UNIVERSIDAD DE CIENCIAS Y ARTES DE CHIAPAS

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

9º U

MICROBIOLOGÌA AVANZADA

LIC. ALEJANDRA VICENTE SERRANO

PRÁCTICA 2 Y 3 “CARACTERIZACIÒN BIOQUÍMICA DE

MICROORGANISMOS I Y II”

INTEGRANTES

CRUZ ALEGRÍA INGRID YAZMÍN

LÓPEZ VILLAFUERTE CITLALLI BERENICE

TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS A 20 DE FEBRERO DE 2019.

INTRODUCCIÒN

La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando

diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación
de similitudes (Martínez-Silva, 1989).
Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas
bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía
metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se
incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.
Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque
proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un
grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un
valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son
totalmente automatizables (Martínez-Silva, 1989).
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han
desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica
bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática,
grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada
temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de
ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano (MacFaddin-
Jean, 2003).
Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de
cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo
ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con
factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de
distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente.
A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas
(manuales de identificación, comerciales, etc.) (MacFaddin-Jean, 2003).
Gracias al cultivo microbiológico se obtiene información adicional que es muy
valiosa para aislar e identificar a los microorganismos (Pírez y Mota (2005).
Es posible hacer una identificación preliminar de muchas bacterias importantes,
basándose en unas pocas y sencillas características macroscópicas de las células
apreciables en su disposición en forma de colonias sobre los medios de cultivos
en que crecen y se aíslan.
Después de un examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar,
se deben apreciar las principales características de las colonias: tamaño (en
general, las bacterias Gram-positivas producen colonias algo más pequeñas que
las Gram-negativas), forma, grado de elevación, borde, color, superficie, densidad,
consistencia y olor (Pírez y Mota (2005).
La morfología bacteriana debe ser observada con el microscopio óptico o el
microscopio electrónico, dado el tamaño pequeño de estos microorganismos
(Pírez y Mota (2005).

OBJETIVOS
Caracterizar aspectos de algunos microorganismos como su morfología
macroscópica, microscópica, así como rasgos bioquímicos que coadyuvan en su
identificación.

MÈTODO

La práctica se dividió en tres sesiones, las cuales consistieron en la siguiente

metodología.

1RA. SESIÓN

Se prepararon los siguientes medios y posteriormente se colocaron 4 ml en tubos

de 13x100 mm y 25 ml de cada medio en placas Petri.

Placas: Tubos:
 Agar de hierro y triple Azúcar (TSI)
 Agar de sal y manitol
 Agar de hierro y lisina (LIA)
 Agar EMB
 Medio de movilidad, indol y ornitina
 Agar de MacConkey
(MIO)
 Agar nutritivo
 Agar Citrato de Simmons
 Agar de papa y dextrosa (PDA)
 Medio de oxidación fermentación OF
Luego de la esterilización y gelificación adecuada de los medios, se incubaron a
37ºC por 24 horas.

2DA. SESIÓN.

Luego de observar que los medios estuvieran libres de contaminación, se llevo a

cabo la inoculación de las cepas: Bacillus subtilis (CGEN002) y Escherichia coli
(CGEN014) siguiendo las siguientes condiciones:

Cuadro 1. Módulo de inoculación de los tubos con medios para estudiar

reacciones bioquímicas

Tipo de
MEDIO DE CULTIVO
inoculación
Citrato de
TSI LIA MIO Medio OF
Simmons
Estría x x
Picadura x x
Picadura +
x
Estría

Para el caso de las placas Petri, se resembro mediante la técnica de estría

cruzada y se incubó a 37ºC durante 24 horas.

3ERA SESIÓN

Se llevó a cabo la lectura de las pruebas bioquímicas de las cepas estudiadas y se

realizó una descripción de cada medio observado (placas Petri), además de las
tinciones de Gram y esporas.
TINCIÓN DE GRAM

Para este tipo de tinción se usaron las cepas B. subtilis (CGEN002), E. coli
(CGEN014) y Staphylococcus epidermidis (CGEN004).

