PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS DE USO FARMACÉUTICO

ESTUDIO PARCIAL #1

Grupo amino otorga propiedad estereoquímica ¿?

Los residuos aminoácidos de las proteínas son exclusivamente L-estereoisómeros.
Sólo se han encontrado D-aminoácidos en unos pocos péptidos, generalmente pequeños, que
incluyen algunos péptidos presentes en las paredes bacterianas celulares, así como algunos
antibióticos peptídicos.
Los D-aminoácidos y sus polímeros peptídicos pueden aumentar el tiempo de vida media t1/2 por lo
que los productos D-derivados son menos susceptibles a la degradación.

PÉPTIDO ≤ 100 A.A’s.

PROTEÍNA ≥ 1000 A.A’s.

Aminoácidos esenciales: Son aquellos que el ser humano no puede sintetizar por su cuenta.

Poliaminoácido: Es el mismo aminoácido en secuencia peptídica.

PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS SINTÉTICAS

Ventajas:
 Alta especificidad y actividad
 Baja
o Unión a moléculas distintas del objetivo
o Acumulación en tejidos
o Dosis
o Toxicidad y efectos secundarios
 Diversidad biológica y química

Desventajas:
 Corta vida media
 Costo.
 Desafío para el paso a través de las membranas
 Relaciones estructura-función complejas
 Vulnerables a las enzimas digestivas (No por V.O.)

Actividad biológica:
 Antibacteriales y antifúngicos
 Antivirales
 Cáncer
 Cosméticos
 Desórdenes del sistema inmune
 Desórdenes neuronales
 Enfermedad cardiovascular
 Métodos diagnósticos
 Vacunas
Cicatricure®: Mezcla de péptidos  No caracterizada Vacunas: Memoria inmunológica. Agente profiláctico.
Argirelina®: Cosmético antiarrugas. Fragmento de la Toxina botulínica. Acetil hexapéptido-8 Zwitterion: Especie presente en el medio neutro

Un aminoácido se caracteriza por la presencia de cuatro sustituyentes, a Imidazol en el Aminoácido Histidina His H cargado positivamente puede ser útil para reacciones de
saber: tipo electrostático en antimicrobianos.
 Un grupo amino básico Grupo tiol de la cisteína es importante para la formación de enlaces disulfuro, configurando así a la
 Un grupo carboxilo ácido Cistina, por la unión de dos cisteínas. Existe el problema de la formación de especies de “loop”
 Una cadena Lateral variable según cada aminoácido (Cadena lateral entre los tioles de una cadena peptídica, por lo que se busca la formación de cadenas lineales de
R) cisteínas.
 Un átomo de hidrógeno De todos los aminoácidos, según la dieta podemos decir que:
 De los aminoácidos apolares alifáticos; sólo la Glicina, Alanina y Prolina son sintetizados
Se conocen una serie de 20 Aminoácidos naturales, todos ellos en su por el cuerpo humano. Los restantes son esenciales en la dieta.
forma enantiomérica L.  De los aminoácidos polares no cargados, todos son sintetizados por el cuerpo humano,
excepto la Treonina.
  De los aminoácidos apolares aromáticos; tan sólo la Tirosina es sintetizada por el cuerpo PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS Y SU APLICACIÓN EN LAS CIENCIAS FARMACÉUTICAS
humano. Por el contrario, la Fenilalanina y el Triptófano son esenciales.
 De los aminoácidos polares ácidos, tanto el Aspartato como el glutamato son sintetizados Síntesis de péptidos – Historia
por el cuerpo humano.
 De los aminoácidos polares básicos, sólo la arginina es sintetizada (en la mayoría de las 1902: Fisher: Dipéptidos
ocasiones) por el cuerpo humano. Tanto la lisina como la histidina son esenciales. 1932: Bergmann y Zervas: Grupos protectores (Carbobenzóxilo)
1953: Du Vigneaud: Oxitocina (Nobel 1956)
PÉPTIDO: De 2 a 100 Aminoácidos. Moléculas de naturaleza proteínica formadas por la unión 1959: Merrifield: SÍNTESIS DE PÉPTIDOS EN FASE SÓLIDA (Nobel 1984) T-BOC
covalente de por lo menos 2 aminoácidos a través de enlaces peptídicos. Son responsables de 1971: Sheppard: Síntesis F-MOC poliamida
muchas funciones biológicas. 1985: Houghten: SPPS Síntesis simultánea de péptidos
1998: Patarroyo: Vacuna anti Plasmodium Spf-66
CATEGORÍAS 2000: Roche: Fuzeón. Enfuvirtide.
Oligopéptido 2-10 A.A’s Péptidos:
Polipéptido 10-100 A.A’s Peso molecular ≤10 kDa
Proteína >100 A.A’s N-GG-COOH: Glicil-glicina (Fischer) Sólo se logró sintetizar Homopolímeros
Protección del α-amino
Argirelina®: Ac-EEMQRR-NH2 Oxitocina: N-GLPCNGIYC Oligopéptido: Hormona hipofisiaria. 9 A.A’s
Merrifield sintetizó Ribonucleasa pancreática, proteína de 124 A.A’s por medio de la estrategia T-
Péptidos de origen animal BOC.
 Hidrolizados de Sheppard utilizó la SPPS por medio de la estrategia F-MOC
o colágeno Patarroyo desarrolló su vacuna anti-malárica con síntesis de péptidos
o elastina
o proteínas de leche ENLACE PEPTÍDICO
Péptidos de origen vegetal
 Hidrolizados de:
o Soja
o Trigo
o Germen de Trigo
o Arroz
Péptidos sintéticos

SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
 DNA recombinante  Microorganismos Sólo aminoácidos naturales Carácter de doble enlace del enlace peptídico y formación de H2O
o Realizados en reactores
 Transgénicos  Organismos animales y vegetales  Sólo aminoácidos naturales SÍNTESIS EN FASE SÓLIDA
 Síntesis química: Pequeñas moléculas.
o Solución
o Fase sólida
 F-MOC/t-bu
 T-BOC

PÉPTIDOS PRODUCIDOS EN LOS SERES VIVOS

TÉCNICA DE SPPS EMPLEADA POR MERRIFIELD

PÉPTIDOS PRODUCIDOS POR SÍNTESIS

 3. Geles soportados
4. Cepillos poliméricos: Componente linear/geometría particular

PROPIEDADES DE LOS SOPORTES SÓLIDOS:

Ser química y físicamente estables
Insoluble en H2O y en solventes orgánicos
Fácil de separar por filtración
Fácil y controlada derivatización
Alta solvatación y reactividad a reactivos
Alta movilidad de las cadenas
Reacciones rápidas y completas
Automatización

EL ANCLAJE/DESANCLAJE DEL PÉPTIDO A LA RESINA SE REALIZA POR MOLÉCULAS

BIFUNCIONALES CONOCIDOS COMO BRAZOS O LINKERS
Utilización: Labilidad y/o estabilidad del enlace del brazo con el péptido. C-terminal del péptido:
ácido o amina. Diversos grupos bencilo.

LINKERS T-BOC
VENTAJAS DE LA SPPS
 Soporte sólido es completamente insoluble
 Se lleva a cabo en un solo reactor
 Evita grandes pérdidas en purificación y separación de intermediarios (En solución es
complejo por la razón anterior) ¡FILTRADO!
 El uso de exceso de reactivos facilita que las reacciones sean completas
 Solvatación reduce considerablemente la agregación de la cadena peptídica
 Se puede variar la secuencia de A.A’s y modificarla.
 Síntesis simultánea de péptidos
 Es posible automatizar el proceso

INGREDIENTES PARA LA SÍNTESIS DE PÉPTIDOS:

Soporte sólido 1°
A.A’s – Grupos protectores 2°
Reactivos de acople 3°
Reactivos de desanclaje (Clivaje) 4°
Solventes (Sales caotrópicas (Desestabilizan la estructura del agua) 5°

1. SOPORTE SÓLIDO
Péptidos cortos: Alta funcionalización de la resina
Péptidos largos: Baja funcionalización de la resina

¡Cuidado con el impedimento estérico!

