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GUÍA DE ESTUDIO
CROMATOGRAFÍA
2018
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1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
1) Realice una clasificación general de los diferentes mecanismos de separación cromatográficos,
indique la naturaleza del las fases y el tipo de interacción que tiene lugar en cada caso. Dé algunos
ejemplos de los métodos comprendidos
B. Modos de la Cromatografía Líquida (se puede utilizar el cuadro del item 1).
3) a- Realice una clasificación de tipos de resinas de intercambio iónico, indicando grupo iónico
fijo y contra ión (ión intercambiado).
b-Indicar los efectos de aumentar el entrecruzamiento en las columnas de intercambio iónico
Calcular el número promedio de platos teóricos (N), la altura promedio del plato (H) y la resolución
para dichos compuestos indicando si se separan.
4) Una mezcla de cafeína y fosfato de piridoxal (vitamina B6) se separa en una columna C18 con
una fase móvil metanol:agua 30:70 (v/v). En estas condiciones indicar:
a- El orden de elución, sabiendo que el fosfato de piridoxal es más polar que la cafeína (ver
estructuras químicas).
b- Si el tiempo de retención del analito más retenido fuera muy alto (factor de capacidad mucho
mayor a 5), cómo procedería para disminuirlo si dispone solamente de esa columna.
c-Discuta los ítems ea y eb si se hubiera resuelto la mezcla con una cromatografía de fase normal
d- ¿Qué término de Van Deemter incide más en el valor H en una cromatografía líquida de alto
rendimiento con fase estacionaria líquida?
2) Para cuáles de los siguientes casos aplicar HPLC será una buena opción de análisis, justifique:
a- Estudio de la composición del humo del cigarrillo
b- Determinación de ácido ascórbico (vitamina C) en tabletas
c- Determinación de cafeína en bebidas
d- Determinación de azúcares
3) Una mezcla conocida de los compuestos C y D produce los siguientes resultados en HPLC:
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Se prepara una solución mezclando 12.49 mg de D más 10,00 mL de una solución que sólo contiene
C y se diluye a 25,00 mL. La áreas de los picos son de 5.97 y 6.38 cm2 para C y D respectivamente.
Hallar la concentración de C (mg mL-1) en el problema
2) Los siguientes tiempos de retención y ancho de picos fueron observados en una columna gas-
líquido de 1,50 m, rellena con FE muy polar, de composición química del tipo del etilen glicol.
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Compuesto tr (min) w (min)
no retenido 0.40 -
hexano – PE 68 °C 4.60 0.35
1-metiletil metanoato (MEM) – PE 68 °C 5.00 0.37
Calcular:
a- El factor de capacidad (k) para cada sustrato.
b- El factor de selectividad (α).
c- La altura equivalente del plato teórico (AEPT o H).
3) Para determinar la op de una CGL, se procede a inyectar alícuotas iguales de una misma
muestra, a distintas velocidades de flujo cada vez y se registra en cada caso el tiempo de retención
(tr) y los anchos de pico (w). Los datos obtenidos son los siguientes:
a- Con esta información dibuje la curva de Van Deemter, indicando en la gráfica la op y la Hmin.
La longitud de la columna es de 90 cm.
b- ¿Qué proceso dispersivo está incluido en cada término de la ecuación de Van Deemter?
c- ¿Por qué la difusión longitudinal (término B) es un problema más serio en CG que en CL?
d- ¿El término A de Van Deemter se presenta en una columna capilar abierta? Justifique.
2) Justifique en qué casos es conveniente trabajar en condiciones isotérmicas y qué significa hacerlo
en gradiente de temperaturas. Compare ambos procedimientos, indicando cuándo se eligen y qué
ventajas y desventajas poseen.
