INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS

PROTEOLÍTICAS. MÉTODO DE KUNITZ.

MÉTODOS DE ANÁLISIS
PROFESOR:
Q.F.I. FRANCISCO C. FERNÁNDEZ LÓPEZ

GRUPO : 4IM2
SECCIÓN : 2
OBJETIVOS

֎ Determinar el por qué se usa a la piña como un buen ablandador de carne.

֎ Determinar el comportamiento de proteasas como la Papaína y la Bromelaína.
֎ Comprobar que la Ley de Bouguer & Beer sólo es válida para ciertos límites de
concentración.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME

Curva de actividad enzimática

Complete la tabla 1

Tabla 1. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA TRIPSINA

Concentración de A280 A280
Tubo Tripsina (mg/mL) Problema Testigo corregida
T1 y 1 0.04 0.478 0.03 0.448
T2 y 2 0.08 0.511 0.014 0.497
T3 y 3 0.12 0.592 0.046 0.546
T4 y 4 0.16 0.6 0.033 0.567
T5 y 5 0.2 0.661 0.035 0.626

problemas
TI y I Bromelaína 1:10 0.806 0.332 0.474
TII y II Bromelaína 1:20 0.48 0.119 0.361
TIII Y III Papaína: 1:2 0.602 0.146 0.456
TIV Y IV Papaína: 1:4 0.533 0.243 0.29

Construir la curva de actividad enzimática de la tripsina (gráfica 1), colocando en el eje de las
ordenadas la absorbancia corregida a 280nm y en el eje de las abscisas la concentración de tirpsina
(mg/mL).
Absorbancia (nm) en función de la concentración de
Tripsina (mg/mL)
0.7

0.6

0.5
Absorbancia (nm)

0.4

0.3

0.2
y = 1.065x + 0.409
0.1 R² = 0.9851

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Tripsina (mg/mL)
 Ecuación de la recta:
𝑚𝑔
𝐴𝑏𝑠(𝑛𝑚) = 1.065 [ ] + 0.409𝑛𝑚
𝑚𝐿

𝑟 = 0.9925

Actividad específica de la Tripsina

Un método más general para conocer la actividad de las enzimas proteolíticas, es calcular la
actividad específica de la Tripsina y hacer otro gráfico de la curva de actividad enzimática de la
tripsina en términos de la absorbancia vs unidades trípticas. La unidad tríptica se define como:
LA CANTIDAD DE ENZIMA QUE ORIGINA, BAJO LAS CONDICIONES EXPERIMENTALES
DESCRITAS, UN AUMENTO DE UNA UNIDAD DE ABSORBANCIA A 280nm, POR MINUTO DE
DIGESTIÓN.

a) ¿Cuántas unidades trípticas hay por miligramo de tripsina? Incluya los cálculos.

𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑡𝑎
𝑓ó𝑟𝑚𝑢𝑙𝑎: (𝑈𝑇)𝑐𝑎𝑠
𝑚𝑔 =
20

1.065
𝑠𝑢𝑠𝑡𝑖𝑡𝑢𝑐𝑖ó𝑛: (𝑈𝑇)𝑐𝑎𝑠
𝑚𝑔 =
20

𝑟𝑒𝑠𝑢𝑙𝑡𝑎𝑑𝑜: (𝑈𝑇)𝑐𝑎𝑠 𝑈𝑇⁄

𝑚𝑔 = 0.05325 𝑚𝑔

b) Curva de actividad enzimática específica

Complete la tabla 2

Tabla 2. CURVA DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ESPECÍFICA PARA LA DIGESTIÓN DE

CASEÍNA POR TRIPSINA

Unidades A280
Tubo
trípticas corregida
1 0.00213 0.448
2 0.00426 0.497
3 0.00639 0.546
4 0.00852 0.567
5 0.01065 0.626
Haga el gráfico de actividad enzimática específica, colocando en las ordenadas la A 280 corregida y
en las abscisas las unidades trípticas (gráfica 2).

Absorbancia (nm) en función de las UT (UT/mg)

0.7

0.6

0.5
Abs (nm)

0.4

0.3
y = 20x + 0.409
R² = 0.9851
0.2

0.1

0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014
UT (UT/mg)

Bromelaína 1:10 Papaína 1:2 Linear (Tendencia)

a) Indique la actividad específica, en unidades trípticas por gramo de muestra, de la piña

(bromelaína) y la papaya (papaína). Incluya cálculos.
Se pesaron 25g de piña con un volumen de 39mL de agua.
Unidades A280
Problema
trípticas corregida
0.003255 0.474 Bromelaína 1:10

25𝑔 𝑔
= 0.6410 ⁄𝑚𝐿
39𝑚𝐿

 Concentración final de Bromelaína 1:10

0.06410g/mL

𝟎. 𝟎𝟎𝟑𝟐𝟓𝟓𝑼𝑻
𝟏. 𝟎𝒈| 𝒈 = 𝟎. 𝟎𝟓𝟎𝟖𝑼𝑻/𝒈
𝟎. 𝟎𝟔𝟒𝟏 𝒎𝑳

Se pesaron 25g de papaya con un volumen de 41mL de agua.

