no han sido utilizados
para la inmovilización de L-ASNasa. Debido a que los portadores biocompatibles se
han preferido para la inmovilización de L-ASNasa, no hay muchos artículos sobre
este tema en la literatura. Típicamente, se utilizaron estos portadores para otras
El gel de sílice, carbón activado, de Celite, y el fosfato tricálcico se utilizaron
como apoyo para la inmovilización de L-ASNasa por Sundaramoorthi et al. 77 y
El-Sayed et al. 78 Sundaramoorthi y compañeros de trabajo producen L-ASNasa de
aislados fúngicos que se aislaron a partir de muestras de suelo recogidas de di ff Erent
regiones del mar Arábigo. Se inmovilizaron L-ASNasa en di ff portadores Erent (es
decir, gel de sílice, agarosa, carbón activado, Celite, carboximetil celulosa, cáscara
de huevo, fosfato tricálcico) mediante la unión covalente y obtuvo el mayor
rendimiento de inmovilización con el portador de gel de sílice. Por otro lado,
El-Sayed et al. inmovilización evaluado, propiedades, y la actividad antitumoral de L-
ASNasa de frijol ( Vicia faba). Utilizaron adsorción simple como el método de
inmovilización L-ASNasa y la mejor portadora para L-ASNasa fue seleccionado
como gel de sílice con un especi fi la actividad de c de
2,75 U / mg de proteína. La enzima inmovilizada retuvo la actividad en el
intervalo de pH alcalino en comparación con la enzima libre, que informó de que
la estabilidad del inmovilizado L-ASNasa fue mayor que el de la libre L-ASNasa
en el intervalo de pH alcalino. La enzima inmovilizada fue mucho más estable
que su contraparte libre a temperatura más alta. Además, la citotoxicidad
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La Figura 7. Ilustración esquemática de inmovilización L-ASNasa sobre PVDMA-modi fi nanopartículas magnéticas ed. (Reproducido con permiso del Mu et al., 2014. 76 )
mi ff ect in vitro de grano de L-ASNasa sobre el crecimiento de líneas celulares tumorales
hepatocelular (Hep-G2) se estudió usando un ensayo de MTT. LASNase provocó una
inhibición gradual en el crecimiento celular y la IC calculado 50 valor fue de 217,71 μ g /
mL. Moharam y compañeros de trabajo 79 estudiado actividades antitumorales y
antioxidantes así como los parámetros de inmovilización (pH, térmica, y estabilidad de
almacenamiento) de inmovilizado L-ASNasa en carbón activado. En este estudio,
L-ASNasa se aisló a partir
Bacilo sp. R36 y estaba correo FFI cientemente inmovilizado por unión covalente
sobre carbono activado con un rendimiento inmovilización de 73,6%. Libre e
inmovilizada L-ASNasa exhibió el mismo pH óptimo a pH 7,0, mientras que la
temperatura óptima se aumentó desde 50 a 60 ° C para la enzima inmovilizada.
Además, enzima inmovilizada retuvo 100% de su actividad hasta 80 ° C. Además de
otros trabajos, este estudio también investigó IC 50 valor y propiedades antioxidantes
(eliminadores de DPPH) de L-ASNasa. Los resultados mostraron que la enzima
posee baja actividad de barrido con alta SC 50 ( un medio de concentración de
barrido máxima) valores de 325,4 μ g / ml en comparación con la actividad de
barrido de ácido ascórbico. El IC 50 valores de la enzima se calcularon como
112.19 μ g / ml y 218,7 μ g / ml para Hep-G2 y carcinoma de colon (HCT-116)
línea celular, respectivamente. En el mismo estudio, L-ASNasa de Bacillus
licheniformis
HSA3 CEPA - 1a se inmovilizó por el portador glutaraldehído-carbón activado
usando el acoplamiento covalente. 80 Evaluaron diversas características de
enzima inmovilizada como la temperatura óptima, pH, y la reutilización en
comparación con la enzima libre. Los autores observaron que el pH óptimo
cambió después de la inmovilización. Se informó de la capacidad de la proteína
enzima y su soporte de matriz como la razón de este cambio. Además, el
inmovilizado L-ASNasa retuvo su actividad inicial por 84,79% después de 2
veces el uso repetido.