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Patrones de etanol Medida del integrador
(mg/mL)
Pico del etanol Pico del propanol
0.5 5518 12754
0.75 7563 11893
1.0 10350 12084
1.25 13935 12870
1.5 15628 12314
Muestra de sangre 9862 12604
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RESPUESTAS
1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
1)
MECANISMO DE NATURALEZA DE LA FASE INTERACCIÓN
SEPARACIÓN
F. MÓVIL F. ESTACIONARIA
Partición Líquida o gaseosa Líquida convencional y fase Solubilidad (ver
ligada interacciones en fase normal
y fase reversa)
Adsorción Líquida o gaseosa Sólida Fuerzas de Van der Waals y
enlaces hidrógeno
Intercambio iónico Líquida Resina Fuerzas electrostáticas
Exclusión molecular Líquida Gel poroso Tamizado
Afinidad Líquida Sólido Reacción especifica
Ejemplos de métodos:
Partición. Planar (papel, HPTLC) – Columna (LLC clásica, HPLC, GLC)
Adsorción. Planar (TLC, HPTLC) – Columna (LSC clásica, HPLC, GSC)
Intercambio iónico. Columna (IEC)
Exclusión molecular. Columna (MEC)
Afinidad. Columna (AC)
Siendo:
HPTLC= High Performance Thin Layer Chromatography; Cromatografía de Capa Delgada de Alta
Resolución.
LLC= Liquid-Liquid Chromatography; Cromatografía Líquida -Líquida.
HPLC=High Performance Liquid Chromatography; Cromatografía Líquida de Alta Resolución.
GLC= Gas- Liquid Chromatography ; Cromatografía Gas - Líquido.
TLC=Thin Layer Chromatography; Cromatografía de Capa Delgada.
LSC= Liquid -Solid Chromatography; Cromatografía Líquido - Sólido.
GSC= Gas - Solid Chromatography; Croamtografía Gas - Sólido.
IEC= Ion Exchange Chromatography; Cromatografía de Intercambio Iónico.
MEC: Molecular Exclusion Chromatography ; Cromatografía de Exclusión Molecular.
AC= Affinity Chromatography; Cromatografía de afinidad
A. Equipamiento
1) Buscar información en la bibliografía sugerida y clases de teoría
B. Modos de la Cromatografía Líquida (se puede utilizar el cuadro del item 1).
1) a- Al elegir una columna para una separación cromatográfica de reparto, la polaridad de la fase
estacionaria debe ser similar a la de los analitos, y para la elución se utiliza una fase móvil con una
polaridad considerablemente distinta (pero que disuelva los analitos).
b- En cromatografía de exclusión, un cambio en la polaridad de la fase móvil no tiene efecto
significativo sobre los tiempos de retención ya que la retención está determinada por el tamaño y la
forma de la molécula en relación con el tamaño y forma de los poros de la fase estacionaria. En este
caso la fase móvil es no-interactiva.
3)
a-
Tipo de resina Grupo iónico fijo Contraión
catiónica fuerte sulfonato (–SO3-) catión
catiónica débil carboxilato (–COO-) catión
aniónica fuerte amonio cuaternario anión
–N(CH3)3+
aniónica débil amonio terciario anión
–NH(CH3)2+
–NH3+
2) a-La composición corresponde a una mezcla de hidrocarburos y sería un claro caso para GC que
dará una rápida, fácil y económica separación respecto de HPLC.
b-La determinación puede hacerse por HPLC pero resulta más fácil determinar vitamina C por
volumetría y por métodos electroquímicos.
c-La cafeína debe ser separada de colorantes, aditivos y otros componentes presentes en las bebidas
y HPLC es la técnica adecuada de elección.
d-Los azúcares pueden ser determinados por GC o HPLC; pero la última es la técnica de elección ya
que los azúcares no son volátiles y deben ser derivatizados con trimetilsilano si se elige CG
haciendo más complicada la determinación
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1.2 CROMATOGRAFÍA DE GASES
A. Equipamiento
1) Consultar la bibliografía sugerida y clases de teoría.
2) Ver bibliografía
3) Las columnas tubulares abiertas se caracterizan por: mayor resolución, debido a que la longitud
de la columna es mayor; menor tiempo de análisis, debido a que al contener menos fase estacionaria
retienen menos a los solutos; mayor sensibilidad, por las características que le son propias. Tienen
menor capacidad de muestra, es decir, se puede aplicar menos muestra que a una columna empacada
4) Reduce la tendencia de la fase estacionaria a sangrar cuando la columna es expuesta a elevadas
temperaturas.