2. GRUPOS PROTECTORES
Permanentes
Uso de 3 o 4 excesos de A.A’s
Temporales
Existen cuatro clases de soportes base, a saber:

1. Soportes de tipo gel: Para este tipo de resinas se han desarrollado 4 tipos, a saber:
a. Resina hidrofóbica de poliestireno (Merrifield): Es el más usado. 2% de
entrecruzamiento por incorporación de divinilbenceno clorometilado. 1% de
entrecruzamiento modificación, para evitar problemas con la síntesis de
péptidos más complejos. Estable en T° y pH.
b. Resina de poliacrilamida (Sheppard)
c. Resinas de Polietilenglicol incrustado
d. Resinas de PEG hibridas con PPG o Pest.
2. Soportes de superficie:
a. Fibras de celulosa
b. Poliestireno Grupo Z: Cloro carbonato de bencilo Bzo (Cbz)
c. Polimetacrilato Alloc
d. Vidrio de poro controlado
e. Sílices
 El éster activo puede ser reaccionado con HOBt para disminuir la racemización y producir la amida
deseada al reaccionar con el amino del soporte base.
GRUPOS PROTECTORES PERMANENTES EN T-BOC Por otro lado, el éster activo puede reaccionar con otro ácido carboxílico, formando así un anhídrido,
que puede reaccionar posteriormente con el grupo amino del soporte base para producir la amida
deseada.
O puede que el éster activo reaccione directamente con el amino del soporte base para formar la
amida de interés.

4. SOLVATACIÓN

Solventes como aditivos.

DMF (Dimetilformamida)
DMA (Dimetilacetamida)
NMP (N-Metil pirrolidona)
DCM diclorometano
Sales caotrópicas: Generan desorden con el fin de evitar formación de agregados: LiCl; KCNS, Urea,
LiBr, tritón (TENSIOACTIVO ANFIFÍLICO))

Eficiencia de acople

Pruebas químicas
Reacción de Kaiser – Ninhidrina: Aminas primarias libres presentes (azul), Dejar que la
reacción dure más tiempo.
Cloranilo: Para aminas secundarias (Prolina)
Pruebas físicas: Probar funcionalización del soporte base
3. GRUPOS ACTIVADORES FT-IR (Transformadas de Fourier)
MALDI-TOF MS
Moléculas más reactivas
Carbodiimidas ESTRATEGIA COMPLETA DE T-BOC/Bencil
o DCC
1. Neutralización de la resina (DIEA/DIPEA)
2. Seleccionar A.A’s activado previamente y protector
3. Acoplar el aminoácido a la resina
4. Desacoplar T-BOC (Queda -NH3+)
5. Usar base para neutralizar resina (DIPEA)
6. Corroborar amina libre con Ninhidrina
o DIPC 7. Acoplar nuevamente con otro A.A’s
8. Repetir 2 a 6 varias veces
9. Desanclaje

