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PARTE I
1. Introducción
2. Objetivos
2.1 Objetivo general
2.2 Objetivos particulares
3. Purificación de la tirosinasa de hongo A. bisporus
3.1 Antecedentes
3.2 Materiales y método
3.3 Obtención del cromatograma de la purificación
4. Ensayos de actividad enzimática
4.1 Corrección por dispersión de luz como una herramienta para evaluar agregados de
proteínas.
4.2 Actividad monofenolasa
4.3 Actividad difenolasa
5. Resultados y conclusiones
6. Referencias
PARTE II
1. Introducción
2. Objetivos
2.1 Objetivo general
2.2 Objetivos particulares
3. Reactivos y suplementos
4. Actividad Experimental
4.1 Deshidroxilación del SiO2 utilizado como soporte para la inmovilización
4.2 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2 seguida
por unión covalente con glutaraldehído al 0.1 %.
4.3 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2 en
presencia de 1 mM de Ca2+ seguida por unión covalente con glutaraldehído al 0.1 %.
4.4 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2 en
presencia de 1 mM de Mg2+ seguida por unión covalente con glutaraldehído al 0.1%.
4.5 Ensayo enzimático del biomaterial
4.6 Caracterización de la enzima-soporte a diferentes condiciones a través de FTIR.
5. Resultados y conclusiones
6. Referencias
PARTE I
1. Introducción
Esta enzima ubicua cataliza los dos primeros pasos en la melanogenesis de los mamíferos
y es responsable del pardeamiento enzimático que ocurre al golpear o al almacenar
durante largo tiempo vegetales, frutas, y hongos [3]. El fenómeno de pardeamiento en
frutas y hongos es también usualmente relacionado a polimerización oxidativa,
conceptualmente similar a melanogenesis. En mamíferos, la tirosinasa no solamente es
responsable del pardeamiento del cabello y de la pigmentación de la piel [4,5], sino también
de anormalidades en la piel tales como hipopigmentación (vitíligo) e hiperpigmentación
(pecas) [6].
Además, la tirosinasa puede jugar un rol en cáncer y enfermedades neurodegenerativas,
tales como la enfermedad de Parkinson [7].
La forma deoxi es una especie reducida, la cual une oxígeno molecular para dar la forma
oxi. En la forma oxi, el oxígeno molecular está rodeado como un complejo μ-1,2-peroxo, el
cual desestabiliza el enlace O-O y la activa. La forma met es asumida como una forma
enzimática en descanso, donde los iones Cu(II) están normalmente puenteados a un
ligando pequeño, tales como una molécula de agua o ion hidróxido [9].
Las tirosinasas mejor caracterizadas son derivadas de Streptomyces glausescens, los
hongos Neurospora crassa y Agaricus bisporus. Una notable característica observada en
tirosinasas de diferentes fuentes es que el dominio de unión de cobre central está
conservado, el cual contiene estrictamente residuos de aminoácidos conservados,
incluyendo tres histidinas [3].
2. Objetivos
3.1 Antecedentes
Varias tirosinasas, como las de mamíferos [10], plantas [11] y hongos [12], se comportan
como equilibrios de asociación-disociación, dependientes de la concentración de enzima
(sistemas auto-asociantes). Algunas preparaciones de enzima de la misma fuente (hongo o
Neurospora crassa) tienden a disociarse unas más que otras [12]. En el caso de la
tirosinasa de hongo, las masas moleculares mínimas observadas por métodos de
sedimentación han sido 26,000 – 32,000 [12] y la más alta de 120,000-128,000 [13].
La enzima es comúnmente encontrada como una proteína tetramérica con una masa
molecular de ~120 kDa, compuesta de dos subunidades de ~43 kDa (subunidad H) y dos
subunidades de ~14 kDa (subunidad L) [14].
El descubrimiento de una tirosinasa monomérica activa de 43 kDa aislada del hongo [15]
sugiere que la subunidad H es dominio tirosinasa. La identidad, función y origen de la
subunidad L son todavía desconocidas [16]. Aunque se sabe que no ejerce un efecto
dramático sobre la actividad de la enzima, se requiere investigación adicional para
establecer el rol biológico de la subunidad L, si es que hay alguno, así como también su
importancia para el funcionamiento de la subunidad H [19].
La tirosinasa de hongo (EC 1.14.18.1) utilizada en este trabajo fue obtenida de un lote
comercial de Sigma-Aldrich. El resto de los reactivos fueron de grado analítico. Se
disolvieron aproximadamente 1.2 mg de polvo de tirosinasa de hongo en 1 ml de regulador
de fosfatos (100 mM de NaPi, pH 6.50) conteniendo 10 mM CaCI 2, la muestra se filtró en
membranas Millipore con diámetro de poro de 0.45 μm, la cual se inyecto en una columna
de filtración en gel 10/300 GL Superdex S-200, en un cromatógrafo de líquidos (FPLC) GE
Healthcare. Los contenidos de la proteína fueron eluidos de la columna a un flujo de 0.2
ml/min. La elución de los componentes protéicos fue determinada por absorción de luz de
280 nm, los cuales se colectaron del volumen de elución de 14 a 21 ml del cromatograma
adjunto (Fig.1). Siete fracciones de 1 ml cada una, fueron reunidas y concentradas con
buffer concomitante a 100 mM NaPi (pH 6.50) sobre una membrana Amicon (Millipore) de
10 kDa de corte molecular. La concentración de la muestra fue realizada a 3 400xg a 4 °C
durante 15 min. El concentrado fue vertido a un tubo Eppendorf y refrigerado hasta la
realización de las pruebas de actividad mono y difenolasa.
