OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:

Adiestrar al participante con los procedimientos y manejos de los

diferentes métodos generales para el contaje de microorganismos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Determinar por medio de la técnica de recuento en placas los

microorganismos aeróbicos y facultativos anaeróbicos que crecen sobre
un medio de cultivo sólido.

Determinar a través de la técnica de NMP, las poblaciones de Coliforme

totales y fecales presente en la muestra.

Aislar en medio sólido e identificar bioquímicamente cepas de Echerichia

coli a partir de la muestra analizada
 INTRODUCCION

Las principales bacterias coliformes son Escherichia coli y

Enterobacter aerógenes. La primera se encuentra normalmente en el tracto
gastrointestinal del hombre y de los animales y raramente aparece en otro
lugar, mientras que Enterobacter aerógenes se asocia normalmente con la
vegetación y sólo ocasionalmente aparece en el intestino.
En los alimentos la presencia y concentración de E coli es de
menor significado y en presencia, incluso en mayor número, no implica
necesariamente una contaminación fecal intensa reciente.
Los métodos utilizados para el aislamiento y recuento de los gérmenes
patógenos son menos eficaces cuando estos se encuentran en pequeño
número en los alimentos, y sobre todo cuando abundan otros
microorganismos.
Estos gérmenes o especies que se utilizan para tal fin se denominan
organismos indicadores ya que son de gran utilidad tanto para determinar la
calidad bacteriológica de los alimentos como la garantía que ofrecen al
consumidor.
La finalidad por la que se usan las bacterias indicadoras como
reveladoras de prácticas de higiene inadecuadas es precisamente para
poner de manifiesto determinadas condiciones de tratamiento o manipulación
de los alimentos que suponen un peligro potencial.
En esta practica analizaremos una muestra de jugo de patilla para
indicar mediante técnicas de recuento en placas y por el método de NMP la
presencia de microorganismos indicadores de calidad y contaminación fecal.
 HOJA DE REGISTRO

Nombre del alimento: jugo de patilla (Citrullus vulgaris)

no pasteurizado.
Procedencia: Comedor, UNESR. Canoabo.
Características Organolépticas:
Color: rojo oscuro.
Consistencia: líquida.
Olor: característico.
Transporte: envase de plástico previamente esterilizado.
Recepción: envase de vidrio esterilizado.
Análisis microbiológicos: aerobios mesófilos, Enterobacterias, Coliformes
totales, fecales y E.coli
 MATERIALES Y METODOS

Materiales:
Pipetas graduadas de 1 ml.
Pipetas volumétricas de 1 ml.
Placas de petri.
Gradillas.
Pinzas.
Tubos de ensayo.
Mechero.
Asa y aguja de platino.
Contador de colonias.
Estufa.
Frascos y tubos de dilución.

Medios de cultivo y soluciones:

Agar plate cound.
Agar Mc- Conkey.
Agar KF.
Agar EMB.
Caldo EC.
Caldo lauril sulfato triptosa (LST).
Caldo MR- VR.
Solución de rojo de metilo.
Solución de naftol al 6%.
Solución de KOH al 16%.
Agua peptonada al 0.1% para diluciones.
Métodos:
Recuento de microorganismos aerobios mesófilos en placas.
Recuento de Enterobacterias en placas.
Determinación de Coliformes totales, fecales, y E.coli, A través de método
del numero mas probable (NMP).
 RECOMENDACIONES

Tomar en cuenta las normas de seguridad de laboratorio, en los

momentos de manipular el material biológico.

Trabajar con volúmenes precisos para obtener resultados confiables.

Homogenizar las muestras para obtener suspensiones bacterianas

uniformes.

Aplicar correctamente las normas de asepsia durante el análisis de las

diluciones y al observar los resultados.

Se debe transportar la muestra en envases previamente esterilizados

para no alterar la población microbiológica del alimento.