Se consideró que la L-ASNasa tiene aplicaciones en la industria alimentaria, así
como la medicina. técnicas de inmovilización también se han utilizado para estos
estudios. Por ejemplo, musulmanes et al. 81
mejora investigado de la actividad y la estabilidad de LASNase. Se
aislaron L-ASNasa de Acinetobacter baumannii
y puri fi ed por cromatografía. entonces L-ASNasa se inmovilizó sobre gel de
sílice (de adsorción), y Sephadex G-50 (atrapamiento) se utiliza para retener la
actividad y aumentar la estabilidad de la enzima. Los autores afirmaron que la
adsorción era más e FFI ciente de atrapamiento para la inmovilización de
LASNase. Señalan que se encontró el inmovilizado L-ASNasa a ser estable
durante el funcionamiento continuo durante un mes y ser resistente al ataque
por enzimas proteolíticas, que condujeron a una mayor actividad y la
estabilidad de la L-ASNasa y el aumento
1605
revisión
bene fi t de su uso como aditivo alimentario en, por ejemplo, el pan, el trigo blanco y toda Florida
nuestra, y productos horneados.
L-ASNasa inmovilización en soportes híbridos. En esta revisión, portadores
híbridos fueron descritos como materiales derivados de ambas estructuras
sintéticas y naturales. portadores híbridos tienen propiedades útiles. Debido a que
los portadores contenían estructuras naturales, que son a la vez biocompatible y
biodegradable. Por otra parte, exhiben ventajas como grupos funcionales, diversas
propiedades físicas, y modi deseados fi cación de estructuras sintéticas. El nuevo
material que tiene propiedades superiores fue producido por la combinación de
estos dos materiales. portadores híbridos se han utilizado cada vez más en los
últimos tiempos para la inmovilización de enzimas. Estas obras están presentes en
relación con la inmovilización de L-ASNasa. Francois y Fortier 82 desarrollado un
enfoque para mejorar la estabilidad de la L-ASNasa. Prepararon una matriz de
hidrogel hecha de PEG-albúmina e investigaron la viabilidad de la inmovilización de E.
coli L-ASNasa. En este estudio, se utilizó albúmina para mejorar la
biocompatibilidad de PEG. Por lo tanto, esta matriz puede ser muy útil para
L-ASNasa debido a su buena biocompatibilidad y también proporcionará un
biorreactor funcional para su uso en vivo. Los autores observaron que la L-ASNasa
inmovilizado tenía una actividad óptima en comparación con la enzima libre en di ff pH
Erent. Después de 50 días de almacenamiento a 37 ° C, el inmovilizado L-ASNasa
mantuvo su actividad inicial (más de 90%). La enzima libre tuvo una actividad 43%,
mientras que la enzima inmovilizada retuvo 90% de su actividad. También, Francois
y compañeros de trabajo 83 evaluó el desempeño de los portadores de hidrogel de
PEG-albúmina biocompatibles en ratas. Inmovilizada L-ASNasa sobre el soporte
mostró un gran en vivo estabilidad después de 4 meses de la implantación. El e FFI ciencia
de inmovilizado L-ASNasa en alginato de calcio - compuesto de gelatina fue
estudiada por Youssef y AlOmair. 84 Se informó de que el gen L-ASNasa II fue
clonado a partir E. coli W3110, se purificó fi ed utilizando varios técnica de
cromatografía, y se purificó fi ed con SDS-PAGE. Finalmente, el puri fi enzima ed se
inmovilizó en alginato de calcio - compuesto de gelatina. De acuerdo a los resultados
obtenidos, inmovilizado y libre de L-ASNasa mostró actividad óptima a pH 8,5 y 7,5
y la temperatura óptima a 50 y 37 ° C, respectivamente. La L-ASNasa inmovilizado
mantiene completamente su actividad origen de 30 almacenamiento min a 60 ° C.
