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PROTEINE

FUNZIONI GENERALI:
 STRUTTURALE: Mantenimento della morfologia delle varie strutture,
compresa l’impalcatura cell. Collageno, Cheratine, Elastina

 DINAMICA: Proteine di trasporto(emoglobina), Enzimi.

 TRADUZIONE DI ENERGIA: Trasformazione da una forma di energia


ad un’altra. ATPasi, Pompe ioniche, Actina/Miosina.

 DIFESA IMMUNITARIA: Immunoglobuline(anticorpi).

 ALIMENTARE: Amminoacidi essenziali.

PROTEINE

Oligomeriche Monomeriche

Strutturale Funzionale

PROTEINE

SEMPLICI: CONIUGATE:
solo amminoacidi associate ad altre entità ioniche o molecolari

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La struttura di una proteina è una sola ed è quella NATIVA, che è
corrispondente alla sua funzione biologica e quindi se viene alterata
pregiudica la funzione biologica della proteina.

STRUTTURA PRIMARIA: Numero di residui aminoacidici nella loro


sequenza.

STRUTTURA SECONDARIA: Conformazione assunte dai tratti di catena


polipeptidica; tali conformazioni sono date dalle interazioni deboli che si
stabiliscono tra i vari amminoacidi e dunque dipendono dalla sequenza
amminoacidica, in natura si sono affermate quelle quelle a più basso
contenuto di energia libera. Abbiamo:
 ALFA ELICA
 FOGLIETTO BETA
Una proteina può assumere nei diversi tratti diversi tipi di conformazioni, in
alcuni tratti può avere una conformazione del tutto casuale.
STRUTTURA TERZIARIA: la struttura tridimensionale complessiva assunta
dall’intera catena polipeptidica data dal ripiegamento e dall’interazione tra le
diverse strutture secondarie. STRUTTURA GLOBULARE in cui è presente
un’alternanza di andamenti ordinati e random.

STRUTTURA QUATERNARIA: E’ una struttura oligomerica di tipo funzionale.


Aggregazione funzionale di vari monomeri, in cui ogni monomero influisce
sull’attività di quello accanto, conferendo carattere cooperativo.

AMMINOACIDI
STRUTTURA DEGLI AMMINOACIDI
I monomeri che costituiscono le proteine sono gli  -amminoacidi. Il gruppo
amminico è legato al carbonio  adiacente al gruppo carbossilico, sono legati
a un atomo di H e ad una catena laterale R che è diversa per ogni
amminoacido.
La struttura generica degli amminoacidi ordinari è la seguente
COOH
|
H-C-R
|
NH2
Per eliminazione di una molecola di acqua, il gruppo amminico di un
amminoacido può legarsi al gruppo carbossilico di un altro
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H2N-CH-COOH + H2N-CH-COOH --> H2N-CH-CO-NH-CH-COOH + H2O
I I I I
R R R R
il legame che unisce due amminoacidi, evidenziato in rosso, prende il nome
di legame peptidico. Una catena di più amminoacidi legati attraverso legami
peptidici prende il nome di generico di polipeptide, uno o più polipeptidi, a
volte accompagnati da altre molecole ausiliarie, costituiscono una proteina.
STEREOCHIMICA DEGLI  –AMMINOACIDI
Un atomo di C è detto chirale o centro di chiralità o stereocentro o carbonio
assimetrico se legato a 4 sostituenti diversi. Se una molecola contiene un
carbonio assimetrico può avere 2 possibili stereoisomeri distinguibili detti
enantiomeri. Gli enantiomeri L e D possono essere distinti perché in
soluzione ruotano il piano della luce polarizzata in direzioni opposte.

Tutti gli amminoacidi tranne la glicina(2 dei gruppi legati al C sono uguali)
possono esistere nella forma D o L.
Tutti gli amminoacidi incorporati dagli organismi nelle proteine sono nella
forma L.

PROPRIETA’ DELLE CATENE LATERALI DEGLI AMINOACIDI

Sono venti e vanno considerati in gruppi:

 AMMINOACIDI ALIFATICI: Hanno un gruppo R alifatico con la catena


che è crescente in termini di C.
Glicina, Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina

 AMMINOACIDI CON CATENE LATERALI CONTENENTI ZOLFO o


GRUPPI OSSIDRILICI: Sono + idrofilici degli alifatici .
Serina: funzione alcolica e interviene nelle reazioni di esterificazione;
Metionina: è un amminoacido essenziale, è il donatore di gruppi metilici,
senza l’apporto necessario si istaurano patologie(anemie…);
Cisteina: Si distingue per 2 aspetti, la catena laterale si dissocia a PH
elevato; tra le due catene laterali di cisteina si può avere un’ossidazione
che porta alla formazione di un ponte disolfuro, il prodotto di
quet’ossidazione è detto cistina, maggiore è la quantità di cisteina,
maggiore è la compattezza della proteina;
Treonina.

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 AMMINOACIDI AROMATICI: Contengono gruppi aromatici e avendo
anelli con doppi legami coniugati assorbono fortemente la luce nella
regione dello spettro ultravioletto corrispondente.
Fenilalanina: E’ uno degli amminoacidi più idrofobici ed è un amminoacido
essenziale;
Tirosina: E’ importante perché è un residuo amminoacidico importante nel
recettore per l’insulina, ha carattere idrofobico e si dissocia a pH elevato;
Triptofano: Amminoacido essenziale che ha nel gruppo aromatico un
pirrolo.

 AMMINOACIDI BASICI: Quando un gruppo carbossilico diventa


carbonilico, cioè perde la carica negativa, il suo gruppo amminici
diventa da primario a secondario, cioè perde a capacità di coordinare
un protone e quindi non presentano cariche se non a livello delle catene
laterali. Sono fortemente polari perciò si trovano sulla superficie esterna
delle proteine dove possono essere idratate dall’ambiente acquoso
circostante.
Istidina: meno basico dei tre;
Lisina;
Argirina.

 AMMINOACIDI ACIDI e AMMIDI CORRISPONDENTI: Sono tutti


amminoacidi sintetizzabili. Le ammine presentano un gruppo C=O
Aspartato :la cui ammina è l’ Asparagina;
Glutammato: la cui ammina è il Glutammato. NH2

 AMMINOACIDO CICLICO: Prolina: anello alfa iminoacido,porta a punti


di discontinuità nella struttura primaria che influenzano la secondaria e
la terziaria.

STRUTTURA SECONDARIA
Le proteine possono assumere diverse strutture ma ci sono delle restrizioni a
cui devono attenersi.

o Gli atomi che costituiscono il legame peptidico stanno su un piano.


Perché O, N, C, fra loro si distribuiscono a carattere di =. La distanza
tra C e N è intermedio tra = e - . Quindi atomi tenuti insieme da = non
possono ruotare, gli atomi sono su un piano e l’unica possibilità di
rotazione è a monte di questo piano.

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o La carica presente sui gruppi R. Gruppi R carichi sono presenti nei
residui di glutammato e aspartato e in quelli basici. Quando i residui in
base alla posizione tridimensionale si trovano vicini possono esercitare
atrazione o repulsione.

o Le dimensioni dei gruppi R.

Pauling scoprì strutture che rispondevano a tutti questi requisiti.

  elica: è una struttura stabilizzata da legami a idrogeno tra H del


gruppo amminico e il gruppo carbonilico che segue tre posizioni dopo e
che in virtù dell’avvolgimento si confronta con NH che si trova a
distanza compatibile per formare un legame a H. (i legami a H hanno
basso contenuto energetico ma trovandosi tutti sull’asse di
avvolgimento nella stessa direzione contribuiscono al mantenimento
della struttura).
I legami a H sono localizzati entro una singola catena polipeptidica. L’
 elica si ripete ogni 18 residui e corrisponde a 5 giri: presenta 3.6
residui per giro.
Ogni O carbossilico forma un legame a H con il protone amminico del
quarto residuo successivo nell’elica, quindi ogni legame a H chiude un
ansa formata da 13 atomi. Importante è la dimensione del gruppo R,
quando grazie alla rotazione gruppi R di grandi dimensioni si trovano
vicini e possono non essere alloggiati, creando destabilizzazione.
La struttura ad  elica è caratteristica delle  cheratine, proteine fibrose
(ossia caratterizzate da una sola conformazione) con funzione
strutturale presenti in tutte le formazioni cornee

 Foglietto  ha una struttura distesa e i gruppi R sono al di sopra e al di


sotto del piano. Caratterizzata da una serie di peptici che decorrono
affiancati tra loro con un andamento che può essere parallelo o
antiparallelo.
Parallelo significa che i peptici iniziano tutti con l’estremità carbossilica
da un lato e quella amminica dall’altro.
Nell’antiparallelo abbiamo un’alternanza di direzione N—C, i polipeptidi
affiancati hanno polarità opposta.
I legami a H sono tra catene adiacenti.
I residui R sono localizzati nello spazio tra i foglietti ortogonalmente.
Questi residui hanno a disposizione spazi tra loro variabili ma sempre
limitati, altrimenti non ci sarebbe la robustezza necessaria, visto che si
tratta di proteine di sostegno. Per questo troviamo gruppi alterali con
catene R di modeste dimensioni.

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 Elica 310 si può riscontrare in alcune proteine ma non è diffusa come l’a
elica.

 Elica p sebbene sia stericamente possibile non è mai stata osservata.

PROTEINE FIBROSE
Le proteine fibrose hanno una forma allungata e, a differenza delle proteine
globulari, sono costituite da un unico elemento di struttura secondaria: eliche
o strutture b.

Sono in genere caratterizzate da elevata resistenza meccanica alla trazione,


rigidità e compattezza, ma alcune sono flessibili ed elastiche. Sono quindi
particolarmente adatte a svolgere funzioni strutturali.
Una di esse, il collageno è la più abbondante delle proteine fibrose nei
vertebrati

Il collagene
E’ la proteina + abbondante presente nei vertebrati, con concentrazioni che
variano in funzione della specie da 20 al 40%. E’ la sostanza principalmente
presente nei tessuti connettivi. Si presenta sotto varie forme: nelle ossa (con
precipitazione di cristalli di idrossipatite), nei tendini (sotto forma di fibre
allineate), nella cornea, nel cristallino, nella parete dei vasi (associata
all’elastina.
COLLAGENO
Proprietà Resistenza, Rigidità, Insolubilità
Quantità 20-40% in tutte le proteine
Localizzazione Extracellulare
Struttura Polimorfa non meno di 12 tipi diversi di collageno con
altrettanti tipi di catene  costituenti.
Unità fondamentali Tropocollageno (dim 30nm X 1,5nm)
Non c’è ancora una stima precisa sui tipi di collageno, da 15 a 19 secondo le
ultime teorie. I vari tipi di collageno si distinguono nella sequenza primaria
delle catene che costituiscono il tropocollageno, l’elemento fondamentale.
Il collageno di tipo I, il + diffuso, è caratterizzato dalla mancanza di cisteina e
triptofano. Le peculiarità del collageno variano a seconda della funzione.
Nell’ uomo è maggiormente presente nel muscolo e nelle ossa e nella pelle,
ma è distribuito + o meno ovunque. Facendo una micrografia elettronica del
collageno si vedono fibre dotate di una striatura periodica, che il risultato
dell’allineamento delle unità di tropocollageno.

