REPRODUÇÃO E OBSTETRÍCIA II

(Ano lectivo 2007/2008, 2º semestre)

Aula prática

AZOTO LÍQUIDO E RECIPIENTES CRIOBIOLÓGICOS

SÉMEN CONGELADO: MANEIO E APLICAÇÃO

João Nestor das Chagas e Silva

1. AZOTO LÍQUIDO: características e propriedades

O azoto (N2) líquido obtém-se arrefecendo com o auxílio de liquefatores especiais, o ar

atmosférico até que este passe ao estado líquido e depois, removendo o oxigénio e os gases
raros que constituem 1/5 daquele. Trata-se de um líquido incolor, inodoro, ligeiramente mais
brilhante que a água, não magnético e que não produz vapores tóxicos ou irritantes. É
quimicamente inactivo e a sua temperatura de ebulição à pressão atmosférica normal é de –196
ºC, o que o torna um fluido criogénico. Em consequência da sua temperatura, pode provocar
lesões nos tecidos (as geladuras) idênticas às produzidas pelo calor.
O azoto líquido evapora-se mais ou menos intensamente, em função do grau de isolamento do
recipiente onde se encontra acondicionado e, pequenas quantidades de líquido dão origem a
grandes quantidades de gás: um litro de N2 líquido converte-se em 700 litros (0,7 m3)de gás.

MEDIDAS DE SEGURANÇA PARA O MANUSEAMENTO DE N2 LÍQUIDO

COMO PROCEDER EM CASO DE ACIDENTE

TRANSFERÊNCIAS E TRANSPORTE DE N2 LÍQUIDO

As transferências de N2 líquido de um recipiente para outro ou o transporte de contentores de N2

líquido, apresentam normas de conduta bem definidas que deverão ser respeitadas para
minimizarem-se riscos e obter-se maior eficiência.
Todo o contentor para armazenamento de material biológico (sémen, embriões, células, tecidos,
etc.) tem um nível mínimo de segurança e sempre que o mesmo é atingido torna-se obrigatório
um reabastecimento de N2 líquido, sem o que, a qualidade daquele produto ficará
irremediavelmente comprometida.
A fonte de N2 líquido poderá ser um contentor não pressurizado para armazenamento exclusivo
do líquido criogénico ou um contentor pressurizado. No primeiro caso, a transferência deverá
efectuar-se com a ajuda de um funil de plástico colocado no colo do contentor a ser reabastecido,
enquanto que no segundo, quer esteja montado num veículo (camião-cisterna), quer seja fixo, ela
é executada por meio de flexíveis (tubos ondulados em aço inoxidável, protegidos exteriormente
por uma baínha de fio de aço entrançado, igualmente inoxidável.
 Todos os reabastecimentos de N2 líquido devem respeitar a oportunidade mais conveniente para
serem realizados, uma vez que a cada transferência se verifica uma perda por evaporação de 25%
do fluido. É óbvio que quanto mais numerosas e amiudadas elas forem, maiores serão as perdas e
menos económico, o processo.

LOCAIS DE ARMAZENAMENTO DE N2 LÍQUIDO

2. RECIPIENTES CRIOBIOLÓGICOS PARA N2 LÍQUIDO

CARACTERÍSTICAS GERAIS

Os contentores para N2 líquido são recipientes metálicos, de aço inoxidável ou de alumínio, de

parede dupla, no seio da qual é instalado um vácuo profundo. Destinam-se a receber, transportar
e conservar o líquido criogénico para que foram desenhados.
O profundo vácuo existente entre a dupla parede, o polimento das faces interiores e o recurso a
material de fraca condutibilidade térmica, permitem reduzir ao mínimo as possíveis trocas de
calor entre o líquido e o meio ambiente exterior, tornando económico o processo de conservação
do N2 líquido.
Com este tipo de recipientes pode obter-se uma temperatura interna, constante, de –196 ºC e não
implicam grandes riscos, nem estão sujeitos a avarias de natureza mecânica, nem tão-pouco,
como sucede com os frigoríficos ou arcas congeladoras, aos cortes de energia eléctrica.

TIPOS DE RECIPIENTES CRIOBIOLÓGICOS PARA N2 LÍQUIDO

a. Para conservação e transporte de N2 líquido (exclusivamente)
b. Para conservação de sémen ou outros produtos biológicos

UTILIZAÇÃO E CUIDADOS A TER COM CONTENTORES DE N2 LÍQUIDO PARA

ARMAZENAMENTO DE SÉMEN/EMBRIÕES

Os contentores para armazenamento de sémen/embriões são recipientes não pressurizados em

que os vapores que se vão libertando, escapam-se livremente a partir do colo do contentor,
através das ranhuras do tampão. Resumem-se a dois vasos metálicos, colocados um dentro do
outro e separados por vácuo, contactando entre si, apenas ao nível do colo, o que torna esta região
relativamente frágil. Na porção superior do colo, existe um anel numerado com várias ranhuras
que correspondem ao encaixe de outras tantas hastes dos “canisters”. Estes são copos cilíndricos
de metal ou de plástico, de um ou mais andares, munidos de uma haste de modo a serem
manipulados, destinados a receber e armazenar as doses de sémen ou de embriões.