1. En un portaobjetos se hizo un frotis de cada una de las cepas y se dejo

secar sin calentar.
2. Se pasó el portaobjetos por una llama varias veces, con el fin de matar las
bacterias y fijarlas a este.
3. Se cubrió el portaobjetos con solución de cristal violeta durante 1 minuto.
4. Se inclinó el portaobjetos para decantar el colorante y cubrir el cristal violeta
con lugol, el cual se dejó reposar durante 1 minuto.
5. Se inclinó el portaobjetos para decantar el lugol y se lavó con alcohol
acetona durante 1 minuto.
6. Se cubrió con safranina durante 1 minuto, se lavó con agua destilada y se
dejó secar.
7. Por último se colocó una gota de aceite de inmersión y se observó en un
microscopio óptico utilizando el objetivo 100x.

TINCIÓN DE ESPORAS

1. Para la tinción de esporas se realizó un frotis de la cepa B. subtilis

(CGEN002) en un portaobjetos y se dejó secar.
2. Se cubrió con verde malaquita durante 1 minuto y se coloco una tira de
papel filtro.
3. Con ayuda de unas pinzas para tubos se tomó el portaobjetos, se colocó en
la llama de un mechero durante 5 minutos evitando que se evaporara
completamente y se lavó con agua destilada.
4. Se cubrió con safranina durante 1 minuto y se lavó con agua destilada para
posteriormente dejarse secar.
5. Por último se colocó una gota de aceite de inmersión y se observó en un
microscopio óptico utilizando el objetivo 100x.
RESULTADOS

Cuadro 2. Interpretación del comportamiento bioquímico en agar de hierro y

triple azúcar (TSI).

Bacillus subtilis CGEN002 Escherichia coli CGEN014

(Fig.1) (Fig. 1)
Superficie Fondo Superficie Fondo
Fermentación
Ácido-A- Ácido-A-
de glucosa y
(amarillo) (amarillo)
lactosa
Producción
Con burbujas Con burbujas
de gas
Producción
Precipitado negro Precipitado negro
de H2S

a b

Figura 1. B. subtilis (a) y E. coli (b) en agar de hierro y triple azúcar (TSI) en donde
se observa la superficie amarilla que representa la fermentación de glucosa y
lactosa; las burbujas debido a la producción de gas y el precipitado negro en el
fondo debido a la producción de H2S.
Cuadro 3. Interpretación del comportamiento bioquímico en agar de hierro y lisina
(LIA).

Bacillus subtilis CGEN002 Escherichia coli CGEN014

(Fig.2) (Fig. 2)
Superficie Fondo Superficie Fondo
Utilización de Alcalino-K- Alcalino-K- Alcalino-K-
lisina (morado) (morado) (morado)
No utilización Àcido-A-
de lisina (amarillo)

a b
Figura 2. B. subtilis (a) y E. coli (b) en agar de hierro y lisina (LIA). En ambos tubos se
observa la superficie morada que representa la utilización de lisina, al igual que el fondo
del tubo donde se inoculó B. subtilis; por el contrario, en el fondo del tubo donde se inoculó
E. coli, se observa de color amarillo, lo cual representa que no utiliza lisina.
Cuadro 4. Interpretación del comportamiento bioquímico en el medio de
movilidad, indol y ornitina (MIO).

Bacillus subtilis CGEN002 Escherichia coli CGEN014

(Fig.3) (Fig. 3)
Prueba Prueba Prueba Prueba
negativa positiva negativa positiva
Sin turbidez
Con turbidez
alrededor del
Movilidad en todo el
sitio de
medio
la picadura
Indol Anillo rojo Anillo rojo
Fondo Fondo
Descarboxilación amarillo amarillo
de la ornitina (reacción (reacción
ácida) ácida)

a b
Figura 3. B. subtilis (a) y E. coli (b) en el medio de movilidad, indol y ornitina (MIO).En
ambos tubos se formó un anillo de color rojo en la superficie y en el fondo se observo una
coloración amarilla, la cual indica una reacción ácida respecto a la descarboxilación de la
ornitina, la única característica distinta fue la de movilidad, ya que en el tubo de B. sutilis no
se observó turbidez alrededor de la picadura, mientras que en el tubo de E. coli se presentò
turbidez en todo el medio.

y el fondo
Cuadro 5. Prueba para la utilización de citrato.