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Le fibre collageno sono date dalla polimerizzazione di tropocollagene.
Il TROPOCOLLAGENE è una proteina dotata solo di struttura secondaria,è
una tripla elica, di tre catene di polipeptidi, ciascuna lunga circa mille residui.
Le singole catene sono eliche sinistrorse che si avvolgono l’una all’altra in
senso destrorso, stabilendo legami H. Ciò garantisce che non si potrà
svolgere spontaneamente, infatti lo srolotolamento in un punto centrale
porterebbe ad un superavvolgimento.
In questa struttura troviamo alcune peculiarità:
Y La struttura tipica dell'elica del collageno è dovuta alla particolare
sequenza amminoacidica delle catene, che è costituita per oltre un
terzo da glicina e per almeno un quinto da prolina e idrossiprolina.
Presenta di una sequenza primaria ripetitiva: GLY-PRO-OHPRO-GLY

Y Un residuo ogni 3 deve giacere in prossimità del centro della tripla elica,
e può essere esclusivamente una glicina, perché qualsiasi altra catena
R sarebbe troppo ingombrante.

Y Legami idrogeno intercatena fra il gruppo R della glicina e il gruppo


ossidrilico sui residui di prolina.

Y Presenza atipica di prolina in maniera abbondante di norma


incompatibile con la struttura ad  elica. La prolina è presente sempre
all’esterno della triplice elica, sono residui rigidi, planari, idrofobici ed
essendo periodici danno insolubilità , rigidità e contribuiscono a dare un
andamento ordinato. Presenza di lisina, che forma i siti di attacco per i
polisaccaridi e permette anche la formazione di legami crociati.

Y Presenza di idrossiprolina e idrossilisina. In natura non esistono transfer


per le forme idrossilate perciò il processo avviene a proteina già
assemblata.
Vediamo come avviene:
Il precursore non idrossilato del collagene è detto procollagene, dove i
residui di prolina sono situati a due residui dalla glicina.
Questo è il substrato preferito dalla procollagene-prolina idrossilasi, un
enzima che necessita di un atomo di Fe ferroso , di acido ascorbico, O
molecolare, –chetoglutarato; che verrà ossidato a succinato e CO 2.

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L’ac. Ascorbico riduce l’O2 di cui un atomo è incorporato dal succinato e
l’altro nel gruppo ossidrilico dell’idrossiprolina.
Sono catalizzate da enzimi(vedi su) Prolil monossigenasi e Lisil
monossigenati entrambi metallenzimi che presentano come ione
metallico lo ione ferroso, se lo ione ferroso transita passa a ione ferrico,
l’ enzima non è più in grado di catalizzare la reazione. La necessita di
mantenere sempre ridotto lo ione viene realizzata dall’intervento dell’
acido ascorbico.
Una forte carenza di vitamina C (scorbuto) porta ad un’indebolimento
delle fibre collagene, diovuto alla mancata idrossilazione della prolina.

COO- COO-

O2 +
+ CO2

O=
COO-
COO-
HO
a-Chetoglutarato Succinato
\

Acido ascorbico
\ \
Fe2+
X N CNH X N CNH
/ \ / II Procollagene-prolina / \ / II
idrossilasi
-Glicina C O -Glicina C O
II II
O O
Segmento peptidico Segmento peptidico
del procollagene del collagene
contente
idrossiprolina
IDROSSILAZIONE ENZIMATICA DEI RESIDUI DI PROLINA DEL
PROCOLLAGENE DURANTE LA SINTESI DEL COLLAGENE.
Il destino dei due atomi della molecola di O è indicato in rosa. X è un qualsiasi
residuo amminoacidico.

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LA BIOGENESI DEL COLLAGENO
Le catene polipeptidiche che daranno origine al collageno sono sintetizzate
nel reticolo endoplasmatico rugoso dei fibroblasti sotto forma di un precursore
chiamato procollagene che va poi incontro ad una serie di modificazioni
postraduzionali. Le varie fasi sono:

 Sintesi delle catene pro a si forma questa catena pro  che contiene un
numero di residui ridondante rispetto alla catena matura. Questi aa si
trovano alle estremità e sono residui polari ricchi di cisteine, questo la
rende ancora + solubile e favorisce l’assemblaggio delle tre eliche.

 Monossigenazione In questa fase avviene l’idrossilazione dei residui di


prolina e lisina. In realtà l’H è già presente quindi viene aggiunto solo
l’O. Questa reazione avviene come spiegato sopra.

 Glicosilazione Un disaccaride formato da galattosio e glucosio è legato


alla 5-idrossilina. La funzione di tali carboidrati nella collageno è
sconosciuta.

 Assemblaggio in procollageno si organizza in una super elica che è il


procollagene. Caratteristica la presenza sull’ N terminale e sul C
terminale di catene che hanno un andamento globulare, dovuto alla
presenza di gruppi polari e residui di cisteina che creano un punto
d’inizio alla trascrizione dato dalla formazione di ponti disolfuro tra essi,
permettono il corretto allineamento delle tre catene e prevengono la
formazione prematura del tropocollageno e del collagene all’interno dei
fibroplasti

 Esocitosi il procollageno viene estromesso dalla cell per raggiungere la


localizzazione extracellulare una volta esocitato ci sono degli enzimi
idrolitici, pro-collageno peptidasi, che allontanano delle sequenze,
acquisisce idrofobicità. Vicino ai fibroblasti le varie unità di
tropocollageno si uniscono a formare le microfibrilla. Si formano legami
trasversali a livello delle eliche triple del tropocollageno e le microfibrilla
si uniscono a formare le fibre del collagene mature. In esse ogni
molecola di tropocollageno è spostata di un quarto della sua lunghezza
rispetto a quelle vicine, dunque si ha completa sovrapposizione solo
ogni 5 molecole. La distanza tra l’estremità C-terminale di una molecola
e quella N-terminale della molecola adiacente è di 32 nm e nell’osso è
riempita con un fosfato di calcio,l’idrossiapatite.

Per dare stabilità alla struttura intervene la formazione di legami covalenti


detti traversi, o crociati. Perchè ciò avvenga è necessaria una reazione a
carico dei residui di lisina che interessa il Ce della lisina.
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Questa reazione è catalizzata da un enzima, lisil-ossidasi, presente nella
regione extracellulare e prevede liberazione del gruppo amminco sottoforma
di ammoniaca (NH3 ) e di O molecolare (O2).Porta alla formazione di
ALLISINA un composto in cui il C della lisina diventa aldeidico.
O NH3 H
II I I
C—C—CH2—CH2—CH2—CH2—NH2 --CH2—CH2—CH2—C=O
Ia b g d e
NH O2
Lisil-ossidasi

LISINA ALLISINA

Questo composto ora può dare origine a una serie di reazioni. Ne esistono di
due tipi:
1. Una lisina o un idrossilina viene ossidata da lisinaossidasi diventando
allisina; reagisce poi per sottrazione di una molecola d’acqua con
un’altra lisina a formare una base di Schift che viene in seguito ridotta.
2. Reagiscono tra loro due allisine una in forma enolica e l’altra aldonica
per condensazione aldolica e sottrazione di una molecola d’acqua.

H H
I I
--CH2—CH2—CH2—C=O + --CH2—CH2—CH2—C=O

Allisina Allisina

H2O

H
I
--CH2—CH2—CH2—C=O=====C+—CH2—CH2—
I
C+
/ \\
H O

3. Condensazione aldolica di due allisine con sottrazione di una molecola


di H2O.

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La formazione di legami crociati continua per tutta la vita rendendo il
collagene sempre meno elastico e più fragile.

PATOBIOCHIMICA DEL COLLAGENO

CARENZA PATOLOGIA LOCALIZZAZIONE EREDITARIETA’


Sintesi di pro- Osteogenesi Intracellulare Ereditaria
 (I) imperfetta,
causa
deformazioni
scheletriche gravi
Sintesi di pro- Ehlers-Danlos Intracellulare Ereditaria
 (III) IV
Lisil-idrossilasi Ehlers-Danlos Intracellulare Ereditaria
VI
Prolil-idrossilasi Carenza di Intracellulare Acquisita
vitamina C
Procollagene- Ehlers-Danlos Extracellulare Ereditaria
peptidasi VII, dove il
collageno è
abbastanza
solubile
Lisil-ossidasi Latirismo prende Extracellulare Ereditaria ma
il nome da un anche acquisita
legume,potente
inibitore della lisil-
ossidasi
Lisil-ossidasi Latirismo dovuto Extracellulare Acquisita
a carenza di Cu,
perché è un
enzima con
metabolismo
contenente rame.
Legami trasversi Omocistinuria, Extracellulare Ereditaria
malattia degli
amminoacidi
Legami trasversi Penicillamina, Extracellulare Acquisita
un farmaco,
chelante che
contiene
omocisteina, un
composto che
coordina il Cu e
inibisce la lisil-
ossidasi

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Elastina

Si trova nei tessuti in cui sono richieste fibre elastiche da associare al


collagene, legamenti, vasi sanguigni…
L’elastina è ricca di glicina, alanina e valina, è flessibile e facilmente
estensibile. La sua conformazione è random, con basso grado di struttura
secondaria. Sono presenti molti legami trasversi tra le catene laterali di lisina,
dello stesso tipo chimico di quelli nel collageno ma organizzati in modo
diverso. Tre residui aldeidici dell’allisina reagiscono con il gruppo amminico
della lisina a formare un residuo detto desmosina. Poiché si associano 4
catene distinte bastano un piccolo numero di legami crociati a rendere
l’elastina una rete gommosa interconnessa.

