CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES EN UNA MUESTRA PROBLEMA

[Andrea Jaramillo Carmona, William Andrés Castaño Arias, Andrés Cardona Muñoz
Dirigido a: Profesor Sebastián Pineda Pineda, Facultad de ingeniería y arquitectura, Manizales, Marzo de
2018]

Resumen
En la práctica que se explica a continuación se evaluó cuantitativamente la presencia de azúcares
reductores en algunas muestras mediante el método DNS, dónde la cantidad de azúcar reductor en la
muestra problema se determina mediante una curva de calibración elaborada experimentalmente. La
determinación cuantitativa de azúcares en la muestra asignada no fue lograda, pero se identificaron las
fallas cometidas así como otros factores que pueden inferir en el procedimiento.

Palabras clave: Método DNS, Carbohidratos, Azúcares Reductores, Absorbancia.

1. Introducción 2. Materiales y métodos

Los monosacáridos y la mayoría de los 2.1. Reactivos

disacáridos poseen poder reductor, que deben
al grupo carbonilo que tienen en su molécula.
Este carácter reductor puede ponerse de
manifiesto por medio de una reacción redox.
Los monosacáridos son compuestos orgánicos
constituidos por carbono, hidrogeno y oxígeno,
cuando un monosacárido contiene de 3 a 8
carbonos, se denomina un azúcar simple (como
la ribosa, glucosa o fructosa). [4]
La cuantificación de azucares reductores se
realiza utilizando el método DNS, bajo ciertas
condiciones. Cuando el ácido 3,5-
dinitrosalicílico es reducido en presencia de
calor por los azucares reductores que entran en
contacto con él, se desarrolla un cambio de
color parecido al café (con variaciones de
amarillo hasta café). El cambio de coloración
puede entonces determinarse mediante
lecturas colorimétricas por espectrofotometría
a una determinada longitud de onda (540 nm)
[1, 3]
Reactivo DNS, agua destilada y solución
patrón azucarada de 4g/L.
2.2. Muestras
Muestra azucarada problema número 4
suministrada por el docente.
2.3. Preparación de la muestra
Lo primero fue utilizar la regla de oro,
explicada por el docente, que consiste en:
1. Suponer una concentración estimada del
contenido de azúcar en la muestra
problema, para este caso se tomó como
base 100 g/l. 2. Adecuar la muestra a partir
de la suposición realizada para una curva de
calibración, como se ilustra en la tabla 1.
 Tabla 1. Diluciones realizadas utilizar para una correcta lectura eran las de 0,2
Concentra Volumen 2 V de la V de y 2g/L, este error es atribuido a distracciones
ción (g/L) (mL) muestra H20 presentadas en el laboratorio.
(mL) (mL)
20 1 0,2 0,8 De los 9 tubos de ensayo que se debieron haber
2 10 0,2 9,8
preparado (6 de la curva y 3 de la muestra), solo
0,2 2 0,2 1,8
se prepararon 6 (4 de la curva y 2 de la
muestra).
2.4. Preparación de la curva patrón
Para la lectura en el espectrofotómetro, se
debían acondicionar los tubos de ensayo de la
Se hizo la preparación de la curva patrón como
siguiente manera: 1. Se tomó un volumen de
está indicada en el numeral 4.3 de la guía de
0,5 ml de cada uno, y se le adicionó 0,5 ml de
laboratorio, como se ilustra en la figura 1.
reactivo DNS. 2. Se calentó cada muestra en un
baño de maría por 5 minutos, y se dejó enfriar
rápidamente en hielo. 3. Una vez frio, a cada
tubo de ensayo se le adicionó 5 ml de agua
destilada y se dejó reposar en la oscuridad
durante 31 min. 4. Finalmente, se leyó la
absorbancia a 540 nm, con los datos leídos en el
espectrofotómetro, se construye una curva de
Absorbancia Vs. Concentración.

3. Resultados y discusión

Figura 1. Preparación de patrones para la curva Con los datos provisionados por otro grupo de
de calibración del método DNS.. laboratorio, y los obtenidos por nuestro grupo,
construimos la tabla 2 donde se muestra la
Teniendo en cuenta que se debía preparar un absorbancia para cada concentración.
blanco, el cuál debía contener 0 g/L de solución
patrón azucarada, es decir, agua y DNS. Tabla 2. Resultados de espectrofotometría
Por el mal entendimiento del procedimiento en Tubo Concentración [g/L] Absorbancia a
la guía, solo se preparó los patrones de 4, 2 y 1 540 nm
g/L, y el blanco solo se preparó con agua. 1 0 (blanco) 0,000
2 0,25 0,019
3 0,5 0,038
2.5. Aplicación del método DNS
4 1 0,084
5 2 0,179
Para la utilización del método DNS, se debían 6 4 0,318
utilizar las 3 diluciones ilustradas en la tabla 1, 7 Muestra 1 (dilución 0,562
pero por falta de reactivos en el laboratorio a 2)
(reactivo DNS), solo se pudo utilizar las 8 Muestra 2 1,610
diluciones de 20 y 2 g/L, pero, las que se debían (dilución a 20)
 Usando los datos de la tabla 2, se obtiene la
gráfica que se presenta en la figura 2. Y para Y = 1,610 la concentración es:

1.610 − 0,0019
Curva de absorbancia vs. Concentración 𝑋= = 19,902 𝑔/𝐿
0.4 0,0808

0.3
Absorbancia

Ambas lecturas de absorbancia se salen de la

0.2 curva, por ende no se puede determinar un
y = 0.0808x + 0.0019 valor confiable de la concentración de la
0.1 R² = 0.9956
muestra.
0
0 1 2 3 4 5 Esto se debe en gran parte a que durante la
Concentración [g/L] práctica se tuvo ciertos errores al momento de
Figura 2. Curva de absorbancia Vs. preparar los patrones para la curva de
Concentración. calibración.
Adicionalmente, es necesario tener en cuenta
La ecuación de la recta que correlaciona los algunas desventajas del método DNS, como la
datos es: necesidad de realizar diluciones de la muestra,
y = 0.0808x + 0.0019 (1) que en muchos casos no es de concentración
conocida, hasta concentraciones bajas (0-4 g/L)
Y el coeficiente de correlación: y poder ser medibles, eliminando precisión;
mayores concentraciones conllevan a la no
R² = 0.99563 linealidad en la curva de calibración; por último,
la temperatura y el tiempo necesario de
La ecuación 1 permite decir que los datos de la calentamiento para lograr una buena coloración
curva patrón cumplen con la ley de Beer- de cada muestra y, por lo tanto, una correcta
Lambert [8], esta permite relacionar la cantidad lectura en el espectrofotómetro. [5]
de luz o radiación retenida (absorbida) por una
muestra en función de su concentración, como En la literatura se ha afirmado que el método
una relación lineal bajo condiciones límites. DNS no es tan sensible para la determinación de
azúcares reductores [2], sugiriendo la
Para hallar la concentración de la muestra utilización de otros métodos como el de Nelson-
problema se despeja X de la ecuación 1.
Somogyi [7], justificando que no existe relación
estequiometria entre el reactivo DNS y el
𝑌 − 0,0019 (2)
𝑋= número de grupos reductores presentes en el
0,0808
monosacárido, mostrando resultados diferentes
Para el valor de absorbancia Y = 0,562 la en el análisis de aldosas y cetosas [6], lo que
concentración obtenida es: lleva a decir que el color producido por la
reacción, está influenciado por varios factores
0.562 − 0,0019 presentes en el medio; además de dificultar la
𝑋= = 6,931 𝑔/𝐿 reproducibilidad del método.
0,0808
4. Conclusiones
Se concluye a partir de la práctica que una
muestra azucarada no pudo ser analizada
cuantitativamente debido a errores cometidos
en el desarrollo del procedimiento y/o a fallas
implícitas presentes en la fundamentación del
método DNS. Sin embargo, se logró construir
una curva de calibración a partir de una
solución estandarizada obteniendo un ajuste
casi perfecto, cumpliendo con las limitaciones
de la ley de Beer-Lambert, además de nuestro
criterio para descartar o agregar valores que
puedan generar variaciones en la ecuación de
la recta. En la elaboración de esta curva se
entendió cada uno de los pasos del método
DNS, observando los diferentes cambios de
color producidos y su significado físico a través
de la espectrofotometría, así como la
tendencia teórica que debía seguir la muestra
de haber sido cuantificada correctamente.
Referencias
1. Ávila Núñez Ramona, Rivas Pérez
Bernarda, Hernández Motzezak
Rómulo, Chirinos Marluy, Contenido de
azúcares totales, reductores y no
reductores en Agave cocui Trelease.
Multiciencias [en linea] 2012, 12 (Abril-
Junio). Disponible en:
http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=
90424216002
2. Kevser Sözgen Başkan, Esma Tütem,
Esin Akyüz, Seda Özen, Reşat Apak,
Spectrophotometric total reducing
sugars assay based on cupric reduction,
Talanta, Volume 147, 2016, Pages 162-
168. Disponible en:
http://www.sciencedirect.com/science/
article/pii/S0039914015303416
3. Guzmán G Paola T, García A Gabriel F,
Larios Emmanuel, DETERMINACIÓN DE
AZÚCARES REDUCTORES MÉTODO DNS,
Fundación Universidad de América [en
línea] 2013. Disponible en:
https://www.academia.edu/4403544/D
ETERMINACION_DE_AZUCARES_REDUC
TORES_METODO_DNS?auto=download
4. Curtis Helena, N. Sue. Barnes. Biología.
Sexta edición, Editorial Médica
Panamericana, 2000.
5. Ian P. Wood, Adam Elliston, Peter
Ryden, Ian Bancroft, Ian N. Roberts,
Keith W. Waldron, Rapid quantification
of reducing sugars in biomass
hydrolysates: Improving the speed and
precision of the dinitrosalicylic acid
assay, Biomass and Bioenergy, Volume
44, 2012, Pages 117-121. Disponible en:
http://www.sciencedirect.com/science/
article/pii/S0961953412002097
6. Abdul Aala Najmus Saqib, Philip John
Whitney, Differential behaviour of the
dinitrosalicylic acid (DNS) reagent
towards mono- and di-saccharide
sugars, Biomass and Bioenergy, Volume
35, Issue 11, 2011, Pages 4748-4750.
Disponible en:
http://www.sciencedirect.com/science/
article/pii/S0961953411004673
7. C. Breuil, J.N. Saddler, Comparison of
the 3,5-dinitrosalicylic acid and Nelson-
Somogyi methods of assaying for
reducing sugars and determining
cellulase activity, Enzyme and Microbial
Technology, Volume 7, Issue 7, 1985,
Pages 327-332. Disponible en:
http://www.sciencedirect.com/science/
article/pii/0141022985901115
8. Skoog Douglas A, West Donald M,
Holler F. James, Crouch Stanley R.
Fundamentos de química analítica,
Novena edición, Cengage Learning,
2015.