Bacillus subtilis CGEN002 Escherichia coli CGEN014

(Fig.4) (Fig. 4)
Prueba Prueba Prueba Prueba
positiva negativa positiva negativa
Utilización de Azul de Prusia
Azul de Prusia
citrato

a b
Figura 4. B. subtilis (a) y E. coli (b) en agar de Citrato de Simmons, en donde ambos
fueron positivos ya que presentaron azul de Prusia.

a b

Figura 5. B. subtilis (a) y E. coli (b) en medio OF, en donde se observo que en ambos
tubos hubo turbidez alrededor de la picadura.
MEDIOS DE CULTIVO

B. subtilis CGEN002

Figura 6. Agar nutritivo; morfología Figura 7. Agar de sal y manitol;

colonial: colonias blancas, opacas, de morfología colonial: colonias blancas,
forma puntiforme y circular; elevación opacas, de forma puntiforme y circular;
umbonada y margen ondulado. elevación convexa y margen ondulado.
Se observó un cambio de color naranja a
amarillo.

No se presentó crecimiento en agar MacConkey, EMB y papa y dextrosa (PDA).

E. coli CGEN014

Figura 8. Agar nutritivo; morfología Figura 9. Agar MacConkey; morfología

colonial: colonias blancas, opacas, de colonial: colonias rosadas, de forma

forma puntiforme- circular; elevación chata puntiforme-circular, elevación elevada y

y margen entero-ondulado. margen entero-ondulado.

Figura 10. Agar EMB; morfología colonial: Figura 11. Agar de sal y manitol;

colonias de verdes, de forma puntiforme- morfología colonial: colonias blancas,

circular; elevación elevada y margen opacas; de forma puntiforme- circular;

entero-ondulado. elevación chata y margen entero.

 Figura 12. Agar Papa y Dextrosa (PDA); morfología colonial:
colonias de blancas, opacas, de forma puntiforme; elevación
chata y margen entero.

TINCIÒN DE GRAM

Figura 13. Bacilos Grampositivos. Figura 14. Bacilos Gramnegativos.

Tinción realizada en B. subtilis. Tinción realizada en E. coli.

Figura 15. Cocos Grampositivos.

Tinción realizada en S. epidermidis.
TINCIÒN DE ESPORAS

Figura 16. Tinción realizada en B. subtilis, en donde se observan las

esporas teñidas de color verde.

DISCUSIÓN

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

En nuestros resultados obtenidos sobre los tubos, Para la prueba de interpretación

del comportamiento bioquímico en agar de hierro y triple azúcar (TSI), es la que
determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono
especifico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de
gases, junto con la determinación posible de ácido sulfhídrico (Hall, 2013).

La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones aeróbicas (pico

de flauta). Este medio contiene limitante de glucosa y concentración 10 veces
mayor de lactosa. Forman ácidos (Dickinson, 2007).

Con los resultados obtenidos se observa que para el agar (TSI) tuvimos un medio
ácido, esto debido a la fermentación de hidratos de carbonos y la producción de
gas, según menciona Mac-Faddin (1993) la fermentación se da de manera
aeróbicamente en el pico de flauta y anaerobiamente en la capa inferior del cultivo
esto debido a que algunos organismos tienen la capacidad de fermentar tanto la
lactosa como la glucosa como el caso de la E. coli y B. subtilis.
El medio agar hierro y lisina (LIA) este mide la capacidad enzimática para
descarboxilar un aminoácido y finalmente formar una amiga y por consiguiente
alcalinidad, los resultados obtenidos B. subtilis posee una superficie alcalina-K-
(morado) y fondo alcalino-K-(morado), lo que según (Bailón et al., 2003) menciona
que tuvo una decarboxilación de lisina, teniendo una prueba positiva de pico
violeta y fondo violeta. Mientras que para E. coli posee una superficie alcalina-K-
(morado) con un fondo acido-A-(amarillo), esto es debido a que los
microorganismos que no producen lisina descarboxilasa y son fermentadores de
glucosa, producen un viraje de totalidad en el medio de cultivo al amarillo, pero a
las 24 hrs de incubación se observa un pico de color violeta al consumo de
peptonas y con un fondo amarillo, por lo tanto esta es una prueba negativa para la
decarboxilación de lisina (Becton, 2007).

El medio de movilidad, indol y ornitina (MIO), este funciona para la observación de

la movilidad, la producción de indol y descarboxilación de la ornitina (Bailón et al.,
2003).