3.3 Obtención del cromatograma de la tirosinasa de hongo A. bisporus
Fig. 1 Los volúmenes colectados y concentrados fueron desde 14-21 ml del presente
-1
cromatograma a una velocidad de flujo constante de 0.20 ml min .
4.1 Corrección por dispersión de luz como una herramienta para evaluar
agregados de proteínas.
Antes de seguir la cinética de reacción, se hizo un blanco con buffer 100 mM NaPi (pH
6.50). La enzima y el buffer se equilibran durante 1 min en la celda de reacción antes de
agregar el sustrato y el tiempo de ciclo para el ensayo fue 45 s durante 1200 s.
Enzima 9 μg
Buffer 100 mM NaPi (pH 6.50)
Sustrato 0.30 mM L-Tirosina
Se disolvió 2.5 mg/ml de L-Tirosina en buffer 100 mM NaPi (pH 6.50) y se agitó
moderamente en un vortex durante dos minutos. Después se procedió a tomar la alícuota
correspondiente.
De acuerdo a Gracía-Molina et al. [18] en el estado estacionario tenemos que:
[DC]=V0t –[I]ss
Siendo:
DC Especie detectable derivada de L-Tirosina
I Intermediario
SS Estado estacionario
Antes de seguir la cinética de reacción, se hizo un blanco con buffer 100 mM NaPi (pH
6.50). La enzima y el buffer se equilibraron durante 1 min en la celda de reacción antes de
agregar el sustrato y el tiempo de ciclo para el ensayo fue 20 s durante 600 s.
Enzima 3.5 μg
Buffer 100 mM NaPi (pH 6.50)
Sustrato 0.30 mM L-DOPA
Por lo tanto la velocidad inicial (Vo) es 290 nMs-1 para la actividad difenolasa.
80
70
[Especie detectable]/µM
60 y = 0.145x - 0.9032
R² = 0.9931
50
40
30
20 y = 0.0752x - 2.6964
10 R² = 0.9939
0
0 100 200 300 400 500 600 700
Tiempo/s
Actividades mono y difenolasa en presencia de 0.30 mM de L-Tirosina y L-DOPA respectivamente en buffer 100 mM NaPi pH
6.50. Los círculos corresponden a la actividad difenolasa medida a 475 nm y los triángulos corresponde a la actividad
monofenolasa medida a 480 nm.
5. Resultados y conclusiones
6. Referencias
1. Introducción
La inmovilización de una proteína puede ser definida como la unión de enzimas solubles o
libres sobre diferentes tipos de soportes resultando en la reducción o perdida de movilidad
de la enzima. La selección de una estrategia de inmovilización influye mucho en las
propiedades del biocatalizador. Los métodos para inmovilizar proteínas pueden ser
divididos en tres principales categorías [2]:
Unión a un soporte prefabricado (portador)
Atrapamiento en matrices poliméricas orgánicas e inorgánicas
Entrecruzamiento de enzimas
Cabe señalar que está clasificación es arbitraria para cada autor o autores. Los métodos
para inmovilizar pueden clasificarse de manera general como físicos (donde interacciones
débiles existen entre el soporte y la enzima) y químicos (donde enlaces covalentes son
formados con la enzima).
Los niveles de variación en la actividad y las limitaciones de difusión que ocurren con la
inmovilización son principalmente dependientes de las propiedades del material de soporte
y el método de inmovilización. Los materiales de soporte juegan un rol muy importante en
la utilidad de una enzima inmovilizada, por lo que deberían ser de bajo costo y proveer un
área superficial grande adecuada junto con la menor limitación de difusión en el transporte
de sustrato y producto para las reacciones enzimáticas [3].
2. Objetivos
La tirosinasa de hongo (EC 1.14.18.1) utilizada en este trabajo fue obtenida de un lote
comercial de Sigma-Aldrich. Los reactivos Glutaraldehído Grado III (solución al 70 %,
ρ=1.143 gml-1) y L-DOPA fueron adquiridos de la misma casa comercial Sigma-Aldrich (St
Louis, Mo.). Los reactivos CaCI2, MgCI2·6H2O, CuSO4·5H2O, KH2PO4, K2HPO4, y glicerina
fueron de grado analítico.
La sílice mesoporosa fue sintetizada por el proceso sol-gel usando tetraetilortosilicato
(TEOS Aldrich 98%), etanol (Baker 99%), y agua desionizada en un cociente molar 1:4:2.5.
La solución fue calentada desde 30 °C hasta 60 °C y agitada hasta que un gel fue obtenido
a pH 6.50. El resto de los reactivos fueron de grado analítico.