Manipular el material biológico con suma precaución, para evitar riesgos

de contaminación.

Realizar las pruebas bioquímicas correctamente para obtener lo

resultados deseados.
 RESULTADOS

Cuadro 1. Recuento de microorganismos aerobios mesófilos en placas de

agar plate cound a partir de una muestra de jugo de patilla (Citrullus
vulgaris) no pasteurizado.

Dilución Recuento UFC/mL

62
10-3 38

12
10-4
17 5,0.103

4
10-5 0
Cuadro 2. Recuento de Enterobacterias en placas de agar Mc – Conkey de
una muestra de jugo de patilla (Citrullus vulgaris).

Número de colonias Recuento UFC/m

L

10-3 52
31

13
10-4
9 4,2.103

10-5 5
0
Cuadro 3. NMP de Coliformes totales presentes en la muestra de jugo de
patilla (Citrullus vulgaris) utilizando como medio de cultivo caldo lauril sulfato
triptosa.

Diluciones Resultados En Tubos NMP/mL

3/3
10-1

3/3
10-2 >2100

10-3 3/3

Cuadro 4. NMP de Coliformes fecales presentes en la muestra de jugo de

patilla (Citrullus vulgaris) utilizando como medio de cultivo caldo E. Coli

Diluciones Resultados En Tubos NMP/mL

0/3
10-1

0/3
10-2
<3

10-3 0/3

Cuadro 5. Identificación de colonias típicas de E. coli en medio selectivo

EMB.
 Diluciones Observaciones

10-1
colonias circulares negras
con brillo metálico verde en
10-2
los tres medio de cultivo.

10-3

Cuadro 6. Estudio y confirmación bioquímica de las colonias de E. coli

observadas en el medio selectivo EMB.

Prueba Reconocimiento
Utilización de citrato. +
Indol. -
Vorges – proskaver. +
Rojo de metilo. +

+ (Prueba positiva)
- (Prueba negativa)

BIBLIOGRAFIA.
Barreto, M. Manual practico de laboratorio de microbiologia general.
Trabajo de asenso. UNESR. Canoabo estado Carabobo.1996.

Límites microbiológicos de la ICMSF (International Commission on

Microbiological Specifications for Foods 1994).

Pelczar, M. 1977. Microbiología. 4ª Edición. Editorial Mc Graw Hill.

México.

Normas Covenin Nº 902-87.1987 1921 – 79. Aislamiento de salmonella.

Caracas Venezuela.

Thatcher, F. (1973). Anàlisis microbiológicos de los alimentos. Editorial

Acribia. Zaragoza, España.

Universidad Nacional Experimental

“Simón Rodríguez”
 Núcleo Canoabo
Ingeniería de Alimentos
Laboratorio de Microbiología de Alimentos

Facilitador: Participantes:
Ing: Tedder Molina. Br: Pulido Javier E.
CI: 18.857.379
Preparadora:
Br: Jenny Montilla.
Noviembre, 2007
 DISCUSION DE RESULTADOS

Recuento de microorganismos aerobios mesófilos.

 El cuadro 1 se presentan los resultados del recuento de
microorganismos aerobios mesófilos en placas, partiendo de diluciones
preparadas con una muestra de jugo de patilla (Citrullus vulgaris).

Se determino que la muestra poseía 5,0.10 3 UFC/mL, sobrepasando

los valores permitidos de este microorganismo en un alimento según
(ICMSF, 1994) donde establece que el estándar permitido, se encuentra
entre 100 – 150 UFC/gr o mL de muestra.

La presencia de este microorganismo en un alimento, puede ser

causada según lo señala (Thacher, 1973) por materias primas contaminadas
limpieza y desinfección inadecuada o condiciones insuficientes de tiempo y
temperatura durante la producción y conservación de los alimentos.

Recuento de Enterobacterias.
En el cuadro 2 se muestran los resultados del recuento de
Enterobacterias, la población de este microorganismo fue estimada en
4,3.103 UFC/ml de jugo de patilla analizado.