libre de glutaminasa Saccharomyces cerevisiae citoplasmática LASNase I se
encapsuló en microcápsulas de polielectrolitos multicapa biocompatibles por
Karamitros et al. 85 Utilizaron carbonato de calcio (CaCO 3) partículas como matriz de
soporte para la inmovilización de enzimas. Después, la matriz se recubre con
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catiónico (poli ( L- arginina)) y las capas aniónicos (sulfato de dextrano).
entonces CaCO 3 se eliminó mediante tratamiento con sal de disodio
etilendiamino tetraacético (EDTA), y se prepararon cápsulas de polielectrolitos
( Figura 8 ). Un ligero aumento fue
Figura 8. Ilustración esquemática de la preparación de L-ASNasa I- fi cápsulas de
polielectrolitos LLED. (Reproducido con permiso del Karamitros et al., 2013. 86 )
observado en la estabilidad térmica después de la inmovilización. Por otro lado,
aunque la enzima libre casi pierde la totalidad de su actividad inicial, la enzima
inmovilizada pierde ~ 50% de su actividad durante el almacenamiento durante 3
meses a 4 ° C. La L-ASNasa de Erwinia carotovora fue conjugado con
PEG-quitosano y glicol-quitosano por Sukhoverkov y Kudryashova. 86 Su objetivo
era mejorar la terapéutica correo ff ect de L-ASNasa y evaluado algunos
parámetros. El pH óptimo de inmovilizado L-ASNasa se desplaza hacia valores
más ácidos debido a la naturaleza policatiónico del copolímero, y la
termoestabilidad de la enzima inmovilizada fue mayor que la de la forma libre. Por
otra parte, se observó que los conjugados de quitosano glicol demostraron los
mejores resultados que la presente PEG-asparaginasa.
Hay muchos materiales sintéticos candidatos biocompatible (en su mayoría
polímeros) como vehículos para la inmovilización de L-ASNasa. Sin embargo, no
tienen grupos químicos para interactuar con la enzima ' s sitio activo. Por lo tanto,
estos vehículos deben ser funcionalizados con un material que contiene un grupo
funcional para lograr la inmovilización de enzimas. generalmente se usaron
funcionalizados Los polímeros naturales que contienen grupo hidroxilo o amino,
tales como celulosa, quitina, quitosano, y almidón. Por la presente, una nueva
función química se introduce en el portador. En general, mientras que los polímeros
sintéticos se utilizaron como la matriz principal, estructuras naturales se prefieren
como refuerzo. Bahreiní et al. 87 producción reportada, Puri fi de cationes, y la
inmovilización de L-ASNasa por nanoencapsulación en quitosano-tripolifosfato (TPP)
nanopartículas producidas por el método de gelación ionotrópica. Se aumentó el
objetivo de este estudio in vitro mi FFI deficiencia de L-ASNasa-atrapado
nanopartículas de quitosano reticulado con TPP. Examinaron parámetros lización
immobi- de libre e inmovilizada L-ASNasa tales como el pH óptimo, la estabilidad
térmica, la liberación y in vitro medio tiempo. El pH óptimo para ambas formas era
entre 8,5 y 9,0. Sin embargo, enzima inmovilizada era más estable a pH alcalino y a
alta
La Figura 9. imagen esquemática de la preparación y el correo ff mecanismo ect de PMMA-Almidón-L-ASNasa. (Reproducido con permiso del Ulu et al., 2016. 88 )
1606
revisión
temperaturas. Además, in vitro un medio en tiempo de libre L-ASNasa fue de alrededor de
33 h cuando se almacena en PBS, mientras que inmoviliza L- ASNasa fue de alrededor de
6,4 días en condiciones de almacenamiento similares. Los resultados obtenidos revelaron
que la estabilidad y la actividad de la L- ASNasa se mejoraron considerablemente frente al
pH, estabilidad térmica, y estabilidad de almacenamiento en comparación con la de la
libre.