En nuestros resultados obtuvimos que para la movilidad B. subtilis no presentó

turbidez al rededor del sitio de la picadura mientras que E. coli, hubo una turbidez
en el medio por lo que estas bacterias presentan movilidad para bacilos
fermentadores, esto puede ser debido por medio de sus flagelos, que se
encuentran principalmente entre los bacilos (Mac-Faddin, 1993). Además, de que
B. subtilis y E. coli tuvieron producción de Indol, y este determina si la bacteria
posee una enzima (triptofanasa) (Dickinson, 2007). Y para el caso de la
descarboxilación de la ornitina, ambas tuvieron un fondo amarillo, el cual es una
reacción ácida, lo cual da un resultado negativo y que a veces se puede
desarrollar un color vialáceo en la superficie.

Para la prueba de la utilización de citrato, esta prueba determina la capacidad de

un microorganismo de utilizar el citrato de sodio como única fuente de carbono
para el metabolismo y crecimiento.
El metabolismo del citrato se realiza en aquellas bacterias poseedoras de citrato
permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico, para B. subtilis tuvo una
respuesta positiva para Azul de Prusia teniendo crecimiento bacteriano con un
intenso color azul en el pico de flauta, mientras que E. coli tuvo una respuesta
negativa teniendo ausencia de crecimiento y permanencia del color verde del
medio de cultivo (Dickinson, B 2015).

MEDIOS DE CULTIVO

Para el caso de los medios, conforme a las características de los medios de cultivo
para Bacillus subtilis (CGEN002) pueden presentar colonias de 2 - 4 mm de
diámetro, pueden poseer un aspecto liso, mucoide y rugoso, con bordes
ondulados o extendidos en el medio (Realpe et al., 2002).

Son bacilos Gram positivos, con borde redondeado, pueden presentar esporas
esféricas y centrales (Realpe et al., 2002).

Los medios generales mantienen el crecimiento de muchos microorganismos son

el caldo y agar nutritivo, ya que son nutricionalmente poco exigentes (Rodríguez-
Cavallini et al., 2006).

Hubo colonización también en el medio Agar Sal y Manitol, este medio de cultivo
es selectivo (Forbes, 2007). Las bacterias crecen en un medio con alta
concentración de sal y fermentar el manitol, producen ácidos, con lo que se
modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo (Murray
et al., 1999).

Como mencionamos anteriormente, B. subtilis es Gram positivo, por lo tanto, no

puede crecer en agar EMB, ya que este medio combina fórmulas de Holt-Harris y
Teague con la de Levine, para obtener un buen rendimiento en el aislamiento
selectivo de enterobacterias y especies de bacilos Gram negativos y, por ende,
estos ejercen un efecto inhibitorio sobre una amplia variedad de bacterias Gram
positivas (Laboratorios Britania, 2015).
En el caso del medio Agar MacConkey, puede favorecer el crecimiento de
microorganismos particulares; se emplean para detectar enterobacterias. Ya que
contienen colorantes y sales biliares que inhiben el crecimiento de las bacterias
Gram positivas (Laboratorios Britania, 2015). Por lo tanto, B. subtilis, no puede
crecer en este medio, ya que es Gram positiva e inhibiría su crecimiento
bacteriano.

Y finalmente con el medio agar papa y dextrosa (PDA) no hubo crecimiento,

debido a que es utilizado para el aislamiento, crecimiento y almacenamiento de
hongos (Gilchrist-Saavedra et al., 2005).

Para el caso de Escherichia coli (CGEN014), las colonias de esta bacteria varían
según el medio de cultivo donde crezcan.

En el medio de cultivo Agar Eosina Azul de Metileno abreviado (EMB), podemos

observar en la imagen que las colonias tienen en demasía una coloración verde-
metálico, lo cual es característico de E. coli, aunque hay otras bacterias que logran
producir este color es muy tenue y escaso. Según Laboratorios Britania (2015)
menciona que los microorganismos fermentadores de lactosa y/o sacarosa,
poseen colonias con brillo metálico. Además, como ya mencionado anteriormente,
los medios EMB, MacConkey se emplean para enterobacterias – Gram negativos.