STRUTTURA TERZIARIA

PROTEINE GLOBULARI
L’aspetto delle proteine con struttura terziaria è di tipo globulare. Queste
proteine sono dette così perché le loro catene polipeptidiche sono ripiegate in
strutture compatte.
La catena polipeptidica è spesso avvolta in uno dei tipi di struttura secondaria
( elica, foglietto  ), per rendere però queste strutture compatte le regioni
devono essere ripiegate l’una sull’altra. Questo ripiegamento è la struttura
terziaria della proteina, che conferisce alla molecola la forma tridimensionale.
ESPERIMENTO di C. A nfinsen:
prendiamo un enzima pancreatico la ribonucleasi, che ha un effetto idrolitico
sugli acidi nucleici.
Questo enzima è costituito da circa 100 residui, tra cui troviamo 8 cisteine,
che man mano che la proteina organizza la struttura globulare, formano 4
residui di cistina.

H3N H 3N
I I
H—C—CH2—SH + SH—CH2—C—H
I I
-
COO COO -
Cisteina Cisteina
H3N H3N
I I
H—C—CH2—S—-------S—CH2—C—H +2H+ +2e-
I ponte I
-
COO disolfuro COO-

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CISTINA
Il gruppo sulfidrilico (SH) delle due cisteine si ossidano e si forma il ponte
disolfuro con sottrazione di elettroni, dando origine alla cistina.
Facciamo fondere la nostra proteina in presenza di b mercapto etanolo.
Questo composto è un derivato dell’alcool etilico (CH 3—CH2—OH), ha
proprietà riducenti perché presenta legato al C  un gruppo SH.

CH—CH2OH b mercapto etanolo


I
SH

a) Se aggiungiamo alla ribonucleasi che sta denaturando il mercapto


etanolo, i residui di cistina saranno ridotti e quindi avremo una proteina
denaturata e ridotta che non ha più funzione biologica.
b) Facciamo raffreddare (riscaldata per farla denaturare) questa soluzione
in un tubo da dialisi che permette il passaggio solo a piccole molecole.
Quindi il mercapto etanolo esce, mentre la proteina raffredandosi
riforma i ponti disolfuro.
c) Facendo il dosaggio dell’attività dell’enzima troveremo che ha
riacquisito il 100% della sua attività.
Ciò significa che tra tutte le possibili strutture si è riformata nello stesso
modo, probabilisticamente ciò è impossibile. Questo ci fa capire che la
proteina ha intrinsecamente le informazioni per assumere la
conformazione nativa, nella sequenza primaria.

Oltre ai residui più o meno compatibili con le strutture particolarmente


importante per influenzare la formazione è L’EFFETTO IDROFOBICO.
La proteina presenta residui sia idrofilici che idrofobici, che danno alla
proteina una determinata conformazione a seconda dell’ambiente in cui si
trova. In ambiente acquoso le catene R idrofiliche staranno all’esterno,le
idrofobiche all’interno. Mentre le catene apolari rifuggono l’ambiente acquoso
e per questo tendono ad addossarsi tra loro dando origine al cosiddetto
legame idrofobico (in realtà non c’è il legame ma solo la tendenza a
addossarsi per rifuggire l’ambiente).
La struttura terziaria è ulteriormente stabilizzata da:
G Effetto idrofobico è realizzato dove ci sono 2 residui di fenilalanina,
assolutamente idrofobici, o quando ci sono gruppi metilici.
G Legami idrogeno ad esempio tra una fenilalanina e un gruppo acido.
G Attrazione ionica legami tra cariche opposte dei residui che vengono a
confrontarsi a distanza compatibile
G Legami covalenti nelle proteine semplici, perché nelle proteine
coniugate intervengono ulteriori legami tra la proteina e l’entità non
proteica.

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Metodologie per la ricostruzione delle mappe delle proteine.

 RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE si basa sull’iterazione tra


campo magnetico esterno e qualità magnetiche dei nuclei. Il protone è il
nucleo più seguito. Quando si espone una proteina ad un campo
magnetico esterno i nuclei si orientano e visto che il comportamento dei
protoni dipende dal gruppo a cui il protone appartiene, si ottine una
mappatura degli atomi di H.
 CRISTALLOGRAFIA A RAGGI X per questa metodica è necessario fare
il cristallo della proteina.
Per fare il cristallo si prende una proteina solubile e la si fa precipitare
aggiungendo un sale: il solfato di ammonio. Questo processo è detto di
salting-out. Successivamente alla salificazione la proteina precipita
perché il sale ha tolto alla proteina l’H 2O di idratazione, che la
manteneva in funzione.
In laboratorio si lasciano in frigorifero la proteina e il sale per 24/48 ore,
ottenendo il cristallo.
I cristalli sono investiti da raggi X che hanno lunghezze d’onda dello
stesso ordine delle distanze atomiche e interagiscono con gli elettroni
dando mappature, che vengono rielaborate da comlessi processi
matematici dando una distribuzione atomica.

Patologie connesse ad una non corretta struttura terziaria


delle proteine.

Malattia di Alzheimer una sindrome neurologica caratterizzate da vari


fenomeni fra cui la produzione abbondante di proteina amiloide. Questa
proteina è processata da un precursore in quantità normale. In questa
patologia la proteina amiloide è prodotta in eccesso e probabilmente a causa
di mutazioni con struttura terziaria alterata. Questo fa sì che la proteina
precipiti, e questo induce la cellula a non riconoscerla inducendone un
ulteriore produzione. Si formano anche le tipiche placche amiloidi.

Malattia di Kreuzfeld-Jacob (BSE, SCRAPI) dovuta al non corretto


raggiungimento della struttura terziaria dei prioni. Questi precipitano e viene
indotta ulteriore produzione che precipiterà ugualmente. E’ infettiva perché i
prioni al contrario delle altre proteine sono resistenti alle proteasi intestinali
per questo non vengono degradati. Vengono perciò assorbite dal sistema
linfatico, vanno in circolo e risalgono attraverso i vasi linfatici al SNC. Questi
prioni errati formano dei dimeri coi prioni sani causando una malformazione
confomazionale che si autoalimenta.

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STRUTTURA QUATERNARIA

EMOGLOBINA
Questa proteina può essere studiata come modello delle strutture
quaternarie. Se ne conoscono circa 200 varianti. Per meglio comprendere
questa proteina è necessario studiare una proteina molto simile la
mioglobina.
Sono simili perché:
l’omologia di sequenza (stesso residuo nella stessa posizione) è pari al
50%;
il singolo monomero della mioglobina è molto simile a quelli che
costituiscono l’emoglobina;
entrambe presentano il gruppo eme, sono emoproteine (non sono le
uniche);
entrambe hanno andamento secondario ad elica, tranne nei gomiti
dove viene perduta la struttura secondaria per consentire il formarsi
della struttura globulare. Circa il 70% ha struttura ad  elica e il 30% a
tratti random. Ci sono 8 segmenti ad  elica (denominati con le lettere
maiuscole dell’alfabeto), articolati in 7 gomiti (denominati con le lettere
minuscole dell’alfabeto).
Le differenze sono:
l’emoglobina ha raggiunto un livello strutturale quaternario mentre
la mioglobina solo terziario, pur avendo analoga struttura terziaria.

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L’emoglobina è un tetramero formato da 4 monomeri denominati
 questi sono a due a due uguali. Gli  sono costituiti da 141
residui, i  da 146.
La mioglobina ha 153 residui, dove per convenzione il residuo 1 è l’ N-
terminale e il 153 il C-terminale.
Esiste una via biosintetica che conduce al gruppo eme, la via biosintetica
delle porfirine. Partendo dalla porfirina IX, caratterizzata, come tutte le
porfirine da una struttura di base composta da un anello tetrapirrolico ciclico.
Ogni pirrolo presenta un N e 4 C, sono collegati dai CH.
Dalla porfirina IX si passa alla protoporfirina IX.

Protoporfirina + Fe2+ -------------> Eme + 2 H+

1
2

4
3

18
Nella protoporfirina XI sono presenti 3 tipi di catene laterali:
1. un gruppo metilico CH3 (metile);
2. un gruppo a 2 atomi di carbonio, CH=CH2 (vinile);
3. un gruppo a tre atomi di carbonio, CH2—CH2—COO- (residuo di acido
propionico, un proprionile).

Nell’anello 1 abbiamo una catena corta CH3 (metile) e una lunga


CH=CH2 (vinile);

Nell’anello 2 uguale all’ 1;

Nell’ anello 3 abbiamo catena corta CH3 (metile) e la catena lunga è


sostituito da un proponile CH2—CH2—COO-;

Nell’ anello 4 troviamo rima la catena corta CH2—CH2—COO-


(rappresentata dal proponile) e una corta CH3 (metile). Esiste una serie
di porfirine in cui non è avvenuta l’ inversione, sono patologiche dette
porfirine della serie 1, le altre in cui è avvenute l’inversione sono della
serie 3.

La protoporfirina IX diventa Fe- protoporfirina IX (gruppo EME), solo


quando si lega ad uno ione di Fe.

19
☻ Il Fe si presenta in forma di ossidazione ferrosa, Fe 2+, legato al centro
del gruppo eme tramite legami dativi tra Fe (elemento che dispone di
doppietti elettronici) e N (elemento che presenta orbitali vuoti).

☻ Al mantenimento in sede del Fe contribuiscono legami ionici, infatti


guardando la struttura della protoporfirina IX ci dovrebbero essere 2 NH
per rendere l’N trivalente , nell’ emoglobina questi NH sono N -. Le
cariche negative controbilanciano i 2 protoni del Fe 2+.

☻ Ma il ferro non è legato solo dai legami di coordinazione con l’N detti
planari, ma realizza legami ortogonali alla struttura dell’eme ( legami
assiali). I legami assiali si realizzano con il residuo di istidina in
F8. L’istidina è un amminoacido basico che presenta nel residuo R un
anello imidazolico, che al suo interno contienine un N con un doppietto
libero che permette il legame.

☻ Quando la proteina si presenta in forma ossigenata, questo costituisce


il sesto legame di coordinazione, dalla parte opposta del legame con
l’His F8.
Quindi l’emoglobina in forma esagerata presenta il Fe in forma di esa-
coordinazione (4 legami con l’N planari, 2 assiali).

20
Se prendessimo il gruppo eme e lo tirassimo fuori dalla proteina il Fe passa
in forma ossidata, diventa ione ferrico (Fe3+), perdendo un elettrone.

Fe2+ + O2 → Fe3+ + O2-


Questo porta a due situazioni estremamente deleterie:
1) Il Fe è capace di legare l’O solo se è in forma ferrosa, in forma ferrica
non è più funzionale. All’interno del gruppo eme si crea un eccesso di
carica positiva che lega con molta più affinità uno ione carico
negativamente, OH-. Ciò porta ad una forma ossidata di mioglobina o di
emoglobina detta metaemoglobina (non funzionante).