Unidades A280
Problema
trípticas corregida
0.00235 0.456 Papaína 1:2

25𝑔 𝑔
= 0.6098 ⁄𝑚𝐿
41𝑚𝐿

 Concentración final de Papaína 1:10

0.06098g/mL

𝟎. 𝟎𝟎𝟑𝟐𝟓𝑼𝑻
𝟏. 𝟎𝒈| 𝒈 = 𝟎. 𝟎𝟑𝟖𝟓𝑼𝑻/𝒈
𝟎. 𝟎𝟔𝟎𝟗𝟖 𝒎𝑳

PREGUNTAS ADICIONALES

a) Defina actividad enzimática y actividad enzimática específica.

La actividad enzimática son los micromoles (μmol) de sustrato convertidos en producto por minuto,
en determinadas condiciones de ensayo especificadas.
La actividad enzimática específica de una preparación enzimática específica se define como el
número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg)

b) Escriba la clasificación de las proteasas, en función de su mecanismo de acción y

diga en qué grupo se ubican las determinadas en la práctica.
Clasificación de las proteasas según su mecanismo de acción:
֎ Serina proteasas
֎ Cisteína proteasas
֎ Metaloproteasas
֎ Aspártico proteasas
֎ Treonina proteasas
֎ Glutámico proteasas

La papaína se clasifica en las Cisteína proteasas, a su vez, la bromelaína se encuentra en

la misma clasificación de Cisteína proteasas.

c) ¿Para qué se adiciona cisteína en las muestras de piña, y papaya? (Ver preparación
de reactivos)
Para mantener las condiciones reductoras en el medio (-SH), lo cual implica evitar la
inhibición de la actividad catalítica.

d) ¿Cuál es la especificidad de enlace de la tripsina?

La cisteína hidroliza específicamente los péptidos que contienen grupos cargados de
arginina o lisina.

DISCUSIÓN
La curva de actividad enzimática de tripsina mostrada anteriormente presenta un comportamiento
lineal, lo cual implica que los analistas trabajaron de manera exacta y precisa, colocando las
cantidades adecuadas de reactivos y llevando a cabo los procesos de agitación de manera uniforme
y adecuada. El tener una curva con este comportamiento, permitirá que los datos obtenidos a partir
de la interpolación de nuestra curva sean veraces y confiables.

La preparación de tubos testigo para cada tubo problema se realizó con el fin de determinar la
actividad enzimática sin interferencia de aminoácidos libres (Absorbancia problema – Absorbancia
testigo). Se llevó a cabo esta acción con el fin de restar las absorbancias generadas por
aminoácidos ya libres en las muestras problema, es decir, que no fueron liberados a partir de la
hidrólisis.

Los valores de UT obtenidos de la Bromelaína 1:20 y Tripsina 1:4 resultaron negativos, los cuales
pueden ser interpretados como valores que no se encuentran dentro de los límites de la Ley de
Bouguer & Beer, estos límites corresponden a concentraciones entre 0.04 a 0.20mg/mL de enzima
con 0.448 y 0.626nm de absorbancia respectivamente.
Una de las alternativas que se proponen para poder medir la absorbancia de las muestras (de
Bromelaína 1:20 y Tripsina 1:4) es aumentar el paso de luz o, lo que es lo mismo, aumentar el
tamaño de la celda para espectrofotómetro con el fin de aumentar la lectura de absorbancia en la
muestra; otra alternativa un poco menos común es el evaporar el medio líquido de nuestra muestra
con el fin de aumentar su concentración.

La cantidad de las Unidades Tripticas por gramo de muestra de la Bromelaína fue de 𝟎. 𝟎𝟓𝟎𝟖𝑼𝑻/𝒈
y la de la Papaína de 𝟎. 𝟎𝟑𝟖𝟓𝑼𝑻/𝒈, lo cual puede ser interpretado de la siguiente manera:
Las unidades trípticas son la cantidad de enzima que genera un aumento de una unidad de
absorbancia a 280nm, por minuto de digestión; un aumento en la absorbancia implica una mayor
cantidad de aminoácidos y péptidos libres generados por la actividad enzimática, con base en esto
podemos argumentar el que la piña (la cual contiene a la enzima Bromelaína) sea utilizada como
un buen ablandador de la carne, por encima de la papaya (que contiene a la enzima Papaína) ya
que puede deshacer a las proteínas de forma más eficiente que la Papaína.

CONCLUSIONES
 La Bromelaína es una proteasa que degrada proteínas mejor que la Papaína.
 Las proteasas son enzimas que catalizan reacciones de hidrólisis en donde se liberan
aminoácidos y péptidos.
 Cuando una muestra se encuentra muy diluida, su comportamiento no seguirá a la Ley de
Bouguer & Beer.

BIBLIOGRAFÍA

- Voet, J., Pratt, C. Fundamentals of Biochemistry. Life at the Molecular Level, 4ª. Ed., New Jersey:
John Wiley & Sons, Inc., 2013, pp. 440, 493
- Demain, A. L. “Microbial Enzymes: Tools for Biotechnological Processes”, Biomolecules, 2014,
4, pp. 117-139.
- María José Noriega Borge. (2000). Principios de Bioquímica. 1ª Edición. Barcelona. Editorial
Masson.