Los recuento reportados por cada dilución, son el producto de la

sumatoria de las colonias lactosa + y lactosa negativas desarrollada en el
medio de cultivo, considerándose lactosa positiva aquellas, cuya coloración
era roja y negativa las colonias con pigmentación blanca. Según (pelczar,
1978) En las determinación de Enterobacteris se de debe selecciona un
medio de cultivo que permita la formación de las diversas bacterias
pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, observándose en el medio
colonias lactosa positiva rojas pertenecientes ciertos microorganismo de
origen fecal como E.coli y lactosa negativas blancas.
Coliformes totales
El resultado de este análisis se muestran en el cuadro 3,
obteniéndose valores drásticos ya que según (ICMSF, 1994) par zumos de
frutas no pasteurizada el limite máximo permisible es de 100NMP/mL,
representando valores por encima de la norma una fuente potencial de
intoxicaciones alimentarias.

La identificación de los tubos fue posible por la producción de

gas y acido que generan estos microorganismos al fermentar la lactosa
(pelczar, 1978)) la cual fue apreciable por un enturbamiento en los medios de
cultivo y la presencia de gas en los tubos de dhurman.

La presencia de este grupo de microorganismos en el jugo

analizado es indicativo de que fue sometido a condiciones higiénicas
inadecuadas.

(Thacher, 1973) Describe estos gérmenes como un grupo de

microorganismos intestinales dentro de los cuales se encuentran E.coli,
Enterobacter, Kliebsiella que se caracterizan por ser bastones cortos, gram
negativos, no esporulados, fermentadores de lactosa con producción de
acido y gas a temperaturas de 35 – 37 ºC.

Coliformes fecales
El NMP/ml de jugo analizado para la determinación de
coliformes fecales fue de <3, situándose este valor fuera del estándar de la
norma de 50 – 100 NMP/mL o gr de muestra analizada.
 Se identificaron los tubos por la presencia de gas y un
enturbamiento generalizado del medio de cultivo.

El resultado de este análisis pone al descubierto la posibilidad

del que el alimento halla estado en contacto con materia fecal, siendo la
fuente de contaminación indirecta (agua utilizada en la preparación) o
directamente por contacto con utensilios u otros objetos. (Barreto, 1996)

Aislamiento y confirmación de E.coli

Se realizo una siembra en un medio de cultivo selectivo EMB,
observándose el desarrollo de una serie colonias redondeadas de color
negro con un brillo verde metálico característico de este microorganismo
según (Barreto, 1996). Posteriormente se procedió a su confirmación
bioquimica donde los resultados para la prueba de citrato de sodio, vorges –
proskaver y rojo de metilo resultaron positiva, exceptuando la prueba de indol
ya que no hubo reacción alguna , dicho comportamiento bioquimico es
señalado como característico de E.coli por (pelczar, 1978) donde señala que
esta bacteria enteropatógena es capaz de utilizar al citrato de sodio como
única fuente de carbono ,y las colonias que forman resultan positivas para la
prueba de rojo de metilo.

CONCLUSIONES
 La población de microorganismo aerobios mesofilos presente en la
muestra de jugo analizada es de 5,0.103 UFC/mL.

 La población de Enterobacterias calculada en la muestra fue de 4,2 .

103 UFC/Ml.

 La muestra presentaba coliformes totales en NMP/mL de >2100 y

fecales <3.

 Se confirmo la presencia de E. coli por aislamiento en medio selectivo

y confirmación bioquimica a partir de la muestra de jugo.
Figura I. colonias de Enterobacterias lactosa positiva y negativa en agar Mc-
cokey. Fuente (www. Chemical/ sic_4p microbiological.com)

Figura II. En la figura se muestran colonias negras típicas de E.coli. Fuente

(textbookofbacteriology.net/nfe.)