2) Si crea una particolare forma di O, la O2- , ione superossido, che rientra


nelle specie reattive dell’O (ROS), i radicali liberi (che vengono sempre
prodotti ma con minor probabilità).

Perché quando si lega l’O 2 nella proteina nativa, dando ossigenazione, non
c’è sottrazione di elettroni cioè ossidazione (che rende non funzionante la
proteina), come accade nel gruppo eme enucleato?

L’O viaggia sempre disciolto nell’acqua, secondo diverse


concentrazioni( pressione parziale). Per legarsi deve attraversare la parte
interna della proteina che è quasi completamente idrofobia, quindi arriva poca
acqua e poco O. L’O che arriva è in quantità tale da produrre ossigenazione
ma non ossidazione. L’acqua riesce a entrare in piccola quantità grazie a una
breccia nel fronte apolare causata da due residui.
Un residuo è F8-His-93 che è lo stesso residuo che forma il primo legame
assiale con il Fe, l’altro residuo è E7-His-64 che non crea un legame assiale
con il Fe ma un legame H quando l’O si è già legato al Fe.

21
FUNZIONE DI MIOGLOBINA ED EMOGLOBINA
Nel mitocondrio si svolgono le ossidazioni biologiche, reazioni dove l’O
molecolare reagisce con una serie di substrati ridotti SH 2

½ O2 + SH2 → S + H2O
S si ossida e l’ossigeno si riduce, dando origine ad acqua, l’O è usato come
carburante e SH2 come combustibile, avviene combustione e si sviluppa
energia.
L’O per arrivare al mitocondrio compie un viaggio.
Parte dall’ ambiente esterno dove è presente a una concentrazione del
20%, quindi la pressione parziale dell’ossigeno nell’atmosfera sarà di
152 mmHg (20 X 760 mmHg).

Mentre arriva agli alveoli polmonari diminuisce la pressione parziale, a


livello alveolare è di 100mmHg. L’ossigeno diffonde. Passa
nell’eritrocita e si lega all’emoglobina (ossiemoglobina). Ogni gruppo
eme può legare una molecola di O quindi ogni eritrocita lega 4 molecole
di O. Per saturare completamente l’emoglobina è sufficiente una
pressione di 100mmHg.

Percorre la circolazione arteriosa per raggiungere i tessuti, a livello dei


capillari c’è lo scambio dei gas. La pO 2 qui varia da tessuto a tessuto
ma è circa 20-40 mmHg. Se la pO2 diminuisce sollecita il rilascio dell’
ossigeno dall’emoglobina.

22
Dall’interstizio passa per diffusione nel citosol dove c’è una pressione di
10mmHg.

Sempre per diffusione passa nella matrice mitocondriale dove la pO2 è


di 1mmHg, qui verrà utilizzato.

L’emoglobina ora è deossigenata e ritornata ai polmoni è pronta ad una


nuova ossigenazione.

La mioglobina, nei mitocondri quando arriva l’ossigeno va incontro a questa


reazione:

Mb + O2 <====> MbO2

Da mioglobina e ossigeno otteniamo la mioglobina ossigenata.


La quantità di ossigeno che si legherà dipende dalla pressione parziale
dell’ossigeno e dall’affinità della mioglobina nei suoi confronti. Grazie a questi
parametri si può estrapolare una curva di dissociazione che ci permette di
vedere il grado di saturazione della mioglobina.
La curva che otterremo è di tipo iperbolico, quando essa raggiunge la
saturazione significa che tutti i gruppi eme hanno legato una molecola di
ossigeno. Si osserva il valore della p50, cioè la pressione parziale a cui la
proteina è al 50% ossigenata.

La p50 della
mioglobina è di circa
2,8mmHg.

Se la mioglobina si
confronta con O alla
pressione parziale di
2,8mmHg si saturerà al
50%.

Sapendo che nel citosol la pO 2 è di 10mmHg, nella cellula muscolare la


mioglobina trovandosi a questa pressione sarà quasi completamente
ossigenta. Nel momento in cui la cellula muscolare debba far fronte ad una
23
immediata e vigorosa attività fisica, il mitocondrio opererà più velocemente, e
preleverà più ossigeno dal citosol, ma essendo un passaggio per diffusione la
pressione parziale scenderà. Questo abbassamento di pressione farà
rilasciare l’ossigeno. Ad esempio se la pressione scende a 4mmHg
l’emoglobina sarà saturata al 65% e il restante 35% sarà rilasciato.
La mioglobina ha dunque delle caratteristiche che la rendono una
proteina di deposito.

Questa reazione si può analizzare attraverso la costante di dissociazione


(Kdis):
[Mb] [O2]
Kdis = ——––——
[Mb ∙ O2]

la costante di dissociazione è il reciproco della costante di associazione (K ass)


K= [MbO2] / [Mb] [O2]
Più basso è il valore della costante di dissociazione, più alta è l’affinità tra la
proteina e il ligante. Più alto è il valore della costante di associazione più è
elevata l’affinità.
La costante di dissociazione è usata per conoscere il valore frazionario della
percentuale di saturazione (Y).

Siti occupati
Y= ——––————––
Siti totali

Il valore massimo di questo rapporto è 1, quando il valore del numeratore è


uguale al denominatore e quindi tutti i siti deel’eme sono occupati.
Il valore minino è 0 quando il numeratore è uguale a 0.
Y dipende:
direttamente dalla pressione parziale di ossigeno (+ aumenta + cresce
la probabilità di saturare i vari siti) pO2;
inversamente dalla costante di dissociazione + pO2 , Kdis + pO2.

pO2
Y= ——––———
Kdis + pO2
Questa è l’equazione di un iperbole equilatera in cui le variabili sono Y e la
pO2. Costruiamo un grafico in cui poniamo la variabile dipendente sulle
ascisse (pO2) e la variabile indipendente sulle ordinate (Y).

24
Y

0
pO2

FUNZIONE DI TRASPORTO DELL’EMOGLOBINA

L’emoglobina con l’ossigeno va incontro ad una reazione reversibile:

Hb + 4O2 ⇄ Hb ∙ 4O2

In realtà le quattro molecole di ossigeno non vengono legate tutte


contemporaneamente, va ricordato anche che i quattro monomeri
dell’emoglobina non sono tra loro indipendenti, e che l’emoglobina non funge
da deposito come la mioglobina ma come trasportatore.

Per essere un buon trasportatore deve:


✏ essere in grado di trasportare molta merce;
✏ essere in grado di liberare la merce giunto a destinazione.

Se l’emoglobina si comportasse come la mioglobina avremmo questa


situazione:
A livello polmonare l’eritrocita incontra una pO2 prossima ai 100mmHg,
l’emoglobina (con curva di dissociazione uguale alla mioglobina) sarebbe
sicuramente saturata.
Nei capillari con una pO2 tra i 20 e i 40 mmHg, l’equilibrio della reazione si
sposta a sinistra ma in realtà non ci sarebbe dissociazione perché il valore di
Y non sarebbe cambiato.
Quindi se l’emoglobina si comportasse come la mioglobina sarebbe un
trasportatore molto scarso.
In realtà la curva di dissociazione dell’emoglobina non ha andamento
iperbolico come la mioglobina, ma ha un andamento sigmoideo.

25
Confronto delle cinetiche di
legame dell'ossigeno di
mioglobina e emoglobina.
Per saturazione relativa si
intende la frazione di siti totali che
lega l'ossigeno; P50 è la pressione
parziale di ossigeno (pO2)
necessaria per ottenere la
semisaturazione, ovvero il 50%
dei siti totali legati all'ossigeno.

Quindi in realtà l’emoglobina:

A livello polmonare l’emoglobina si satura al 100% (Y= prossima 1);


Nei capillari dove la pO2 è in media di 30mmHg, il valore di Y scende a 0,5.
La metà dei siti libererà ossigeno.
In un tessuto più attivo metabolicamente ( cervello,cuore, muscolo
scheletrico…), che consuma più rapidamente ossigeno, la nei capillari sarà
di 20mmHg e il valore di Y scende a 0,3, il 70% dei siti cederà ossigeno.
L’andamento sigmoideo è il risultato tra la struttura dell’emoglobina e
l’ambiente in cui opera.
L’emoglobina si trasforma da una molecola ad alta affinità per l’O negli alveoli
ad una a bassa nei capillari. Per permettere ciò si verifica un cambio
conformazionale della proteina. Le proteine quaternarie modulano la loro
funzione in risposta a variazioni strutturali.

La pO2 dell’emoglobina è pari a 26mmHg.


La mioglobina è molto più affine dell’emoglobina all’ossigeno. Per questo
l’ossigeno che viene rilasciato dall’emoglobina viene preso dalla mioglobina
che ha più affinità, e quando questa l’avrà ceduto lo prenderanno le proteine
mitocondriali ad affinità ancora maggiore.

26
I 4 monomeri dell’emoglobina nelle fasi di sviluppo

Nella vita di un individuo l’emoglobina non è la stessa. Distinguiamo una vita


embrionale, fetale, adulta.

EMOGLOBINA NELLE VARIE FASI DI SVILUPPO

VITA z2 e2 z2 a2 a2 e2
EMBRIONALE GOWER I PORTLAND GOWER II

VITA FETALE a2 g2 a2 b2
Hb F (fetale)
98%
Hb A (adulta)
1-2 %

VITA ADULTA a2 b2 a2 g2 a2 d2
Hb A (adulta)
97-98% Hb F (fetale) Hb A2
1,5 % 2-3 %

L’emoglobina è un tetramero già nella vita embrionale, dove è costituito da 2


catene di tipo  , le catene  sono di tipo  .
Nella vita fetale il gene delle catene  viene disattivato e viene attivato il gene
delle catene  . Alle catene  si associano delle catene di tipo non  , catene
 . Quindi troveremo un tetramero composto da per il 98% da 2 catene  e 2 
e il restante da emoglobina adulta (2 catene  e 2 catene  ).
Al momento della nascita ci sarà un 50% di emoglobina fetale e 50% di
emoglobina adulta.

27
Gia 4 mesi dopo la nascita troviamo l’emoglobina che troviamo in un
individuo adulto, cioè composta 97% da emoglobina adulta, un 1% che
rappresenta un retaggio dell’emoglobina fetale, e un 2% di un nuovo tipo di
emoglobina di tipo  2 2.

L’emoglobina fetale ha una funzione specifica. Il feto prende l’ossigeno


attraverso la circolazione materna, strappandolo all’emoglobina materna,
questo richiede che l’emoglobina fetale abbia un affinità più alta di quella
materna per l’O. Se quest’ emoglobina persistesse nella vita adulta creerebbe
problemi perché sarebbe riluttante a cedere O a livello capillare.