5) El detector de conductividad térmica “compara” la conductividad térmica del eluato con la del
gas portador.
d-
señal
tr (A ) Z
WA WB
3 10 11 tiempo
e- Para mejorar la resolución entre dos bandas cromatográficas se debe aumentar la separación entre
bandas (Δtr) y disminuir su ancho. La separación se puede lograr modificando las variables
termodinámicas (K, k y α) modificando fase móvil, fase estacionaria y/o temperatura. Las bandas se
afinan modificando las variables que permiten disminuir H y aumentar el N (ver ecuación de van
Deemter modificada. Es decir, usar una columna de menor diámetro, una fase estacionaria con
menor espesor- película de fase estacionaria más delgada, partículas de fase estacionaria muy
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pequeñas, etc.)
k'hexano = (4.60 min – 0.40 min)/0.40 min = 0.5 k'MEM = (5 min – 0.40 min) / 0.40 min = 1.5
c- Nhexano = 16 (4.60 min/ 0.355 min)2 = 2687 NMEM = 16 (5.00 min/0.372 min)2 = 2890
Nprom = 2788
H = L/Nprom H = 150 cm/2788 = 0.054 cm
3) a- N = 16 ( tr / w )2 H=L/N
0,1
Alicuota N H
0,08
1 998 0.090
0,06
H (cm)
2 1630 0.055
3 3209 0.028 0,04
c- Porque los coeficientes de difusión de los analitos son más grandes en fase gaseosa que en líquida.
d- No. Porque no tiene empaque y por lo tanto no existe factor de empaque y entonces no se
considera A que está relacionado con este parámetro.
2) Trabajar en condiciones isotérmicas significa trabajar a una única temperatura durante todo el
desarrollo cromatográfico, mientras que hacerlo en gradiente de temperatura implica un aumento de
temperatura programado y generalmente en rampa durante la separación cromatográfica. Trabajar a
una única temperatura implica un proceso más simple y se elige cuando los analitos salen a tiempos
de retención razonables y con una buena resolución. Trabajar en gradiente es más complejo pero
puede ser la solución a cromatogramas que presentan bandas no resueltas en condiciones isotérmicas,
o una gran amplitud en los tiempos de retención. Recordar que los tiempos de retención deben ser
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tales que aseguren razonables valores de las constantes termodinámicas factor de capacidad y
factor de selectividad
3) a-
y = 0,8316x + 0,028
1,4
areaEtOH/areaPropOH
R2 = 0,9986
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 0,5 1 1,5 2
[EtOH] / [PropOH]
R = 0.91 mg/mL
b- Si varían ligeramente las condiciones de una columna, el tr de un compuesto y la altura del pico
pueden modificarse. Pero el ancho y la altura varían simultáneamente y el área correspondiente se
mantiene constante.
c- En cromatografía existen ciertos parámetros difíciles de reproducir de experimento en
experimento, entre los que pueden mencionarse las variaciones del caudal del gas transportador y del
volumen de muestra que se inyecta en el cromatógrafo. La reproducibilidad de la inyección es una de
las limitaciones más importantes de la croamatografia.
Por otra parte, una curva de calibración es válida para la determinación de muestras incógnita si se
mantiene el conjunto de condiciones experimentales bajo las cuales se obtuvo. Por lo tanto, para
eliminar el efecto producido en la señal debido a estas pequeñas variaciones involuntarias, se recurre
al método de patrón interno.
Se llama patrón interno al compuesto, diferente del analito, que se agrega en una cantidad
exactamente conocida a la muestra incógnita y a cada estándar de la curva de calibración. Este
compuesto debe reunir ciertas características: tener una estructura química similar a la del analito y
que los tr entre ambos sean cercanos. De este modo, la relación de las áreas entre analito y patrón
interno sirve como parámetro analítico. Esto se debe a que la respuesta relativa del detector, tanto
para el analito como para el patrón interno, es prácticamente constante en un amplio intervalo de
condiciones.