En la literatura, algunos materiales pueden utilizarse como portador para L-
ASNasa inmovilización siguiente funcionalización o zación derivati-. Recientemente,
nuevas técnicas han sido estudiados por L-ASNasa inmovilización. Por ejemplo, Ulu y
compañeros de trabajo 88 - 90
poli utilizado recientemente (metacrilato de metilo) (PMMA) -starch ( Figura 9 ), Poli
(metacrilato de 2-hidroxietilo) (pHEMA) - almidón, y poli (ácido metacrílico co- metacrilato
de metilo) (P (Maa- co- MMA) -starch ( Figura 10 ) Materiales compuestos para
inmovilizar L-ASNasa. En primer lugar, se prepararon dos polímeros y los
funcionalizados usando almidón. Los materiales compuestos preparados se
caracterizaron estructuralmente, térmicamente, y morfológicamente por diversas
técnicas. Luego, una solución de enzima se mezcló a continuación directamente con
vehículos funcionalizados para la inmovilización. Siguiendo el procedimiento de
inmovilización, la enzima inmovilizada exhibía tanto la estabilidad de pH y la
termoestabilidad con respecto a la enzima no inmovilizado. La enzima inmovilizada
tenía una menor K metro valor que la forma anterior. Además, los autores observaron que
la inmovilización de L-ASNasa usando esta técnica dio lugar a una excelente
estabilidad de almacenamiento y activar la reutilización de la enzima con respecto a la
enzima no inmovilizado.
■ OBSERVACIONES FINALES
Aquí, se revisa el uso de diversos materiales como matriz de soporte para la
inmovilización de L-ASNasa, señalando los resultados obtenidos en di ff técnicas Erent
inmovilización. Basándose en los resultados reportados, podemos interpretar ventajas
y los inconvenientes de la matriz de soporte anteriormente mencionado. Una matriz
de soporte ideal debe ser biocompatible, fácilmente accesible, barato, estable y
adecuado para la regeneración. 91 portadores naturales se pueden encontrar
ampliamente en fuentes renovables y son soportes biocompatibles, biodegradables, y
de bajo costo. Esta es la razón subyacente de los materiales más comúnmente
utilizados en los sistemas de inmovilización de enzimas. Con respecto a portadores
sintéticos, que son adecuados para la inmovilización debido a sus muchos grupos
funcionales. Su mayor ventaja es la posibilidad de regular su estructura a nivel
macromolecular. Además, forma, forma, porosidad, diámetro de poro, la polaridad y la
hidrofobicidad de los portadores pueden ser controlados durante la síntesis. Sin
embargo, los polímeros sintéticos están hechos a partir de recursos del petróleo no
renovables; esto ha sido criticado debido al problema de agotamiento de los
combustibles fósiles. 91 , 92 Por otro lado, los portadores inorgánicos tienen un alto
químicos, físicos, y la resistencia biológica. Sin embargo,
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Química bioconjugado
La Figura 10. Diagramas esquemáticos de preparación de P (MAA: 7- co- MMA: 3) copolímero (A), P (MAA: 7- co- MMA: 3) de material compuesto -starch y la inmovilización de L-ASNasa (B).
(Reproducido con permiso del Ulu et al., 2016. 90 )
estos portadores incluir la siguiente inconveniente: tienen su FFI ciente grupos
funcionales, lo que limita la unión de la enzima. 91 En comparación con otras matrices
de soporte, ya que nanotransportadores tienen áreas superficiales más grandes y alta
porosidad, pueden proporcionar carga relativamente alta de la enzima y facilitar la
accesibilidad de los sitios activos y el sustrato. Por lo tanto, la enzima muestra alta e
catalítica FFI ciencia. Por esa razón, pensamos que los portadores híbridos son más
que vale la pena, ya que la combinación de las propiedades de los portadores
naturales y sintéticos. Recientemente, la investigación en curso en el suministro
avanzado de formulaciones de fármacos basados ​en proteínas se centraron en micro
métodos / nanoencapsulación y diseños moleculares estímulos-sensibles o
inteligentes tales como liposomas, micelas, nanotubos de carbono, dendrímeros, y
nanopartículas magnéticas y pH, térmica, o hidrogeles de respuesta dual . Estas
nuevas técnicas y materiales inteligentes pueden beneficiarse fi t de LASNase
inmovilización. Por ejemplo, en un trabajo reciente, LASNase se inmovilizó sobre
perlas de Ca-alginato a través de microencapsulación por Bahraman y Alemzadeh. 93 Además,0037.