Va ricordato che esistono circa 200 varianti di emoglobina adulta.

Cambiamento conformazionale dell’emoglobina.


Il cambiamento conformazionale che garantisce all’emoglobina lo
svolgimento della sua funzione di trasportatore deve essere indotto da
qualcosa: il valore di pressione parziale dell’O.

Una prova che ci dimostra che va incontro a cambi conformazionali è


realizzata coi cristalli di emoglobina.
1) Si fanno scoppiare gli eritrociti in una soluzione ipotonica, liberando
l’emoglobina;
2) Si centrifuga;
3) Quello che resta delle membrane cell.(fantasmi) precipita, l’emoglobina
rimane in soluzione;
4) Si tratta con Sali, solfato di ammonio;
5) Si mette in frigorifero per 24-48 ore e si formano i cristalli di
emoglobina.
Se realizziamo questi in assenza di ossigeno vedremo che una volta esposti
all’O i cristalli si frantumeranno proprio in seguito al cambio conformazionale
da deossiemoglobina a ossiemoglobina.

Una molecola di emoglobina proveniente dai tessuti che ritorna a livello


polmonare si trova in una conformazione a bassa affinità, ma la pressione
parziale è così elevata che induce il primo gruppo eme a legarsi.
Questa è la tappa limitante dell’ossigenzione, la più lenta. Fa partire l’effetto
cooperativo che c’è fra i vari gruppi eme, il secondo gruppo eme sarà più
accessibile e così la terza e la quarta molecola.
Questo è la cooperatività positiva di legame.
Le reazioni che avvengono nell’emoglobina per legare O sono in realtà 4
ognuna con la sua costante di dissociazione e vediamo che man mano
diminuisce aumentando così l’affinità per l’O.

28
Il processo inverso avviene a livello dei tessuti.
Questo spiega anche l’andamento sigmoideo della curva di saturazione.

La conformazione a bassa affinità è detta CONFORMAZIONE T.

La conformazione della proteina si riferisce sia a livello quaternario (iterazioni


tra i monomeri) che a livello terziario (spostamenti di  eliche).

FORMA T ⇨ bassa affinità per l’O2


⇨ DeossiHb

DEOSSI, CONFORMAZIONE T
La conformazione ad alta affinità è detta CONFORMAZIONE R.

FORMA R ⇨ alta affinità per l’O2


⇨ OssiHb

OSSI, CONFORMAZIONE R

29
La forma T è detta così per l’aggettivo inglese tight=tesa, dando l’idea di una
proteina difficilmente accessibile all’O, tanto che se se quando assume
questa forma l’O è ancora legato viene escluso.
Consiste in una struttura dove oltre alle forme di coesione, tra i 4 monomeri ci
sono ponti salini (legami ionici).
I legami ionici sono 8 e sono simmetrici, possono essere intracatena e
intercatena.

NH3+ Asp His COO-


94 146

COO- Arg Asp Lys NH3+


141 126 40

NH3+ Lys Asp Arg COO-


40 126 141

COO- His Asp NH 3+


146 94

INTRACATENA ad es. nelle catene  l’Asp 94 carico negativamente con


l’His 146, l’ultimo amminoacido e che quindi ha ‘ultimo COOH libero.
INTERCATENA ad es. l’His 146 (catena  ) con il gruppo COO- con la Lys 40
(catena  ), ciò accade anche nell’altro dimero  – .
Tra le due catene a ci sono 2 coppie di ponti salini. Tra N terminale e C
terminale dell’altra e tra Arg 141 e Asp 126.

Questi legami stabilizzano la forma T, in questa forma l’O 2 è difficilmente


accessibile ad uno dei 4 gruppi eme, perché:

Il piano dell’eme nella forma T è un po’ concavo.

Il Fe legato all’His F8 non si trova al centro del gruppo eme ma lo


sovrasta di 0,6 A°.
Questo accade per un impedimento sterico realizzato da residui, fra cui il più
significativo è la Valina dell’ansa FG.
30
Va ricordato che il Fe ha n°atomico 26, rientra negli elementi di transizione
(che hanno orbitali incompleti, con elettroni spaiati ed orbitali liberi)

Fe ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
↓ ↓
3d
4s 4p

Quando diventa ione ferroso, vengono perduti 2 e- dell’orbitale 4s, quindi


rimangono vuoti 4s 4p 5s che possono ospitare i 4 N pirrolici e l’ His F8.
Il Fe diventa pentacordinato. Il Fe2+ non si trova sul piano dell’eme, grazie al
fatto che gli e- dell’orbitale si trovano ad alto spin (ospitano il maggior numero
di orbitali liberi). Le dimensioni dello ione e l’impedimento dell’ansa FG non lo
rendono in grado di trovarsi al centro dell’eme.

Fe2+ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
Alto ↓
spin

3d 4s 4p

Quando a livello polmonare grazie all’elevata pO 2 si inizia a legare la prima


molecola di O causa una transizione di spin, perché alla forza di repulsione
interelettronica che prima portava a un alto spin si contrappone la forza di
campo del legante. Si passa dunque da alto spin a basso spin, per cui il
diametro atomico del Fe si riduce e riesce a posizionarsi al centro dell’eme.

Fe2+ ↑ ↑ ↑
Basso ↓ ↓ ↓
spin

31
Il legame di coordinazione tra His F8 (istidina prossimale) e ione ferroso non
è perpendicolare al piano dell' anello tetrapirrolico, ma è inclinato di circa 8°.

Quando l' ossigeno instaura il sesto legame di coordinazione trascina lo


ione Fe(II) nel piano della protoporfirina IX, causandone l' appiattimento.

La repulsione tra l' eme ed uno degli idrogeni dell' anello imidazolico
dell' istidina F8 da una parte, e quella con il residuo di valina FG5
provoca uno spostamento di His F8 che rende perpendicolare al piano
dell' eme il quinto legame di coordinazione.

Il riallineamento di His F8 trascina con sè l' elica F e il gomito FG


provocando la rottura dei ponti idrogeno e legami salini tra il C terminale
di una sottounità b e l' elica C della sottounità a appartenente all' altro
dimero.

In questo modo lo spazio tra elica F e G non è più sufficiente per


ospitare un residuo di Tyr che si posizionerà all’esterno.
all’esterno

Questo accade quando la prima molecola di O si lega all’eme. Poiché i


4 monomeri cooperano, si rompono anche i ponti salini degli altri
monomeri.

La progressiva perdita di ponti salini è accompagnata al processo di


ossigenazione reso sempre più facile.

Alla fine otteniamo la proteina nella forma R dove non ci sono più ponti
salini e ha acquisito la massima affinità all’O.

Quando a livello dei tessuti viene rilasciata la prima molecola di O, il Fe


torna ad alto spin, e si allontana dal centro dell’eme.
Il segmento F si ritira, si crea l’ansa, inizia la formazione dei ponti salini fino a
passare a bassa affinità per l’O.

32
In termini di cristallo è evidente l’allontanamento tra i due monomeri  tra loro
di 7-8 A°, quando passa nella forma T.
Il cambio di conformazione oltre che la concentrazione dei reagenti permette
maggiore liberazione e acquisizione di O.

Modulazione del processo di ossigenazione e


deossigenazione
Un tessuto attivo metabolicamente consuma O e produce composti ultimi del
metabolismo. Se è un tessuto aerobio (cuore, cervello) un nutriente viene
bruciato con l’O2, producendo H2O e CO2. Se un tessuto è occasionalmente
anaerobio (muscolare), produce anche acido lattico.
Un tessuto più lavora più produce composti acidi, CO 2, calore.
Nei tessuti dove l’Hb arriva si produce CO 2, abbassamento del pH,
innalzamento di temperatura.
Ci aspettiamo di vedere che questa situazione sposti l’equilibrio verso la
forma T.
PCO2
Y
10mmHg
20mmHg
40mmHg

0,4

0,25

15 30 45 60 PO2
L’Hb quando arriva nel capillare trova un pCO 2 =20mmHg, Y=0,4, cioè il 60%
dei siti ha ceduto l’ O2.
33
Nella curva con pCO2 =40 mmHg, Y=0,25, il 75% dei siti ha ceduto l’ O 2.
Se quindi la pCO2 =40 mmHg la curva si sposta a destra, mentre se la la
pCO2 =10mmHg si sposta a sx.
Maggiore è la produzione di CO2 maggiore è la tendenza a liberare O2.

Con lo stesso schema sperimentale possiamo vedere l’influenza del pH.


Man mano che il pH diminuisce l a curva si sposta verso destra, facilitando il
rilascio di ossigeno, diminuisce il valore di Y.
L’effetto di CO2 e del pH va visto sempre in termini di equilibrio R—T.
La CO2 agisce in 2 modi:

1) La CO può reagire con gruppi amminici terminali non coinvolti nei ponti
salini:
〰NH3+ + CO2 〰N—COO- + H+
I
H

E’ una carbamminazione che provoca liberazione di H+.


Quando la CO2 si lega all’Hb non si lega al gruppo eme ma ai gruppi
amminici terminali, formando una carboamminoHb.
Introduce così 2 cariche negative nell’Hb realizzando ulteriori ponti
salini.
Ogni volta che la CO2 si lega all’Hb sposta l’equilibrio verso la forma T,
introducendo nuovi ponti salini, inoltre si libera H + e si abbassa quindi il
pH.

2) CO2 + H2O → H2 CO3 → H CO3-


H+

Questa reazione può avvenire nel plasma e negli eritrociti.


Per cui maggiore è la CO2 maggiore è l’acidità, maggiore
l’abbassamento di pH.
Questo abbassamento di pH è L’EFFETTO BOHR.

Questo effetto può essere sintetizzato con una reazione:

si forma emoglobina protonata e si libera ossigeno molecolare e a livello dei


tessuti si versano nel sangue i composti acidi prodotti, determinando un
ambiente più acido.

34
L’effetto dell’acidità è facilitare dissociazione di ossigeno, perché più basso è
il pH più alta è la probabilità che si formino ponti salini.

In questo diagramma
rappresenta la curva di
dissociazione dell’Hb e il
valore della pO2 a livello
dei polmoni, in dipendenza
dal pH. Da notare che c’è
sempre una saturazione
quasi totale.