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PREGUNTAS Y CUESTIONES ADICIONALES
3) Definir los parámetros cromatográficos número (N) y altura (H) de platos teóricos. Indicar con qué
característica del pico cromatográfico se relacionan y justificar a través de qué variables pueden ser
modificados dichos parámetros para lograr mejores separaciones.
4) Dibujar, en un mismo gráfico, cada uno de los términos dispersivos de la ecuación de Van Deemter
modificada y la curva resultante. Indicar la condición óptima de trabajo.
5) Explicar la relación entre la altura del plato (H) y la difusión en remolino (término A) de un
compuesto en una cromatografía en columna. Indicar cómo se genera dicha difusión, su relación con la
velocidad lineal de la fase móvil y en qué tipos de columnas cromatograficas está ausente. Justificar.
6) Explicar la relación entre la altura del plato (H) y la difusión longitudinal (término B) de un compuesto
en una cromatografía en columna. Indicar cómo se genera dicha difusión, su relación con la velocidad
lineal de la fase móvil y en qué tipo de cromatografía es más importante. Justificar.
7) Explicar en qué consiste efectuar una curva de calibración con patrón interno en método
cromatográfico y las ventajas de este procedimiento.
8) Justificar:
– qué tipo de especies se separan con HPLC y no con CG
– qué tipo de especies se separan con exclusión molecular
– qué tipo de especies se separan con intercambio iónico
9) En cromatografía líquida: definir los conceptos de fase normal y fase reversa. Ejemplos.
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11) En una cromatografía líquida de adsorción: definir la naturaleza de fase móvil y estacionaria
(ejemplos de cada una de ellas). Describir el fundamento de la separación y fuerzas que intervienen.
Indicar qué mide el parámetro de fuerza del solvente ( o). Justifique si la fase móvil es o no
interactiva.
12) Describir las diferencias entre una cromatografía líquida convencional y una de fase ligada, y
mencionar al menos 3 ventajas de la fase ligada respecto a la cromatografía convencional.
13) En una cromatografía líquida de intercambio iónico, defina la naturaleza de la fase móvil y de la
fase estacionaria (ejemplos de cada una de ellas). Describa el fundamento de la separación y fuerzas
que intervienen. Justifique si la fase móvil es o no interactiva.
14) Describir las características generales de las columnas cromatográficas usualmente empleadas en
HPLC y los distintos tipos de rellenos.
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CROMATOGRAFIA PLANAR
La cromatografía plana tiene dos modalidades: capa delgada y papel. En la primera, la
separación se produce sobre un sólido finamente dividido que se ha fijado sobre una superficie plana.
La sustancia que más se utiliza como adsorbente es el gel de sílice que puede funcionar a veces como
soporte para el agua u otros disolventes polares en las separaciones líquido – líquido. Pero si se seca
en una estufa, la capa de gel de sílice pierde la humedad, su superficie resulta predominantemente
sólida y sirve como adsorbente en las separaciones líquido – sólido.
En el caso de cromatografía en papel se utilizan papeles de alta pureza y características
reproducibles de porosidad y grosor. Estos papeles contienen suficiente agua retenida, de manera que
la cromatografía de papel se puede clasificar como una cromatografía de tipo líquido – líquido. Es
posible hacer que otros líquidos reemplacen al agua, proporcionando un tipo diferente de fase
estacionaria y originando una cromatografía en papel de fase reversa en donde la fase móvil sea un
solvente polar.
También existen en el comercio papeles que tienen un adsorbente o una resina de intercambio
iónico que permite realizar cromatografía en papel de adsorción o de intercambio iónico,
respectivamente.
La siguiente figura es el esquema de una placa de cromatografía en capa delgada donde se
indican las distancias recorridas por uno de los sustratos (a) y por el solvente (b) a partir de la línea
de siembra.
Frente del
solvente
a
Origen o
línea de
siembra
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CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA
La fase estacionaria está constituida por una capa de adsorbente finamente dividido extendido
sobre una placa de vidrio o de plástico. El sustrato a analizar se siembra cerca del borde inferior de la
placa, la cual se sumerge en una cámara que contiene el disolvente de desarrollo, que a la vez puede
ser el revelador, y que constituye la fase móvil.