El agar MacConkey es tanto selectivo como diferencial, como contiene lactosa y

colorante rojo neutro, las colonias fermentadoras de lactosa (Escherichia coli)
aparecen de color rosa o rojo y se distinguen fácilmente de las colonias no
fermentadoras. Ya que según Laboratorios Britania (2015) menciona que hay
microorganismos no fermentadores de lactosa y sacarosa con un aspecto incoloro,
con colonias del medio.

También hubo colonización también en el medio Agar Sal y Manitol, como ya

mencionamos antes, este medio de cultivo es selectivo (Forbes, 2007). Las
bacterias crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentar el manitol,
producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH
del color rojo al amarillo (Murray et al., 1999).
Para el caso del medio papa y dextrosa (PDA), hubo crecimiento, pero muy poco,
debido al medio, ya que es considerado uno de los más importantes por su uso
frecuente, es utilizado para el aislamiento, crecimiento y almacenamiento de
hongos, para numerosas especies (Gilchrist-Saavedra et al., 2005). Es un medio
muy usado que sirve para aislar todo tipo de hongos como: Beauveia,
Paecilomyces, Lecanicillium (Verticillium) y Metarhizium, los más importantes
hongos parásitos de insectos, al igual que los parásitos de plantas y hongos
saprofitos crecen muy bien y esporulan en este medio (Cañedo & Ames, 2004). Es
un medio de cultivo para hongos y levaduras a partir de muestras de alimentos,
derivados de leche y productos cosméticos.

TINCIÓN DE GRAM

En los resultados de la tinción de Gram se observan estructuras morfológicas tales

como la forma: cocos, bacilos y cómo se distribuyen:

Bacillus subtilis: en forma de bacilos, siendo Gram positiva.

Escherichia coli: en forma de bacilos, siendo Gram negativa.

Staphylococcus epidermidis: aglomeradas en racimos estafilococos, siendo Gram

positiva.

La tinción Gram positiva, es una coloración que tiñe la pared celular de las
bacterias de color azul, como es el caso de B. subtilis y S. epidermidis, ya que el
cristal violeta se impregna de primer momento. Según (Rodríguez-Cavallini y
Coronado, 2016) la estructura y grosor de la pared bacteriana, agrupan las
bacterias en Gram positivas y en Gram negativas.

Las Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglucano y carecen de

membranas externa mientras que las Gram negativas como E. coli tienen una
capa más delgada de peptidoglucano y poseen una membrana externa (Seija,
2014).

La tinción Gram negativa refleja un color rosa, pues es teñida por safranina.
Cada una de ellas realiza una función para teñir la pared celular, de acuerdo a
(Rodriguez-Cavallini y Coronado, 2016) en tinción inicial, las células se tiñen con
cristal violeta, el cual es el colorante primario pues tiñe a todas las células de
morado. El mordente, se agrega yodo lugol que forma un complejo cristal violeta-
Yoduro para impregnar bien la tinción morada, la decoloración lava el cristal
violeta de las Gram negativas dejándolas incoloras. La contratinción, es cuando se
agrega safranina o Fucsina y tiñe a las Gram negativas de rojo o rosado.

TINCIÓN DE ESPORAS

Respecto a la tinción de esporas, B. subtilis fue a la única a la que se le aplicó.

Las esporas son producidas por Bacillus, Clostridium (Montoya-Villafañe, 2008),
Sporosarcina, Sporolactobacillus y Desulfotomaculu, que son géneros Gram
positivas, aunque actualmente se han descrito en algunas Gram negativas
(Rodríguez-Cavallini et al., 2006).

Las endosporas son formas de resistencia, altamente deshidratadas, con una

serie de cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean difíciles de teñir,
excepto si se calienta la preparación para permeabilizarlas. Las endosporas
bacterianas son muy resistentes a los procedimientos tintoriales usuales, la
aplicación de un solo colorante a una célula bacteriana que contiene una
endospora solo tiñe la célula, y la espora se mantiene incolora, por eso para
introducir el colorante dentro de la espora es necesario aplicar calor (Rodríguez-
Cavallini et al., 2006).