Per formare un ponte salino occorre che le coppie ioniche siano


contrapposte, ravvicinate ad una distanza favorevole e con gruppi di cariche
opposte. Le cariche + o – sono in funzione del pH che regola il grado di
protonazione e deprotonazione. Va ricordato che l regole della dissociazione
valgono solo in ambiente acquoso, quindi in ambiente idrofobico possono o
no comportarsi in quel modo.
Nello strato Deossi l'istidina forma un ponte salino con Asp94 se l'anello
dell'Istidina è protonato. Questo stabilizza la forma protonata dell'Istidina
causando un pKa elevato nello stato deossi. Il ponte salino non si forma nello
stato ossiemoglobina. Quindi la protonazione della His146 favorisce la
conformazione deossi.
Se una molecola di Hb inizia la fase di deossigenazione questa va sempre a
termine, allo steso modo se c’è una molecola che non inizia il processo ,
ritorna ai polmoni in forma ossigenata.
Quando l’O viene rilasciato c’è una ricompattazione dei gruppi che si erano
rilasciati , ma per renderli attivi nei confronti dei ponti salini devono essere
protonati. La protoonazione è in funzione del pH, più basso è il pH a livello
tissutale, maggiore è la probabilità che vengano protonati.
La reazione avviene comunque ma quanto più basso è il pH, tanto è più
probabile il passaggio di molecole di molecole di Hb dalla forma R a quella T
(EFFETTO BOHR).
L’effetto Bohr costituisce un sistema isoprotico (i protoni non si muovono) di
neutralizzazione del pH.

35
Agisce come una sorta di sistema tampone, l’acidità prodotta a livello
tissutale viene neutralizzata quando l’Hb in fase di deossigenazione lega gli
H+, importanti a livello polmonare in fase di ossigenazione.

LIVELLO TISSUTALE (40mmHg)

CO2

Anidrasi
carbonica
CO2 H2CO3 HCO3
Cl-
H+

O2 + HbH+ HbO2
H+

O2 + HbCOO- HbO2

CO2

I tessuti a livello cellulare producono sempre CO 2 assumendo sempre


ossigeno.
Tra la pCO2 mitocondriale e la pCO2 capillare c’è un ampio gradiente
pressorio per cui la CO2 presente può diffondere liberamente in distretti dove
c’è più bassa pressione parziale.
Quindi la CO2 prodotta nei tessuti tende a passare nell’eritrocita (il
riquadro).
Nel plasma c’è una scarsa capacità di far reagire CO2 e H2O per
formare H2CO3( ac. Carbonico).
Nell’eritrocita questa capacità è amplificata dall’enzima anidrasi
carbonica.

L’ acido carbonico è un acido debole e si dissocia in bicarbonato e


H+.

Il protone rilasciato favorisce la protonazione dell’Hb e quindi


l’acquisizione della forma T e il rilascio dell’O.

L’anidride carbonica attraverso la carbamilazione con l’Hb


ossigenata forma carbo-amin-Hb, che è più suscettibile alla
formazione di ponti salini e libera O.

36
Il bicarbonato prima prodotto non serve all’eritrocita ma è molto
utile nel plasma dove costituisce il principale sistema tampone.
All’equilibrio la concentrazione del bicarbonato nel plasma è pari a
25mM, la concentrazione dell’acido carbonico è 1,25 mM. Attraverso
questi dati è possibile ricavare il pH, con la formula di Henderson e
Hasselbalch.
pH = pK + lg [ SALE ] ⇒ =6,1 + lg20 =6,1+1,3= 7,4
[ACIDO]
Il bicarbonato formato fuoriesce dall’eritrocita grazie allo scambio con lo
ione Cl-. Uno scambio elettroneutro, realizzato da una particolare
proteina di membrana, chiamata canale per gli anioni.

LIVELLO POLMONARE (100 mmHg)

O2

HbH+ + O2 HbO2
H+
H2O

CO2 H2CO3 HCO3-


Cl -

CO2 + HbO2 O2 + HbCOO-

Carbamilazione

✿ A livello polmonare l’ O entra nell’eritrocita a causa del gradiente di


pressione parziale.

✿ L’ Hb deossigenata e protonata inizia il processo di ossigenazione


con la reazione di deprotonazione (effetto Bohr).
✿ L’ O causa il cambiamento conformazionale,
conformazionale c’è variazione di pK, i
gruppi diventano più acidi, si ha rilascio di protoni.

✿ I protoni rilasciati inducono la reazione opposta a quella dei tessuti,


reagiscono col bicarbonato, formando l’acido carbonico.

37
✿ L’acido carbonico catalizzata dall’anidrasi carbonica viene scissa
in C2O e H2O. La CO2 viene poi eliminata dai polmoni.

✿ Va ricordato che la CO2 viene continuamente sottratta dalla ventilazione


polmonare, e gli H+ vengono continuamente immessi spostando
l’equilibrio della reazione da dx a sx.

✿ Gli H+ scomparsi a livello dei tessuti sono stati neutralizzati,


portati dall’Hb ed eliminati come anidride carbonica dalla
ventilazione polmonare.

✿ La carbossi-Hb reagendo con l’O libera anidride carbonica e l’Hb si


trova in forma ossidata. La CO2 che viaggia sottoforma di carbossi-Hb è
il 17-20% il resto viaggia come bicarbonato.

2-3 Bifosfoglicerato (2-3 BDG)


Prima quando si teneva in una sacca non deteriorata del sangue, questo si
mostrava come se l’Hb fosse poco suscettibile alla deossigenazione, non
completamente capace di rilasciare O. Dopo numerose ricerche si scoprì
l’esistenza di una molecola negli eritrociti.

E’ un derivato fosforilato dell’acido glicerico,


presenta in posizione 2 e 3 dell’acido glicemico
gruppi alcolici esterificati da gruppi fosfato.
Questo composto viene prodotto (negli eritrociti
nella glicolisi) da un precursore che è l’acido 1,3
difosfoglicerico.

La contrazione di questo composto all’equilibrio è di 5mM, a questa


concentrazione esercita un azione che favorisce il rilascio dell’O dall’ Hb.
Nelle sacche accadeva che veniva meno in una certa misura la capacità di
cedere l’O perché durante la lunga conservazione il glucosio (precursore) si
esauriva e quindi si esauriva anche il BFG.

pH 7,4
fisiologico

38
T° 37°

PCO2 40 mmHg

BPG 5 mM

Va ricordato che quando variano le condizioni standard c’è uno spostamneto


della curva di dissociazione dell’Hb.

In assenza di BPG la curva si


sposta a sinistra e la proteina
continua ad avere alta affinità per
l’O. A valori elevati di BPG la
curva si sposta a sinistra,
favorendo la dissociazione.

39
Durante la reazione di deossigenazione, mentre si formano i ponti salini ,
l’effetto maggiore è l’allontanamento delle catene  . Nella tasca che si
forma si inserisce la molecola di BPG. Il BPG è una molecola con 5 cariche
negative, il sito occupa è caratterizzato dalla presenza di cariche positive,
creando nuove coppie ioniche, stabilizzando ulteriormente la forma T.

Ricordando l’Hb fetale:

L' emoglobina fetale HbF ( 2 2) è in grado di sottrarre O2 all'emoglobina


adulta (HbA). Ciò avviene perche l' emoglobina fetale non possedendo
catene (rimpiazzate dalle gamma) non lega il 2,3-BPG e quindi ha un'
affinità per l' ossigeno superiore a quella dell' HbA.

Il fenomeno dell' adattamento alle alte quote ( ovvero a respirare un' aria a
più basso contenuto di O2) è legato in parte ad una aumentata sintesi di
emoglobina, nonchè all' aumento della concentrazione del 2,3-BPG.

ASPETTI ANOMALI DELL’ Hb E DELLA SUA


REAZIONE
Gli aspetti anomali dell’Hb si possono classificare in 4 livelli:

❦ Anomalie da liganti: il ligante principale è l’O ma ce ne possono essere


diversi come il monossido di carbonio.
❦ Anomalie derivanti da configurazione quaternaria: dovute ad un diverso
assemblaggio dell’emoglobina, pur rimanendo sempre un tetramero.
❦ Anomalie riguardanti al struttura primaria: dovute a mutazioni puntiformi
dei geni che codificano per le catene alfa e beta.
❦ Anomalie riguardanti lo stato di ossidazione del ferro.

Anomalie da liganti
Monossido di carbonio (CO):

E’ un gas presente nell’atmosfera a bassa pressione, tranne in rare condizioni


in cui il CO prodotto dalle combustioni si trova a pressioni più alte. E’ un gas
tossico, la tossicità è rappresentata quando si lega al gruppo eme delle
emoproteine. Si lega al gruppo eme quando il Fe si trova in forma ridotta
(ione ferroso), come fa l’O.

Questo crea competizione tra i due gas. L’esito della competizione dipende
da due fattori: la diversa affinità e la pressione parziale. L’affinità del CO
nei confronti del gruppo eme se èm fuori della proteina è 25.000 volte

40
superiore a quella dell’O. Mentre nella proteina è di 200 volte superiore a
quella dell’O. Questo crollo di affinità del CO è causato dall’ His distale E7.
Questo residuo occupa uno spazio nella zona dell’eme ed obbliga ad una
distorsione il legame ione ferroso- CO. In condizioni normali di pressione
parziale la competizione è vinta dall’O.

Non solo l’Hb è suscettibile al legame col CO ma anche altre emoproteine


come la citocromo ossidasi.

Anomalie derivanti da configurazioni quaternarie.


Esistono difetti genetici che portano alterazioni a carico dell’Hb, dove alcune
catene non sono prodotte o non i quantità sufficiente.
La condizione patologica che ne deriva è la talassemia,
talassemia una malattia con
elevata incidenza.
Per la mancata o scarsa produzione di catene  parliamo di talassemie  , le
 talassemie rappresentano mancata o scarsa produzione di catene  .
Considerando che l’Hb si forma comunque in forma tetramerica, nelle
talassemie l’assemblaggio sarà errato.
Per quanto riguarda le catene a ci sono 4 geni codificanti, 2 per ciascuno dei
cromosomi 16. Questi geni possono essere tutti funzionanti, nel fenotipo
normale; oppure a seconda del numero di geni funzionanti avremo una più o
meno grave gravità.
Le catene b hanno un numero inferiore di geni, geni soltanto 2, uno per ogni
cromosoma 11.