PROCESO DE SÍNTESIS

Sales de Fosfonio Bolsas de polipropileno

o PyBOP Jeringas en vidrio o polipropileno
o PyAOP
Triazoles: Reaccionan con la O-acilisourea ESTUDIO DE SPF-66 (epítope de proteína del merozoíto) Manuel Elkin Patarroyo
o Hobt (Hidroxibenzotriazol) Contra esporozoíto, fase hepática esquizontes
Contra merozoíto (AQUÍ ACTÚA)
Anopheles es el vector de Plasmodium falciparum
Aotus trivirgatus como modelo experimental
Estrategia:
Identificar proteína de superficie de merozoíto
Secuencia de A.A’s
Síntesis de péptidos 11-22 A.A’s
o HBTU Inmunización de Aotus
Sales de Uronio Generación de respuesta inmune
o COMU Evaluación de los péptidos: ¿Protege? ó ¿no protege?
o TOTU
La activación se da de la siguiente manera: El ácido carboxílico a activar reacciona con la Replicas
carbodiimida, y se forma la o-acilisourea 50% (El restante es n-acilisourea (insoluble en el medio de 30-50 x por 2 días
reacción)), por lo que se usan 2 o 3 excesos de A.A’s. La o-acilisourea se considera un éster activo. 30000 x por 5 días
 15 días  Muerte
Tipos de vacunas:
Antiesporozoítos
CS Proteína (NANP  Región central inmunodominante)
Contra estadios hepáticos
Contra estadios asexuales: Antígeno MSA1 (Mayor de superficie)Proteínas de
degradación
Estadios sexuales: Gametocitos (Se evita diferenciación) Transmisión en zonas
endémicas

Síntesis:
T-BOC
Resina Polipropileno – MBHA
DIPEA 5% en H3CCl
Activador: DCC
Desanclaje TFA
Monitoreo con Ninhidrina

Desanclaje T-BOC
TFA
Tos: No es lábil a tratamiento ácido (His)  Proceso de tiólisis (Tiofenol)
Acople de histidina:
o Proteger con DNP
o Tener en cuenta la labilidad de H-Tos a presencia de HOBt
Regla para N y Q
o Siempre con HOBt
o Si yo tengo, después de H en la secuencia, N o Q, debo utilizar DNP.
La remoción de DNP se realiza por tiolisis con tiofenol en DMF. Además, se usa un ` A.A’s Protección y selección diferentes a T-BOC
scabenger, que remueva toda la basura de la reacción. Desprotección de F-MOC con PIPERIDINA
Acople idéntico a T-BOC
1. TRATAMIENTO CON HF [] BAJA 25%+65%dsm+10% p-cresol(scabenger): Grupos Desprotección de los grupos R con TFA (Síntesis ortogonal)
protectores de R. Desanclaje bajo: Mezclas que minimizan reacciones colaterales. Problema: Piperidina forma agregados. Solución: Sales caotrópicas.
2. TRATAMIENTO CON HF [] ALTA 90%+10%Anisol: Desanclaje de la resina
3. Lavados con éter
4. TRATAMIENTO CON DIPEA (Neutralización) CARACTERIZACIÓN DEL PRODUCTO
5. Extracción Identidad 1°
a. Ácido acético 10% en H2O Pureza 2°
b. Liofilización Estructura 3°
c. Oxidación: Puentes disulfuro inter e intracatenarios Tamaño 4°
i. Concentración: PM/Solubilidad Actividad
ii. Solvente: H2O Concentración
iii. O2: Grado medicinal Pureza
iv. Duración: 6 Horas
v. Controles: pH, rxn de Ellman Identidad: Cromatografía.
d. Diálisis y/o ultrafiltración Espectro de masas: Que la sustancia esté ahí
Cromatografía RP
F-MOC Cromatografía por exclusión

Purificación
Separación de especies. Cambiar gradiente.
HPLC preparativo
C18

Extracción en fase sólida

Cartuchos tipo jeringas
Minimizar el consumo de solventes
1. Empaque
2. Activación con MeOH-H2O;TFA 0.05% y H3PO4
3. Solución péptido crudo + fase estacionaria
4. Elución ACN-H2O.
5. Análisis eluídos por cromatografía
ALTA PUREZA  Actividad
Análisis de aminoácidos.
Hidrólisis ácida
Cromatografía
Proporción, presencia o ausencia de A.A’s en un péptido.’
Análisis frente a estándar
PITC (fenilisotiocianato) anclado a cromatógrafo
Aquí se tiene real certeza
Dicroísmo circular: L-D aminoácidos
RMN