AUTONOMIA DE UM CONTENTOR
a. Autonomia estática
b. Autonomia dinâmica ou em trabalho

MEDIÇÃO DO NÍVEL DE N2 LÍQUIDO DE UM CONTENTOR

O nível de alarme de um contentor de sémen ou outro produto biológico é alcançado quando ele
não contém mais de 5 cm de altura de N2 líquido. Sempre que este nível é atingido (≤5 cm) as
temperaturas no interior do contentor elevam-se perigosamente para valores superiores a –80 ºC,
limiar compatível com a manutenção da qualidade do sémen.
A medição do nível do N2 líquido é uma operação de fácil execução que deve ser repetida com
frequência, pelo menos uma vez por semana, pois a autonomia de um dado contentor constitui
apenas uma indicação e não uma garantia.

TIPOS DE CONTENTORES DE N2 LÍQUIDO PARA UM SUBCENTRO DE IA DE

BOVINOS

COMO TRANSPORTAR UM CONTENTOR

COMO ARMAZENAR UM CONTENTOR

LIMPEZA E DESINFECÇÃO DOS CONTENTORES

A limpeza e desinfecção dos contentores deve constituir uma preocupação regular, uma vez que o
azoto líquido não é, nem bactericida, nem virucida e, com o tempo e a manipulação, contamina-
se com maior ou menor intensidade. Para além disso, é muito frequente cairem doses de sémen
dos “canisters” para o fundo do contentor, podendo partir-se com o movimento destes últimos ou
dificultar a sua manipulação.
Podem ser considerados os seguintes intervalos de tempo para limpeza e desinfecção:
- contentores de campo (dos inseminadores,por ex.): de seis em seis meses;
- contentores de laboratório: uma vez por ano;
- grandes contentores para armazenamento de sémen (de Centros de IA, por ex.): todos os 3-4
anos.

AVARIAS E ACIDENTES

A grande maioria dos contentores de N2 líquido garante-nos vários anos de bom funcionamento:
cerca de 10 anos de vida útil, se mantidos em boas condições de armazenamento e/ou trabalho.
Porém, pode acontecer que apresentem falhas, mesmo tratando-se de recipientes novos.
A experiência tem vindo a demonstrar que o melhor e o mais económico método de garantir a
protecção do sémen armazenado, consiste na medição periódica do nível de N2 do contentor.
Os registos da American Breeders Service (ABS, EUA) indicavam, já na década de 80, que mais
de 80% das falhas dos contentores eram de pequena importância e manifestavam-se lentamente
com o decorrer dos anos. Tal facto, permite evitar que se verifiquem perdas de sémen. A
inspecção regular dos contentores (nível de N2 líquido, corrosão, escape dos vapores, etc.) e a
existência de registos actualizados sobre as suas “performances” promovem a segurança do
material biológico neles armazenados.
Alguns sinais podem dar-nos indicação da perda de vácuo de um contentor: aumento mais ou
menos repentino da taxa de evaporação, paredes exteriores muito mais frias que o habitual,
formação de condensação ou gelo fino no exterior, nas proximidades do colo do contentor ou a
audição de silvo ou borbulhar.
As avarias súbitas ocorrem normalmente após quedas ou choques, especialmente aquando de
acidentes de transporte.
 COMO PROCEDER EM CASO DE EMERGÊNCIA

Se a perda de vácuo fôr evidente ou provável, é necessário transferir de imediato todo o sémen
para um outro contentor em perfeitas condições de trabalho e mandar analisar algumas doses
seminais para verificar se a sua qualidade foi afectada. O contentor avariado deve ser retirado do
serviço e enviado ao representante da marca do modelo em causa que, por sua vez, avaliará a
economicidade de uma eventual reparação. Nunca se deverá tentar reparar o contentor pelos
próprios meios.

3. SÉMEN CONGELADO. MANEIO E APLICAÇÃO

MANIPULAÇÃO DO SÉMEN CONGELADO NOS CONTENTORES

As variações de temperatura são deveras perigosas para o sémen congelado. O grau de

depreciação está dependente da extensão, da duração e da frequência dos reaquecimentos.
Constatou-se que a temperatura do sémen congelado deverá manter-se, em permanência, abaixo
dos –130 ºC. Se a temperatura no interior de um contentor subir acima dos -80 ºC, o sémen não
deverá ser utilizado em IA, pois a sua qualidade poderá estar notavelmente reduzida, uma vez
que os espermatozóides são sede de recristalização dos cristais de gelo intracelulares e sofrem o
“efeito solução”.