41
SITUAZIONE NORMALE =  /
 -TALASSEMIE
₂₂ Nessun gene si esprime, non c’è nessuna
(Portland) produzione di catene . Questa è un’Hb
isolata nel feto con catene di tipo
composta da tetrameri ₂₂. La
malattia associata è l’IDROPE FETALE,
_ _/_ _ non compatibile con la vita.
₄ La Bart’s è un Hb anomala la malattia
(Bart’s) associata è l’IDROPE FETALE.
₄ Si esprime solo uno dei 4 geni , esiste la
(Hb H) possibilità di produrre Hb normale, ma
_ _/ _ ₄
esistono parecchie molecole anomale.
Porta ANEMIE dove l’Hb istabile
(Bart’s)
precipita, EMOLISI, MICROCITOSI,
30%
CORPI DI INCLUSIONE.
INCLUSIONE
 _/ _(trans) 2 su 4 geni vengono espressi. La
diagnosi si fa mediante prelievo del
₄ cordone ombelicale. Si trova al 5% circa
_ _/  (cis) e si dice che c’è TRAIT TALASSEMICO,
cioè tendenza alla possibilità di
trasmettere questo carattere. E’
abbastanza compatibile con la vita
 _/ ₄ Situazione del tutto ASINTOMATICA,
ASINTOMATICA
dove solo uno dei geni non funziona. Si
trova la ₄ in quantità limitata.

42
 ₄-TALASSEMIE
_/_  ⁰ ₂ ₂ ( MORBO DI COOLEY da cui risulta un
Hb F) 20- anemia grave. I pazienti sono
80% caratterizzati da un elevata Hb fetale. La
quantità può variare a seconda della
gravità dal 20 all’80%.
_/ ⁺ TALASSEMIA MINOR, MINOR anemia lieve.
Aumento Diagnosticata con il dosaggio dell’Hb ,
di Hb A₂ presente in ognuno in quantità variabile
(₂ ₂) dall’1 al 2%.

Anomalie della struttura primaria, mutazioni puntiformi.


Fino ad ora sono state individuate circa 200 emoglobine con anomalie della
struttura primaria. Una mutazione a livello primario può causare vari processi.
L’EMOGLOBINA KANSAS caratterizzata da una mutazione nella catena  in
posizione 102 aspargina- treonina. Questa proteina ha conservato l’effetto
cooperativo, ma alle concentrazioni a cui dovrebbe saturare il 100%, satura il
35-40%; allo stesso modo rilascia ai tessuti una quantità nettamente inferiore
di O. Già quando la saturazione scende al 60% si ha difficoltà serie
nell’ossigenazione dei tessuti. L’Hb Kansas è difficilmente compatibile con la
vita.
L’EMOGLOBINA R RANIER caratterizzata da una mutazione tirosina-cisteina
su  145. Questa è un’ Hb molto più affine all’ O, quasi come la mioglobina,
tanto che a livello dei capillari non cede O. A 30-40 mmHg quest’emoglobina
è completamente satura.

SATURAZIONE
(%)
Hb Ranieri

Hb A

Hb Kansas

pO₂ (mmHg)

43
ANEMIA FALCIFORME (Hb S) fu studiata a partire dalle osservazioni di un
metodico medico di Chicago, James Herrick, che nel sangue di uno studente
vide la presenza di cell. rosse anomale a forma di falcetto. Questo stato è
quello di un anemia grave perché questi eritrociti si rompono e danno una
anemia intravasale.
Bisogna verificare se l’Hb si comporta normalmente, un metodo per verificarlo
è l’elettroforesi, che permette di svelare anomalie catena.
Per eseguire l’elettroforesi:
1. Prendiamo l’Hb normale e allontaniamo i globuli dal plasma con
centrifugazione.
2. Sottoponiamo i globuli a lisi in una soluzione ipotonica.
3. Si effettua una ulteriore centrifugazione , l’ Hb che è rimasta in
soluzione è pronta per essere analizzata.
Sottoponiamo ad elettroforesi l’Hb:
Di un individuo sano
Di un eterozigote che ha sia l’Hb S si la A
Di un omozigote per il gene mutato.
L’Hb dell’individuo sano migra tutta da una parte e si ferma in un certo punto.
L’Hb dell’eterozigote si ripartisce in due sezioni, una che ha le caratteristiche
elettroforetiche dell’Hb sana, un di quella patologica.
L’Hb dell’omozigote migra da una parte con motilità elettroforetica maggiore.

AA AS SS
+

Hb A

Hb S

-
origine

L’ Hb è più veloce a spostarsi al polo negativo quando ha una carica positiva


in più o una negativa in meno.
Per capire cosa non funziona all’Hb anomala per cui si comporta così
effettuiamo il FINGEPRINTING dell’Hb.
Ogni proteina trattata a determinate condizioni presenta le sue peculiarità.
44
1. Si prende l’ Hb di un individuo sano e la si sottopone a digestione
triplica con un enzima proteolitico, l’enzima tripsina . Questo enzima
favorisce la scissione di legami peptidici che collegano un residuo
all’altro nelle varie proteine, specie quelli in cui c’è arginina o lisina. Se
ad es. abbiamo una proteina con 15 legami peptidici con arginina o
lisina, la proteina sarà tagliata in 15 punti, formando 16 frammenti.
2. Prendiamo una goccia di questo miscuglio di frammenti e lo
sottoponiamo ad elettroforesi, ogni frammento essendo diverso
dall’altro avrà propria motilità elettroforetica.
3. I frammenti sono numerosi e si addossano, non permettendo una
buona risoluzione.
4. Si aggiunge quindi una seconda divisione ortogonale, e si sottopone lo
stesso foglio a cromatografia. Questa tecnica separativa si basa sul
coefficiente di ripartizione.
5. Otteniamo così un’ottima risoluzione dei peptidi.

CROMATOGRAFIA
ELETTROFORESI in direzione orizzontale in direzione verticale

⑦ ③
MISCELA DI ⑧
PEPTIDI ⑤
+ - ⑥

① ④

①②③④⑤⑥⑦⑧⑨

Paragonate le Hb di un individuo sano saranno perfettamente sovrapponibili.


Se il paziente è affetto da anemia falciforme troviamo una mappa in cui tutti i
frammenti si sovrappongono tranne uno. Questo ci indica che questo
frammento avrà una struttura primaria diversa dall’Hb nativa.

6. Recuperiamo il frammento anomalo, con le normali metodologie per la


sequenza primaria.
7. Confrontiamo la sequenza primaria del peptide anomalo con quella del
peptide dell’individuo sano.
8. Il frammento contiene una catena formata da 8 amminoacidi. La
mutazione è a carico delle catene beta dove in posizione 6 l’acido
glutammico è sostituito da una valina.

45
Quindi l’anemia falciforme è causata dalla variazione di un singolo residuo,
avendo il glutammato carica negativa, l’Hb S ha una carica negativa in meno
e migrerà più velocemente verso il polo negativo. E’ possibile analizzando le
triplette codificanti comprendere come è avvenuta la mutazione.

CODONI
VALINA ACIDO La mutazione è avvenuta a carico della
GLUTAMMICO seconda base. Dove un uracile viene
GUU / sostituito da un adenina.
GUC /
GUA GAA
GUG GAG
La valina fa parte dei ramificati, presenta una catena alifatica apolare ,
mentre il glutammato è un residuo polare. Questa sostituzione comporta
l’assunzione di carattere apolare, idrofobico al posto di uno idrofilo e polare.
L’assunzione di un carattere idrofobico comporta l’effetto idrofobico, la forza
che tende a far convergere tra loro i gruppi idrofobici. Parte una reazione
comandata dall’effetto idrofobico che scatena la polimerizzazione delle
catene emoglobiniche. I vari tetrameri si uniscono con quelle unità chiamate
appiccicose.
L’Hb non è più una proteina
solubile ma diventa fibrosa, le
lunghe catene fibrose
impongono all’eritrocita la
conformazione a falcetto. Sono
le forme T che scoprono queste
unità appiccicose.
L’Hb S arriva ai tessuti
ossigenata, libera ossigeno,
assume la forma T, si realizza la
polimerizzazione. I globuli rossi
perdono le loro caratteristiche
principali, la deformabilità, la
capacità di passare anche nei
capillari molto piccoli, causando
così ostruzione dei capillari ed
emolisi.

Anomalie dello stato di ossidazione del Ferro.


46
Esiste una famiglia di Hb dette M, che hanno una maggiore tendenza a
transitare il ferro da ferroso a ferrico.
Eseguendo il dosaggio della metemoglobina vediamo che è presente in
ognuno in una quantità che non supera il 2%.
Ciò significa che si forma ma viene continuamente ricondotta a emoglobina
funzionante. Si riforma spontaneamente perché la reazione di ossigenazione
non è perfetta al 100% e su 100 molecole che si ossigenano una subisce
anche ossidazione, il ferro diviene ferrico e l’O superossido.
I mezzi che riconducono la metaemoglobina ad emoglobina funzionante
usano substrati ed enzimi.
Nell’eritrocita è presente un tripeptide: il GLUTATIONE, GSH, composto da
Gly-Cys-Glu, glicina,cisteina, glutammato.
L’eritrocita lavora per mantenere i livelli di glutatione alti, infatti il glutatione è
un forte riducente. Due unità di glutatione ridotto diventano un unità di
glutatione ossidato, liberando anche due riducenti e due elettroni. Questi
equivalenti di riduzione hanno molteplici funzioni, come antiossidanti con i
radicali liberi dell’O, e fa transitare la metaemoglobina in emoglobina
funzionante.

Gly-Cis-Glu =GSH glutatione ridotto

2 GSH GS-SG (glutatione ossidato)

2H

MHb Hb

Esiste anche un altro sistema enzimatico che assolve la stessa funzione, la


metaglobina reduttasi NADH dipendente. L’NADH è un forte riducente che
viene utilizzato in questi casi.
Il glutatione e la metaglobina reduttasi NADH dipendente assicurano che la
metaglobina mantenga valori bassi. Se aumenta può pregiudicare lo stato di
ossigenazione tissutale, infatti la metaglobina non lega l’O ma l’OH per
neutralizzare la carica positiva del Fe.
Inalazione o digestione di forti ossidanti ( nitrati, candeggina) porta ad un
aumento della metaglobina.

47
Esistono forme di emoglobina geneticamente determinate a dare produzione
di metaglobina.
Le mutazioni che portano a queste situazioni sono sempre sostituzioni di
residui apolari con residui polari, questa situazione favorisce l’ingresso di
acqua e quindi di ossigeno, rendendo più facile l’ossidazione.

Hb M

idrofobo polare

Hb M - Bristol Val Asp  67


Hb M - Hammersmith Phe Ser  42
Hb M - Koln Val Met  98
Hb M - Milwaukee Val Glu  67
Hb M - Norfolk Gly Asp  57
Inoltre danno ugualmente Hb M mutazioni a carico dell’ His distale E7.

Hb M – Boston His E7 Tyr 


Hb M - Sasksatoon His E7 Tyr 
Hb M - Zurich His E7 Arg  Mutazione non produttiva, il
grado di protezione dell’ His è
uguale a quello dell’ Arg

Le proteine del sangue.