esperamos que nanoencapsulación de L-ASNasa en nanoportadores puede ser
enfoque muy prometedor para futuras aplicaciones. Por otra parte, los glóbulos rojos
(RBC) -encapsulated L-ASNasa se ha utilizado como una técnica en biorreactores.
arti fi materiales biomimic ciales se han hecho en los últimos años para sustituir a
biomoléculas naturales. Destacamos que estos materiales serán muy importantes en
aplicaciones de L-ASNasa mediante el uso de micro / nanoencapsulación. Estas
ideas innovadoras y similares pueden avanzar aún más el uso de L-ASNasa.
■
CONCLUSIONES
Las enzimas inmovilizadas se han utilizado cada vez más en una variedad de fi campos
como la medicina, la industria y los alimentos. L-ASNasa es uno de los agentes más
importantes que se utilizan como una droga - conjugado de enzima en el tratamiento del
cáncer. Por lo tanto, los estudios para aumentar la vida media y la estabilidad de esta
enzima son importantes como portadores y métodos de inmovilización innovador debe ser
desarrollado para lograr este fenómeno. En este punto, se requiere que toda la
información y la experiencia del pasado al presente. Eso es el
1607
revisión
objetivo final de esta revisión. En conclusión, hemos tratado de enumerar y explicar
casi todos los portadores de L-ASNasa. Esta opinión señaló portadores prometedores
para la inmovilización de L-ASNasa. De esta manera, esta revisión también describe
cómo producir una mejora en la actividad enzimática, la estabilidad, y la reutilización.
Tal vez, la investigación futura puede contribuir al desarrollo de formulaciones más
adecuados que las presentes formulaciones L-ASNasa. Anticipamos que más
novedosos soportes y aplicaciones serán reportados en un futuro próximo, incluyendo
medicinas, alimentos, y biosensores.
■
INFORMACIÓN DEL AUTOR
Autor correspondiente
* Email: burhan.ates@inonu.edu.tr . Teléfono: 90-422 377 3888. Fax: 90-422 341
ORCID
Burhan Ates: 0000-0001-6080-229X
notas
Los autores declaran no competir fi interés financiero.
■ EXPRESIONES DE GRATITUD
El autor desea agradecer a Ino ̈ nu ̈ Universidad.
■ ABREVIATURAS
L-ASNasa, L- asparaginasa; ALL, leucemia linfoblástica aguda;
E. coli, Escherichia coli; PEG, polietilenglicol; FDA, Administración de
Alimentos y Drogas; PEG-L-ASNasa, polietileno glicol
L- asparaginasa; RBC, las células rojas de la sangre; PBPM, protamina de bajo peso
molecular; SF, seda fi Broin; PBS, fosfato-bu ff Ered solución salina; BSA, albúmina de
suero bovino; P (VP- co- MA), poli ( NORTE-
vinylpyrrolidone- co- anhídrido maleico); CLAVIJA- sol- P (VMP), poli- glicol de
etileno injertado vinilpirrolidona - anhídrido maleico; TEM, microscopía electrónica
de transmisión; PLGA, poli (lactida-
co- glicolida); PHBV, poli (3-hidroxibutirato- co- eRate 3-hydroxyval-); SFN, seda fi nanopartícula
Broin; FTIR, transformada de Fourier espectroscopia infrarroja; SEM, microscopía
electrónica de barrido; SDS-PAGE, dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida electro-
gel
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foresis; Difracción de rayos X, rayos X di ff raction; PANI, nano polianilina fi ber;
XPS, la espectroscopia de fotoelectrones de rayos X; TPP, phate tripolyphos-;
PVDMA, poli (2-vinil-4,4-dimetilazlactona); TGA, análisis termogravimétrico;
EDTA, ácido etilendiamina-tetraacético; PMMA, poli (metacrilato de metilo);
pHEMA, poli (metacrilato de 2- hidroxietilo); (P (Maa- co- MMA), poli- (ácido
metacrílico co- metacrilato de metilo); GMA, metacrilato de glicidilo; EDMA,
dimetacrilato de etileno; DPPC, mitoylphosphatidylcholine dipal-
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