4. Actividad Experimental
La superficie de la sílice bajo condiciones normales está cubierta con grupos hidroxilos
(grupos silanol: Si-OH) que ejercen importantes funciones en los procesos de adsorción,
mientras que en el interior del sólido presenta puentes siloxano (Si-O-Si) [10] cuyas
concentraciones relativas dependen de la temperatura de calcinación también como de la
humedad ambiente y el tiempo de almacenaje [11]. El principal adsorbente inorgánico
usado como soporte es la sílice gel, debido principalmente a su comportamiento químico
determinado por la reactividad de los grupos silanol presentes en la superficie. Estos
grupos no solamente hacen capaz la adsorción física de varias sustancias sino también de
reacciones químicas con otros grupos orgánicos o inorgánicos, modificando completamente
las propiedades originales de la sílice gel [12]. La estructura y reactividad de la sílice son
fuertes funciones de la historia térmica y química de la muestra. De acuerdo a Zhuravlev
[13,14], la temperatura umbral correspondiente a una completa deshidratación y el
comienzo de la deshidroxilación está estimada en 190±10°C, así una pequeña cantidad de
agua adsorbida físicamente permanece sobre la superficie hasta aproximadamente 200°C.
La muestra fue calcinada a 550 °C, porque el área superficial no cambia significativamente
debajo de 600 °C para la mayoría de la sílices [11].
R: Velocidad de la rampa para alcanzar la temperatura deseada, T1: Temperatura inicial, T2: Temperatura máxima a alcanzar, T3:
Temperatura mínima al enfriarse, H: Tiempo que permanecerá a cierta temperatura (T1, T2, T3) una vez alcanzada está última.
4.2 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2
seguida por unión covalente con glutaraldehído al 0.1 %.
Una vez finalizado este último paso la enzima-soporte fue sacada de la solución y
enjuagada en buffer 100 mM KPi pH 6.80 y posteriormente se vertió en otra solución que
contiene buffer 100 mM KPi pH 6.80 / 20 % glicerol / 20 μM CuSO 4 y se mantuvo en
refrigeración a 4 °C para su uso posterior.
Una vez finalizado este último paso la enzima-soporte fue sacada de la solución y
enjuagada en buffer 100 mM KPi pH 6.80 y posteriormente se vertió en otra solución que
contiene buffer 100 mM KPi pH 6.80 / 20 % glicerol/ 20 μM CuSO4 y se mantuvo en
refrigeración a 4 °C para su uso posterior.
4.4 Adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus sobre un soporte de SiO2 en
presencia de 1 mM de Mg2+ seguida por unión covalente con glutaraldehído al 0.1 %.
Una vez finalizado este último paso la enzima-soporte fue sacada de la solución y
enjuagada en buffer 100 mM KPi pH 6.80 y posteriormente se vertió en otra solución que
contiene buffer 100 mM KPi pH 6.80 / 20 % glicerol / 20 μM CuSO 4 y se mantuvo en
refrigeración a 4 °C para su uso posterior.
12.0
10.0
[DOPAcromo]/ µM
4.0
y = 0.0025x + 1.7425
R² = 0.984
2.0
0.0
0 500 1000 1500 2000
Tiempo/s
Medio de reacción: 100 mM KPi pH 6.80, 0.30 mM L-DOPA . Muestra 1: adsorción simple (triángulos rojo), Muestra 2: adsorción simple
en presencia de 1 mM de CaCI2 (triángulos azul) y Muestra 3: adsorción simple en presencia de 1 mM de MgCI2 (triángulos verde). Todas
las muestras fueron unidas covalentemente con glutaraldehído al 0.1%.
120
100
% Transmitancia
% Transmitancia
90
90
m1 90 min después de reaccionar
m1 adsorción simple m3 adsorción simple en presencia de MgCI2
m2 90 min después de reaccionar
m0 sílice calcinada
m2 adsorción simple en presencia de CaCI2
m3 90 min después de reaccionar
80
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
Todas muestras después de la adsorción simple se unieron covalentemente por medio de glutaraldehído al 0.1 % excepto la
muestra 3 que está en color negro.
Tabla 3. Asignación de bandas de absorción de los espectros de IR
5. Resultados y conclusiones
La adsorción de la tirosinasa de hongo A. bisporus (muestra 1) tuvo una eficiencia del 20%,
la adsorción en presencia de 1mM de CaCI2 (muestra 2) obtuvo una eficiencia del 70% y la
adsorción en presencia de 1 mM de MgCI2 (muestra 3) obtuvo una eficiencia del 90 %. El
glutaraldehído al 0.1 % fue usado como un agente de entrecruzamiento para unir
covalentemente la enzima al soporte y así evitar su desorción del mismo durante la catálisis
enzimática.
Se calculó la velocidad inicial (Vo), la cual está relacionada a la actividad de la enzima para
las tres muestras, obteniéndose una Vo para la muestra 1 de 4 nMs-1, una Vo para la
muestra 2 de 12 nMs-1 y para la muestra 3 no fue posible calcularse debido a una tendencia
que no fue posible explicar.
6. Referencias