CONCLUSIÒN

 Para poder observar la caracterización de cada bacteria existe una gran

variedad de medios de cultivos, existen medios selectivos para bacterias
específicas.
 Por medio de las características físicas, químicas, morfológicas se puede
identificar colonias de bacterias desconocidas, para poder caracterizarla e
identificarla.
  La tinción de Gram, nos ayuda a diferenciar a las bacterias por medio de la
coloración, rosa para bacterias negativas y morado para bacterias positivas.
 La tinción de esporas normalmente se da en bacterias Gran positivas
(Bacilos), y se tiñen con el colorante verde malaquita para su observación.

CUESTIONARIO

1. Explique el fundamento de la técnica de Gram:

De acuerdo a Rodríguez-Cavallini et al., (2016) existen variaciones de esta

técnica, pero en términos generales, la tinción de Gram involucra varios pasos, en
este caso son 4: Tinción inicial que es cuando se aplica cristal violeta, el cual es el
colorante primario, la segunda parte es la etapa de mordente que es en donde se
aplica Yodo Lugol que reacciona con cristal violeta y forma un complejo cristal
violeta-yoduro, aun teñidas en azul. Los colorantes Mordentado, no poseen el
poder de entintar, solo con un tratamiento especial reaccionarán.

Según Rodríguez-Cavallini & Coronado (2016) el tercer paso es la decoloración,

se adiciona un solvente no polar, el cual actúa lavando el complejo cristal violeta-
yoduro de las células Gram negativas, de esta manera las Gram positivas
continúan siendo moradas y las negativas rosadas.

Este es el paso critico de esta tinción, pues si se exagera decolora las Gram
positivas. Por último, se vuelve a teñir con Safranina o también llamado fucsina, de
manera que las bacterias Gram negativas, que estaban incoloras, se tiñan de
rosado y las Gram positivas no afecta con la contratinción.

2. ¿Cuál es la utilidad de las pruebas para detectar actividad amilolítica y

proteolítica en Bacillus spp?

La utilidad de la prueba en el género de Bacillus es que sus potenciales para la

industria en la actualidad pueden ser aprovechadas mediante sus enzimas ya que
es usada en muchos procesos biotecnológicos. La producción de jarabes
glucosados y/o fructosados se basa en la degradación de almidón y ha sido
empleado industrialmente desde la década del 70. Desde entonces, se han venido
desarrollando procesos enzimáticos que permiten transforma el almidón en los
llamados jarabes con alto contenido de glucosa y/o fructosa, dando origen a
nuevos productos con mayor poder edulcorante y menor costo en relación con el
azúcar de caña (Sánchez, et al., 2005).

En el mundo actualmente se buscan enzimas alfa- amilasa y en la segunda una

amiloglucosidasa con características diferentes a las ya comercializadas.

3. ¿Cuál es el fundamento para la detección del metabolismo oxidativo y

fermentativo en el medio OF?

Las bacterias utilizan diversas vías metabólicas para producir moléculas

bioquímicas complejas (unidades estructurales) y energía. Para la mayoría de las
bacterias de importancia clínica esto implica la utilización de sustratos, como
hidratos de carbono (azúcar y derivados del azúcar) y proteínas.

Para la identificación de diversas bacterias es importante determinar si la

utilización del sustrato es un proceso oxidativo o fermentativo. El proceso oxidativo
requiere oxigeno; el fermentativo no. El laboratorio clínico determina la forma en
que un microrganismo utiliza un sustrato mediante la observación de los
subproductos ácidos que producen en presencia del oxígeno o en su ausencia
(Forbes et al., 2009).

En la mayoría de los casos la presencia de subproductos ácidos se detecta por un

cambio en el indicador de PH incorporado al medio. Los cambios de color que
aparecen en presencia de ácido dependen del tipo de indicador de PH utilizado.
Los determinantes de oxidación-fermentación por lo común se logran con un
medio especial, medio para la oxidación- fermentación (OF) que contiene
concentraciones bajas de peptona y un sustrato con un único hidrato de carbono,
como glucosa.

El microrganismo que se desea identifica se siembra en dos tubos OF con glucosa

uno de los cuales se cubre luego con aceite mineral para impedir el ingreso del
oxígeno. Los indicadores de PH comunes utilizados para las pruebas de OF y los
cambios de color que sufren en condiciones acidas son purpura de bromocresol
(que cambien de violeta al amarillo), el indicador fucsina acida de Andrade (que
cambia del amarillo pálido al rosa) el rojo fenol (del rojo al amarillo) y el azul de
bromotimol (de verde a amarillo) (Forbes et al., 2009).