TRANSFERÊNCIA DE SÉMEN CONGELADO

Embora o N2 líquido seja o meio ideal para armazenamento e transporte de sémen congelado,
muitas são as situações que podem expô-lo a temperaturas elevadas, desde a sua congelação num
Centro de IA até a descongelação para a inseminação de uma fêmea em cio.

Transferência do sémen de um contentor para outro

Exposição do sémen congelado durante a remoção do contentor
Inventário do sémen armazenado num contentor

4. SÉMEN CONGELADO. DESCONGELAÇÃO: TEMPOS E TEMPERATURAS

O tipo de acondicionamento de sémen e o volume do mesmo nele contido afectam a célula

espermática durante a congelação e posterior descongelação e, consequentemente, a
sobrevivência dos SPZ e a taxa de não-retorno. O método de descongelação determina o número
de SPZ vivos à altura da IA o que, por sua vez, afecta a fertilidade subsequente.

SÉMEN ACONDICIONADO EM PALHINHAS

O processo de descongelação do sémen acondicionado em palhinhas depende do tipo da

palhinha. Os inseminadores devem ser instruidos no sentido de não lidarem com as palhinhas
médias da mesma forma com que lidam com as mini-palhinhas.
 MINI-PALHINHA (Cassou, 1969)
A mini-palhinha é um tubo oco de cloreto de polivinilo com 133 mm de comprimento e 1,7-2
mm de diâmetro. Uma das extremidades encontra-se obliterada por um tampão constituído por
algodão cardado e álcool polivinílico, que funciona como êmbolo no acto da inseminação. A
outra extremidade é a de enchimento e é selada em laboratório. A sua capacidade real é de 0,25
mL, mas a útil é de 0,22 mL em virtude da câmara de ar que se encontra no seu interior.
A população de SPZ vivos por mini-palhinha varia segundo a espécie animal, a fertilidade de
campo do reprodutor (caso dos bovinos) ou local de deposição do sémen (caso dos pequenos
ruminantes):
TOURO (sémen congelado, IA à entrada do corpo do útero)- 20x106 SPZ vivos e com
movimentos rectilíneos e progressivos.
CARNEIRO (sémen fresco, IA à entrada do cérvix)- 400-500x106 SPZ vivos e com movimentos
rectilíneos e progressivos.
CARNEIRO (sémen congelado, IA intra-uterina)- 50x106 SPZ vivos e com movimentos
rectilíneos e progressivos.

PALHINHA MÉDIA (Cassou, 1965)

A palhinha média também é de cloreto de polivinilo, tem o mesmo comprimento da mini-
palhinha e 2,5-2,8 mm de diâmetro. Possui uma capacidade real de 0,5 mL, porém contém
efectivamente 0,48 mL de sémen diluído, dada a existência da câmara de ar.
A população de SPZ viáveis por palhinha média, nos touros, é por norma de 30x106 SPZ,
variando em função da fertilidade de campo do reprodutor, com os touros mais férteis a terem
menos SPZ por dose, até um limiar de cerca de 12-15x106 SPZ.

PROCESSO DE DESCONGELAÇÃO E DE PREPARAÇÃO DA CÂNULA DE IA

a) Da mini-palhinha
Preparar o banho-maria. Recomenda-se um banho de aquecimento eléctrico e termostaticamente
controlado. Este equipamento pode ser ligado ao isqueiro da viatura. No entanto, uma simples
garrafa termos e um termómetro servem perfeitamente.
A água do banho-maria deve ser potável e corrente, substituída a cada dia, deve ter volume
suficiente para cobrir inteiramente a dose de sémen a descongelar e deve ser aquecida a 35-37 ºC.
O tempo de descongelação é de 7 segundos e deverá ser controlado com o recurso a um
cronómetro.
Após a descongelação e secagem perfeita da dose seminal, a extremidade soldada é cortada à
altura da câmara de ar e adaptada ao cilindróide verde da baínha de IA. Esse conjunto é
introduzido na extremidade certa do “pistolet” Universal (IMV, França) e fixo por pressão de
uma anilha de plástico sobre um cone metálico. O mandril é então empurrado suavemente até se
obter a “pérola”. Proteger a cânula e preparar para o acto de IA.
Actualmente, existem no mercado vários dispositivos de IA de diversos fabricantes.
b) Da palhinha média
O banho-maria deverá ser aquecido a 35-37 ºC antes de se retirar a palhinha do contentor. Depois
de nele mergulhada, permanecerá apenas 25 segundos. O controlo do tempo de descongelação
deverá ser rigoroso.
Após a secagem e abertura da palhinha média, o conjunto palhinha+baínha de adaptador verde é
colocado sobre a extremidade correcta da cânula do “pistolet” Universal (IMV, França) e fixo
como se descreveu para a mini-palhinha. Todo o processo que se segue é idêntico ao que se
referiu para a mini-palhinha.