Nel sangue ci sono numerose proteine che prendono il nome di proteine
plasmatiche.
t Il plasma è la parte non corpuscolata del sangue. Si ottiene facendo
centrifugare un campione di sangue intero con un anticoagulante. Nella
provetta la parte corpuscolata si disporrà sul fondo, il plasma il
superficie.

t La parte corpuscolata è l’ematocrito,


l’ematocrito che in condizioni normali non
supera il 45% del sangue intero.

t I soluti sono rappresentati da una serie di sali, composti inorganici,


metaboliti (ad es. ac.lattico), proteine.
proteine

48
H₂O COMPOSTI 10%
INORGANICI
METABOLITI 20%
ORGANICI E
SOLUTI ALTRI
PRODOTTI
70%

PROTEINE
EMAZIE
PLASMATICHE

LEUCOCITI
PIASTRINE

t Se si lascia coagulare il sangue e si centrifuga si ottiene il siero.


La differenza tra plasma e siero è che il plasma non contiene
fibrinogeno (sostanza usata durante la coagulazione).

t La misura delle proteine del sangue avviene nel siero.


La misura delle proteine nel siero è ormai un esame rutinario ma che dà
importanti indicazioni. E’ possibile verificare sia la % totale delle
proteine plasmatiche, sia il rapporto % delle varie classi.

t Le proteine plasmatiche sono 6,5-7,5 g/100ml di sangue.

t La maggior parte di queste proteine è di sintesi epatica,


epatica fra le quali la
maggior componente è l’albumina, un decremento delle proteine
plastiche può indicare la mancata o incompleta sintesi da parte del
fegato o la perdita a livello renale.

t Ci sono diversi metodi per misurare la quantità di proteine: si tratta una


certa quantità di siero o plasma con dei reattivi, il più usato è il biureto
(una soluzione alcalina di Cu) che sviluppa con le proteine un’ intensità
di colorazione proporzionale alla concentrazione.

Composizione delle proteine


La classificazione delle proteine più usata è quella elettroforetica.
Un sistema elettroforetico è composto da un foglio di carta o di acetato di
cellulosa (un materiale che non deve reagire chimicamente con la proteina), e
49
da un circuito ai cui terminali applichiamo differenza di potenziale, ottenendo
un lato positivo e uno negativo.
Le proteine vengono stratificate sul foglio a pH relativamente alcalino 8.5-8.6.
Questo perché questo valore è superiore al punto isoelettrico di tutte le
proteine del plasma, che di conseguenza a un pH così alto saranno cariche
negativamente e tenderanno a migrare a circuito chiuso verso il polo positivo.
La velocità di migrazione è da attribuire al numero di cariche nette negative
presenti su una proteina ad un determinato valore di pH.
In questo modo le proteine si raggruppano in strisce.
strisce
Le proteine plasmatiche non sono colorate, ma le bande possono essere
evidenziate con opportune colorazioni: l’elettroferogramma.
La prima banda che appare è quella delle proteine più veloci, le albumine, le
altre bande vengono chiamate  ₂ e hanno velocità di migrazione
gradatamente decrescente.

L’interpretazione quantitativa di un elettroferogramma, si effettua attraverso


analisi densitometrica.
ALBUMINA


₂

GLOBULINE 


La striscia viene fatta attraversare da un raggio laser,


laser in questo modo si
apprezza la densità di ciascuna banda attraverso i tracciati densiometrici.
densiometrici
Otteniamo una serie di picchi corrispondenti alle singole bande.
I picchi possono essere di diverso tipo: alti e stretti che significano che le
proteine migrate sono uguali tra loro; bassi e larghi significa che le proteine
migrate sono eterogenee.
Il risultato che otteniamo è il tracciato elettroforetico. E’ possibile anche
misurare l’area sottostante alla curva, e da essa ricavare l’area di ciascun
picco.

50
Alb



₂

% 59 4 9 12 16

I valori medi delle proteine plasmatiche:

Albumina 60%
Globuline 40%
 4%
₂ 8%
 12%
 15-18%
Importante è il rapporto tra albumina e globuline :
A/G=1.5
Bisogna comunque guardare con attenzione ogni picco, che può essere
indicativo di modifiche che non alterano le percentuali.

ALBUMINA
Rappresenta il 60% delle proteine plasmatiche, presente circa 4g/100ml di
sangue. E’ indice di buona nutrizione , la caduta del valore di albumina
corrisponde a scarsa nutrizione, associata a particolari sintomi (ad es. edema
agli arti).
Assolve due funzioni:
† TRASPORTO
L’albumina trasporta un’ampia gamma di molecole endogene ed
esogene.
Molecole endogene come gli acidi grassi che sono molecole
idrocarburiche, alifatiche, idrofobiche. Gli acidi grassi si muovono dal
tessuto adiposo al cuore, ai muscoli scheletrici, al fegato, attraverso un
ambiente acquoso. Non possono però circolare in soluzione essendo
insolubili e per questo si fanno trasportare dall’albumina. L’albumina
può portare 18 molecole di acidi grassi a pH fisiologico (7.4). L’albumina
non trasporta solo acidi grassi, ma anche la bilirubina, un prodotto di

51
derivazione dell’emgloobina, sintetizzato a livello della milza, del
midollo, del fegato. La bilirubina è assolutamente insolubile e ha la
tendenza ad attraversa le membrane, e se ciò avviene a livello
encefalico può causare gravi danni.
Tra le molecole endogene trasportate dall’albumina ci sono
ormoni, vitamine e molecole che occasionalmente si trovano in
circolo perché tossiche o farmacologiche. Infatti quando si
somministra un farmaco bisogna considerare la costante di
dissociazione tra l’albumina e il farmaco (biodisponibiltà del farmaco).
Nel sangue ci sono tre frazioni alluminiche:
o pre-albumina,
o post-albumina,
o albumina.
L’albumina è formata da una singola catena, è una proteina globulare,
ha punto isoelettrico 4.7, ha forma ellissoidale. Questa forma dà
all’albumina bassa viscosità, meno resistenza al pompaggio sanguigno.

† REGOLAZIONE DELLA PRESSIONE OSMOTICA.


Se misuriamo le proteine plasmatiche in un soggetto con edema agli
arti inferiori, troveremo che sono più o meno costanti ma la quantità di
albumina è sicuramente più bassa. Basta una diminuzione del 10% (da
4g a 3.7g) a dar luogo a manifestazioni edematose. Un edema è
l’accumulo di liquidi negli spazi interstiziali.

CAPILLARE

ESTREMITA’ Fluidi OUT ESTREMITA’


ARTERIOSA (pressione VENOSA
idrostatica) Fluidi IN
(pressione osmotica)

Max I.P. : 34 mmHg min I.P.: 12 mmHg


O.P: 22 mmHg O.P: 22 mmHg

52
Il sangue quando entra nei capillari, esercita una forza idrostatica che spinge
i fluidi dal lume dei capillari, nei tessuti. Questo flusso deve essere
compensato da un flusso in entrata per mantenere l’omeostasi.
La forza diretta all’esterno è la pressione idrostatica, quella diretta
all’interno è la pressione osmotica, che è esercitata dalle molecole
proteiche del plasma che essendo impermeabili alla parete del capillare
esercitano una pressione.
Nell’estremità arteriosa la pressione idrostatica ha il valore più alto
(34mmHg), man mano tende a diminuire andando verso l’estremità venosa,
dove raggiunge i 12mmHg. La pressione osmotica invece si mantiene
costante per tutta la lunghezza del capillare a 22mmHg.
La pressione totale che agisce all’estremità arteriosa è di 12mmHg (34-
22=12).
Ci sarà un punto in cui la due forze saranno uguali e opposte, qui il
movimento sarà pari a 0.
Da questo punto la pressione osmotica aumenterà e supererà il valore della
pressione idrostatica, con un progressivo aumento di sottrazione di liquidi
dagli interstizi.
In questo modo si realizza un circuito in cui i liquidi entrano dall’estremità
arteriosa ed escono dall’estremità venosa.
Nel caso patologico in cui la pressione osmotica sia di 18mmHg e non di
22mmHg, avremo all’estremità venosa una pressione totale maggiore (16
invece di 12 mmHg) e all’estremità venosa una minore (6 invece di
10mmHg). In questo modo i metabolici sono spinti all’esterno con maggiore
forza e i cataboliti rientrano con forza minore causando accumulo di liquidi
negli interstizi, quindi edema.

La maggior parte delle proteine del plasma sono proteine coniugate, mentre
l’albumina è una delle poche proteine semplici.

Le proteine coniugate possono essere:

 Glicoproteine,
Glicoproteine con la componente glucidica variabile:
GLU-NH₂ = glucosammina
GAL-NH₂ = galattosammina
GAL= galattosio
MAN = mannosio

 Lipoproteine, vengono classificate in termini di densità, “apo” indica la


frazione proteica delle proteine, “DL” indica la densità delle
lipoprotreine, “H” =alta, “VL”= molto bassa, “L”= bassa.
53
=Apo-HDL
₂=Apo-VLDL
=Apo-LDL

 Proteine che legano i metalli,


metalli come la transferrina che trasporta il Fe, o
la ceruloplasmina che trasporta il Cu.

 Proteine che trasportano ormoni.

GLI ANTICORPI
Gli antigeni esistenti sono infinti, ma non gli anticorpi, per rimediare a questo
gli anticorpi sono dotati di sequenze amminoacidiche costanti e zone variabili
che gli danno la variabilità.

Le immunoglobuline sono tetrametri, costituiti da 2 catene pesanti, e da 2


catene leggere, legate l’une alle altre da ponti disolfuro.
Sono le variazioni della sequenza amminoacidica (e quindi anche della
terziaria) delle catene pesanti e leggere a conferire la variabilità. I quattro

54
domini variabili sono infatti posizionati alle estremità della forcella a forma di
Y, dove formano due siti di legame per i determinanti antigenici.
I domini costanti delle catene pesanti, nella base della molecola a forma di Y,
non servono solo a tenere unite le catene, ma fungono anche da effettori,
segnalando ai macrofagi di attaccare particelle o cellule marcate dal legame
con l’anticorpo.

Sono proteine tetramere contenenti


due grosse catene (giallo e rosso) e
catene piccole (blu e verde). La rottura
enzimatica di una Ig produce un
frammento Fc e un frammento Fab.
Il frammento Fc è lo stesso per tutte le
Ig, mentre il frammento Fab contiene le
regioni di riconoscimento dell'antigene

55