Cuando se determina la producción de ácidos en ambos tubos el microrganismo

se identifica como fermentador de glucosa, si solo se detecta en el tubo en
aerobiosis se considera que el microorganismo oxida la glucosa. Si no se observa
presencia de ácido, se determina que son no utilizadores de glucosa (Forbes et
al., 2009).

4. Mencione como se clasifican los microorganismos con base en su

requerimiento de oxígeno.

Las condiciones atmosféricas para un microorganismo están dadas por el

potencial de oxidorreducción. Lo que se conoce como respiración bacteriana
consiste en reacciones de óxido- reducción, que son reacciones en cadena en las
que varía el aceptor final de electrones o de hidrógeno. Si se considera este factor,
los microorganismos pueden ser clasificados así:

Aerobios, que son microorganismos que requieren oxígeno, porque este es el

aceptor final de hidrógeno con el que forman agua y CO2. Estos microorganismos
se diferencian por producir una enzima catalasa que desdoble el peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno naciente. La prueba de la catalasa se utiliza en el
laboratorio para diferenciar a estos microorganismos de los otros (Negroni, 2009)

Anaerobios, organismo que viven en ausencia de oxígeno atmosférico. En este

caso el aceptor final de hidrógeno es un compuesto inorgánico que puede
reducirse, como los nitratos y los sulfatos.

Un tipo particular es la fermentación en la que la fuente de carbono que provee

energía, el donador de hidrógeno y el aceptor final de éste. Microaerófilos son
aquellos que requieren bajas concentraciones de oxígeno para crecer. Estos al
igual que los aerobios, utilizan el oxígeno como fuente de energía, pero no toleran
la concentración de oxígeno aire atmosférico, sino que requieren niveles que no
superen el 15% de este gas (Negroni, 2009)

5. Investigue que métodos automatizados existen para identificar

microorganismos con base en su comportamiento bioquímico.

1) Espectrometría de masas MALDI-TOF, medios cromogénicos: es una

herramienta de trabajo rutinaria en Microbiología Clínica, por su rapidez y fiabilidad
en la identificación de microorganismos. Sus resultados están perfectamente
contrastados en la identificación de bacterias y levaduras. La identificación de
micobacterias y hongos filamentosos presenta mayor complejidad, por la mayor
heterogeneidad de espectros dentro de cada especie. Los medios de cultivos
cromogénicos han supuesto también una aportación al diagnóstico rápido tanto en
bacterias como en levaduras, ya que aceleran el diagnóstico, facilitan la detección
de cultivos mixtos y permiten un diagnóstico rápido de especies resistentes (Siller-
Ruiz, et al., 2017).

2) Detección de Microorganismo mediante métodos moleculares: dentro de las

ventajas de las técnicas moleculares de detección se encuentran la especificidad,
pueden detectar solo la molécula o identificar el organismo de interés;
Sensibilidad, son capaces de detectar la presencia de un solo microorganismo;
Rapidez, se puede identificar un microorganismo en menos de 24 horas y el último
punto es que pueden ser automatizadas pues permiten tener un diagnostico en
menor tiempo y reducir los costos. Existen distintos tipos de técnicas como las
técnicas basadas en hibridación de ADN y Técnicas basadas en PCR, así como
PCR en tiempo real, Microarreglos o microchips y Secuenciación (Rodríguez-
Herrera et al., 2009)

REFERENCIAS DOCUMENTALES
 Bailón, L., Cruz, R., Cervantes, A. (2003). Atlas de Pruebas Bioquímicas
para Identificar Bacterias’, Universidad Nacional Autónoma de México.
 Becton. D. (2003). ‘BD Triple Sugar Iron Agar (TSI Agar)’, Instrucciones De
Uso - Medios En Placa Listos Para Usar, p. 4. doi: PA-254458.02.
 Cañedo, V., Ames, T. (2004). Manual de Laboratorio para el Manejo de
Hongos. Lima, Perú: Centro Internacional de la Papa.
 Dickinson, B. (2007) ‘BBL Motility Indole Ornithine (MIO) Medium. Bd, 8, p.
4
 Dickinson, B. (2015) ‘BBL Simmons Citrate Agar Slants’, p. 3.
https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=22360.
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