El solvente asciende por capilaridad, arrastrando al sustrato. Antes de que el líquido llegue al
borde superior se retira la placa y se marca la posición alcanzada por el frente de solvente. Se señala
la posición de la mancha y se calcula el parámetro Rf .
Rf = distancia recorrida por el sustrato/ distancia recorrida por el frente de solvente
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CELULOSA: Se usa sólo cuando los compuestos a separar se unen muy fuertemente a la alúmina o
al silicagel (compuestos muy hidrofílicos).
Fase móvil
La función de la fase móvil es desplazar al soluto de la fase estacionaria, de manera de
correrlo a través de la placa. Ayuda a separar una mezcla de solutos de modo que cada uno quede
detenido en distintos puntos de la placa.
La efectividad de un solvente de desplazar al soluto del adsorbente se denomina “poder de
elución”. Está asociado con la función llamada parámetro de fuerza del disolvente o coeficiente
eluotrópico que es la energía de adsorción por unidad de área de un adsorbente patrón. Así, un mayor
coeficiente eluotrópico, , implica una interacción más fuerte del disolvente con la superficie del
adsorbente y las moléculas de soluto son desplazadas hacia mayores Rf.
La fuerza de los solventes da lugar a una serie eluotrópica.
Cuando se cambia el adsorbente, el coeficiente eluotrópico del solvente cambia también. El
coeficiente eluotrópico se define en términos de atracción solvente/ adsorbente.
Existe un equilibrio entre solvente, soluto (muestra) y adsorbente, en donde el solvente
compite con el soluto por los sitios activos de la fase estacionaria. Pero no solamente debe tenerse en
cuenta la relación entre el tipo de adsorbente usado y el disolvente o mezclas de disolventes que
determinan el coeficiente eluotrópico, sino también la relación entre la naturaleza química del soluto
o muestra y la del disolvente. Todo ello contribuye a la determinación del Rf y a la calidad de la
resolución en la separación de los componentes de la muestra. Puede ocurrir que dos disolventes
diferentes tengan, para el adsorbente dado, el mismo coeficiente eluotrópico, pero los valores de Rf y
la resolución serán mejores en un caso que en otro, considerando la naturaleza química de los
constituyentes de la muestra y su relación con el disolvente. Se elige en este caso el disolvente que de
mejores Rf y resoluciones.
Muestra
La interacción de la muestra y el absorbente se puede establecer de diferentes modos: mediante
fuerzas de Van der Waals para moléculas neutras; unión dipolo para solutos que tiene un grupo polar
C-Cl o C-NO2, siendo esta interacción más importante en la alúmina; puente hidrógeno entre el
soluto y la sílice en la que los grupos silanos actúan como dador o aceptor de protones; o por una
unión química más que física, de tipo covalente. Se denomina quimiosorción. Se presenta para
algunos ácidos carboxílicos y cetonas.
Cantidad de muestra
Conviene siempre sembrar poca cantidad de muestra. Cuando se usa mucha cantidad de
muestra surge un efecto denominado 'en cola'.
Es preferible secar entre aplicación y aplicación para eliminar el exceso de solvente, de lo
contrario aparecen anillos de muestra.
Resolución
Rs = X / 0.5 (d1 + d2)
donde X es la distancia entre dos manchas, y d1 y d2 sus diámetros promedios .
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Se considera una buena separación cuando Rs es igual a 1. La resolución se puede modificar
aumentando X, respetando el pero cambiando la naturaleza del o de los solventes, o disminuyendo d
colocando menos cantidad de muestra.
Visualización
Métodos no destructivos:
- Radiación visible.
- Radiación ultravioleta (en algunos casos puede ser destructiva, por ejemplo ciertas vitaminas sufren
variación fotoquímica).
- Vapor de iodo (en algunos casos puede ser destructivo porque reacciona químicamente con la
muestra).
- Agua (salvo para ciertos ésteres que son hidrolizados).
Métodos destructivos: El revelador reacciona con la muestra para dar productos coloreados
(aminoácidos con ninhidrina), H2SO4.
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